腦心通膠囊“心腦同治”的免疫和炎癥標(biāo)志物研究

尚津鋒，焦家康，路穎慧，閆明雪，王璟邑，理扎·沙布爾江，崔一然，劉 欣*

1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 102488

2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院藥學(xué)部，北京 100010

心腦血管疾病屬于常見(jiàn)的慢性病范疇，多發(fā)于中、老年人群，近年來(lái)發(fā)病有年輕化的趨勢(shì)，具有發(fā)病隱匿、病因復(fù)雜等特點(diǎn)，常造成心、腦、腎等多個(gè)靶器官的結(jié)構(gòu)或功能損害，嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康[1-2]。目前，我國(guó)心血管疾病的年齡標(biāo)準(zhǔn)化患病率總體增加，缺血性心臟病和缺血性卒中的發(fā)病率也顯著增加[3]?？傊?，心腦血管疾病的發(fā)病率與致死率均有明顯的上升趨勢(shì)。人是復(fù)雜的生物體，胚胎時(shí)期心和腦同時(shí)發(fā)育，因此在生理或病理狀態(tài)下，各器官發(fā)育和損傷是相互關(guān)聯(lián)的，心和腦之間尤為明顯[4]。近年來(lái)，隨著心腦研究不斷深入，神經(jīng)心臟病學(xué)興起，研究心臟和大腦互相損傷成為熱點(diǎn)話(huà)題[5]。臨床和實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明，腦損傷和心臟功能障礙之間存在因果關(guān)系。比如，腦梗死后心律失常不僅是急性期致死的主要原因，還是中后期預(yù)后不良的先兆，有效防止腦梗死后心律失常是改善預(yù)后的關(guān)鍵[6]。故在不同病理狀態(tài)同一機(jī)體條件下研究腦、心同治，更接近疾病本質(zhì)[7]。以此為基礎(chǔ)，辨識(shí)和確認(rèn)腦、心共同的失衡特定分子機(jī)制，是“心腦同治”的關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題之一。

基于“心腦同治”理念，腦心軸（神經(jīng)系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)之間的雙向串?dāng)_）的研究越來(lái)越多[8]。而主要負(fù)責(zé)學(xué)習(xí)和記憶的海馬在調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)之間的雙向串?dāng)_中起著關(guān)鍵作用[9]。由于腦心軸的雙向性，神經(jīng)系統(tǒng)疾病導(dǎo)致海馬神經(jīng)元死亡，同時(shí)心血管疾病也伴隨著海馬損傷[10]。從大腦海馬的角度，研究心腦相互作用機(jī)制具有重要意義。此外，先天免疫細(xì)胞與動(dòng)脈粥樣硬化的缺血性并發(fā)癥密切相關(guān)，從先天免疫系統(tǒng)角度有助于研究缺血性腦卒中、心肌梗死等缺血性損傷[11-12]。因此，免疫和炎癥是“心腦同治”的生物學(xué)基礎(chǔ)之一，研究關(guān)鍵靶點(diǎn)作為免疫和炎癥標(biāo)志物，有助于深入闡明心腦血管疾病的發(fā)病機(jī)制。本研究結(jié)合前期研究基礎(chǔ)，基于大鼠心肌缺血模型和腦缺血模型，驗(yàn)證腦心通膠囊“心腦同治”作用。同時(shí)，以海馬為切入點(diǎn)，預(yù)測(cè)并驗(yàn)證大腦海馬中“心腦互損”“心腦同治”的免疫和炎癥標(biāo)志物。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF 級(jí)雄性SD 大鼠，體質(zhì)量（260±10）g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)SCXK（京）2018-0001。動(dòng)物于室溫22～25 ℃、相對(duì)濕度50%～60%、12 h 明暗交替環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)由北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)術(shù)委員會(huì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理分委員會(huì)進(jìn)行倫理審批（批準(zhǔn)號(hào)BUCM-4-2022032201-1048）。

1.2 藥品與試劑

腦心通膠囊（批號(hào)211258）購(gòu)自陜西步長(zhǎng)制藥有限公司，水合氯醛（批號(hào)K2125780）購(gòu)自阿拉丁生化科技股份有限公司；卡托普利（批號(hào)2109052）購(gòu)自輔仁藥業(yè)集團(tuán)有限公司；銀杏提取物（批號(hào)6280219）購(gòu)自德國(guó)威瑪舒培博士藥廠(chǎng)；2,3,5-三苯基氯化四氮唑（2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride，TTC）磷酸緩沖液（批號(hào)01223Z031）、蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色試劑盒（批號(hào)20220307）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；戊二醛固定液（批號(hào)C13397109）購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司；812 包埋劑（批號(hào)90529-77-4）購(gòu)自SPI 公司；蛋白定量染液（批號(hào)WC320333）購(gòu)自北京華興博創(chuàng)生物技術(shù)中心；二硫蘇糖醇（批號(hào)2923C501）、碘代乙酰胺（批號(hào)0736C278）購(gòu)自美國(guó)Amresco 公司；胰蛋白酶（批號(hào)0000490995）購(gòu)自美國(guó)Promega 公司；乙腈（批號(hào)0000221770）購(gòu)自美國(guó)J.T.Baker 公司；甲酸（批號(hào)BCBM11920）購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich 公司；RNA 提取試劑盒（批號(hào)017E211JA）購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；qRT-PCR 單鏈合成試劑盒（批號(hào)Q10923）、染料法熒光定量預(yù)混試劑（批號(hào)Q30716）購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)股份有限公司；蛋白預(yù)制膠（批號(hào)2022C0GT202107）、快速封閉液（批號(hào)20220916）購(gòu)自蘇州新賽美生物科技有限公司；聚偏二氟乙烯膜（批號(hào)K5CA1684L）、快速電轉(zhuǎn)液（批號(hào)20230203）購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad 公司；β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）抗體（批號(hào)4970S-18/19）購(gòu)自美國(guó)CST 公司；Toll 樣受體2（toll-like receptor 2，TLR2）抗體（批號(hào)1092471）、Toll 樣受體9（Toll-like receptor 9，TLR9）抗體（批號(hào)5878610）、α-干擾素（interferon-α，IFN-α）抗體（批號(hào)9591070）均購(gòu)自Affinity 公司；TLR4 抗體（批號(hào)10005089）、TLR7 抗體（批號(hào)00087567）均購(gòu)自美國(guó)Proteintech 公司；干擾素調(diào)節(jié)因子3（interferon regulatory factor-3，IRF3）抗體（批號(hào)BA12138785）、IRF7 抗體（批號(hào)AI08126969）均購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）抗體（批號(hào)GR3359225-3）購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司。

1.3 儀器

MADLAB-4C/501H 型多功能生理信號(hào)采集記錄儀（北京眾實(shí)迪創(chuàng)科技發(fā)展有限公司）；XR220 Pluse 型全自動(dòng)生化分析儀（新銳醫(yī)療設(shè)備有限公司）；HT7800/HT7700 型透射電鏡（日本Hitachi 公司）；SThermo Scientic Easy nLC 1000 system 型高效液相色譜系統(tǒng)、Orbitrap Fusion Lumos 型質(zhì)譜系統(tǒng)（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）；CFX96 型實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀、powerpac basic041BR326356 型電泳儀電源、ChemiDoc MP imaging system 型化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad 公司）；TS-2000A 型脫色搖床（海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司）。

2 方法

2.1 心肌缺血和腦缺血模型的制備

2.1.1 心肌缺血模型的制備 采用結(jié)扎左前降支冠狀動(dòng)脈（left anterior descending coronary artery ligation，LAD）模型為心肌缺血模型。開(kāi)胸暴露心臟，從左心耳下方入針，將左心耳和肺動(dòng)脈圓錐的交界和心尖連線(xiàn)上作為縫扎的中點(diǎn)，縫扎的方向平行于左心耳的邊緣。除假手術(shù)組外，其余各組大鼠均進(jìn)行LAD，結(jié)扎后可見(jiàn)下方大面積心肌表面顏色變?yōu)樯n白，室壁運(yùn)動(dòng)明顯減弱。假手術(shù)組只穿線(xiàn)不結(jié)扎，其余操作和模型組相同。

2.1.2 腦缺血模型的制備 采用大腦中動(dòng)脈阻塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型為腦缺血模型。各組大鼠ip 10%水合氯醛（350 mg/kg）麻醉，MCAO 模型組分離頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈，插入線(xiàn)栓，至標(biāo)記進(jìn)入頸內(nèi)動(dòng)脈與頸總動(dòng)脈分叉處，術(shù)后保溫。假手術(shù)組除不插線(xiàn)栓外，其余與模型組大鼠操作一致。

2.2 分組與給藥

根據(jù)前期研究基礎(chǔ)，篩選出LAD 造模14 d 是心損及腦的關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)，MCAO 造模1 d 是腦損及心的關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)[13-14]。將120 只大鼠隨機(jī)分為8 組，每組15 只，包括研究心肌缺血的假手術(shù)組、LAD模型組、腦心通（110 mg/kg）組和卡托普利（10.125 mg/kg）組，以及研究腦缺血的假手術(shù)組、MCAO 模型組、腦心通（220 mg/kg）組和銀杏提取物（50 mg/kg）組。其中，用于心肌缺血研究的模型組、腦心通組和卡托普利組均進(jìn)行心肌缺血造模，用于腦缺血的模型組、腦心通組和銀杏提取物組進(jìn)行腦缺血造模。腦心通和陽(yáng)性藥劑量由前期實(shí)驗(yàn)研究確定。所有動(dòng)物每天8: 00 和20: 00 時(shí)各ig 給藥1 次，持續(xù)最佳天數(shù)，最佳天數(shù)的第2 天7: 00 時(shí)ig 給藥1 h后造模，假手術(shù)組和模型組大鼠灌胃空白溶劑。

2.3 藥效學(xué)指標(biāo)

2.3.1 心電圖檢測(cè) 在進(jìn)行整體實(shí)驗(yàn)前，檢測(cè)所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的心臟功能，以保證所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的心臟功能在實(shí)驗(yàn)前均正常。將大鼠麻醉后，用多功能生理信號(hào)采集記錄儀采集心電圖。

2.3.2 心肌酶譜測(cè)定 麻醉大鼠，進(jìn)行腹主動(dòng)脈取血，3 000 r/min 離心15 min，分離出血清，使用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清中心肌酶天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）的活性。

2.3.3 神經(jīng)功能評(píng)分評(píng)價(jià)神經(jīng)功能 造模后應(yīng)用盲法對(duì)大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分。神經(jīng)功能評(píng)分采用Bederson 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)。0 分：無(wú)神經(jīng)損傷癥狀；1 分：懸尾實(shí)驗(yàn)不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪；2 分：前肢抵抗對(duì)側(cè)推力能力下降；3 分：向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈。

2.3.4 腦組織含水率測(cè)定 斷頭處死大鼠，迅速取腦，采用干-濕質(zhì)量法測(cè)定腦含水率。將腦組織立即稱(chēng)定質(zhì)量得濕質(zhì)量；然后將鋁箔包好的腦組織烘干24 h，恢復(fù)到室溫后稱(chēng)定質(zhì)量得干質(zhì)量，計(jì)算腦組織含水率。

腦組織含水率＝(濕質(zhì)量－干質(zhì)量)/濕質(zhì)量

2.3.5 TTC 法測(cè)定梗死率 大鼠斷頭處死，取心臟做2 mm 冠狀切片，在2% TTC 磷酸緩沖液中染色，置于10%中性甲醛內(nèi)固定后整齊排列，掃描正反面。利用Image J 軟件測(cè)量紅、白區(qū)域的面積，計(jì)算心梗死率。

心梗死率＝心梗死組織體積/總心體積

大鼠斷頭處死，取全腦做2 mm 冠狀切片，在2% TTC 磷酸緩沖液中染色，置于4%多聚甲醛內(nèi)固定后整齊排列，掃描腦片正反面。利用Image J 軟件測(cè)量紅、白區(qū)域的面積，計(jì)算腦梗死率。

腦梗死率＝腦梗死組織體積/總腦體積

2.3.6 HE 染色觀(guān)察病理變化 按照HE 染色試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，取心肌組織和腦海馬組織，經(jīng)過(guò)脫蠟、染色、脫水、透明、固封等步驟進(jìn)行HE 染色，并用透射電鏡觀(guān)察病理改變。

2.3.7 透射電子顯微鏡觀(guān)察線(xiàn)粒體變化 麻醉大鼠后，進(jìn)行0.9%氯化鈉溶液灌注，灌注后取1 mm3心室左下方心肌組織或大腦海馬組織經(jīng)固定、室溫脫水、滲透包埋、聚合、超薄切片、染色，置于透射電鏡下觀(guān)察心肌細(xì)胞或海馬神經(jīng)元的線(xiàn)粒體形態(tài)。

2.4 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)免疫炎癥標(biāo)志物

腦心通由黃芪、赤芍、丹參、當(dāng)歸、川芎、桃仁、紅花、乳香、沒(méi)藥、雞血藤、牛膝、桂枝、桑枝、地龍、全蝎、水蛭共16 味中藥組成。本草組鑒（HERB）數(shù)據(jù)庫(kù)（http://herb.ac.cn/）是集高通量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和參考文獻(xiàn)于一體的天然藥物數(shù)據(jù)庫(kù)平臺(tái)，包含SymMap、TCMID 2.0、TCMSP 2.3 等多種數(shù)據(jù)庫(kù)，提供中藥材、中藥有效成分、靶基因、疾病、高通量實(shí)驗(yàn)和參考挖掘數(shù)據(jù)等瀏覽、搜索、查看、下載等功能[15]。本研究運(yùn)用HERB 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索腦心通所含中藥的靶點(diǎn)，運(yùn)用Genecards 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.genecards.org/）[16]、TTD 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://db.idrblab.net/ttd/）[17]獲取腦缺血和心肌缺血的靶點(diǎn)。利用Venny工具對(duì)腦心通、心肌缺血、腦缺血3 個(gè)靶點(diǎn)集取交集，從而獲取腦心通“心腦同治”靶點(diǎn)。運(yùn)用STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)[18]和Cytoscape3.8.0 的cytoHubba 插件[19]構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)并分析核心靶點(diǎn)，最終對(duì)核心靶點(diǎn)進(jìn)行京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析。

2.5 蛋白質(zhì)組學(xué)篩選差異表達(dá)蛋白

從各組心肌組織和腦組織中提取蛋白質(zhì)并進(jìn)行蛋白定量、酶切和脫鹽。通過(guò)高效液相色譜系統(tǒng)進(jìn)行梯度洗脫、蛋白質(zhì)分析，組分凍干后以20 μL 2%甲醇-0.1%甲酸復(fù)溶，離心，吸取上清采用夾心上樣法按10 μL 上樣體積進(jìn)行上樣處理，Loading Pump體積流量設(shè)置為300 nL/min，上樣15 min；上樣后按分離體積流量600 nL/min 進(jìn)行分流。液相分析條件：流動(dòng)相A 為0.1%甲酸水溶液，B 為80%乙腈-0.1%甲酸，加載泵體積流量設(shè)定為300 nL/min。加載樣品15 min；分離體積流量設(shè)定為600 nL/min，梯度洗脫：0～8 min，5%～10% B；8～58 min，10%～24% B；58～70 min，24%～32% B；70～71 min，32%～95% B；71～78 min，95% B。質(zhì)譜分析條件：Nanospray Flex（NSI）離子源，離子噴霧電壓為2.0 kV，離子傳輸管溫度為320 ℃，質(zhì)譜全掃描范圍為m/z300～1 400；一級(jí)質(zhì)譜分辨率設(shè)為120 000，最大增益控制（automatic gain control target，AGC）為5×105，最大注入時(shí)間為50 ms；二級(jí)質(zhì)譜分辨率設(shè)為15 000，AGC 為5×103，最大注入時(shí)間為35 ms。以P＜0.05、差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）≥1.2 為標(biāo)準(zhǔn)，篩選心肌組織和腦組織中的差異表達(dá)蛋白。

2.6 qRT-PCR 檢測(cè)IFN-α、IRF3、IRF7、TLR2、TLR4、TLR7、TLR9 和TNF-α 的mRNA 表達(dá)

根據(jù)預(yù)測(cè)和蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果，采用qRT-PCR 檢測(cè)關(guān)鍵靶點(diǎn)的mRNA 表達(dá)量。利用RNA 提取試劑盒提取大鼠海馬組織總RNA。參照單鏈合成試劑盒說(shuō)明書(shū)合成第一鏈cDNA，以cDNA 為模板進(jìn)行qRT-PCR，體系20 μL，擴(kuò)增條件為94 ℃預(yù)變性1 min，94 ℃變性5 s，50～60 ℃退火15 s，72 ℃延伸10 s，共40 個(gè)循環(huán)。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（ glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）為內(nèi)參，按2?ΔΔCt法計(jì)算IFN-α、IRF3、IRF7、TLR2、TLR4、TLR7、TLR9、TNF-α的mRNA相對(duì)表達(dá)水平。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

2.7 Western blotting 檢測(cè)IFN-α、IRF3、IRF7、TLR2、TLR4、TLR7、TLR9 和TNF-α 蛋白表達(dá)

根據(jù)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)和蛋白質(zhì)組學(xué)研究，采用Western blotting 對(duì)關(guān)鍵的免疫炎癥相關(guān)蛋白進(jìn)行驗(yàn)證。將大鼠的大腦海馬勻漿，提取核蛋白，離心取上清液，檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度，上樣、電泳、電轉(zhuǎn)、封閉后，用非標(biāo)記一抗及HRP 標(biāo)記的二抗對(duì)其進(jìn)行孵育、檢測(cè)。以β-actin 作為對(duì)照，用Image J 軟件計(jì)算IFN-α、IRF3、IRF7、TLR2、TLR4、TLR7、TLR9、TNF-α 蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用單因素方差分析中最小顯著性差異法進(jìn)行多組比較。對(duì)于非正態(tài)數(shù)據(jù)采用非參數(shù)分析。圖表使用GraphPad Prism 8 軟件生成，數(shù)據(jù)以±s表示。

3 結(jié)果

3.1 腦心通膠囊改善LAD 大鼠的心臟和腦損傷

如圖1 所示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠的心梗死率及血清AST、LDH 活性均顯著升高（P＜0.01），心電圖出現(xiàn)明顯的病理改變，說(shuō)明LAD 大鼠心臟出現(xiàn)損傷；與模型組比較，腦心通組和卡托普利組大鼠心梗死率和血清心肌酶活性均顯著降低（P＜0.01），且心肌組織損傷減少、線(xiàn)粒體損傷減輕。如圖2 所示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠的海馬組織出現(xiàn)部分病理改變，神經(jīng)元數(shù)量減少，線(xiàn)粒體體積增大，線(xiàn)粒體嵴數(shù)量減少，腦含水率升高（P＜0.05）；與模型組比較，腦心通組和卡托普利組海馬組織神經(jīng)元的病理學(xué)改變減少，腦組織水腫減輕。

圖1 心肌缺血狀態(tài)下各組大鼠的心梗死率 (A)、心電圖 (B)、心肌酶譜 (C)、心肌組織HE 染色 (D) 和超微結(jié)構(gòu) (E)(±s , n = 6)Fig.1 Myocardial infarction rate (A), electrocardiogram (B), myocardial enzyme spectrum (C), HE staining (D) and ultra microstructure (E) in myocardium of rats in each group under myocardial ischemia (±s , n = 6)

圖2 心肌缺血狀態(tài)下各組大鼠的腦海馬組織HE 染色 (A)、超微結(jié)構(gòu) (B) 和腦組織含水率 (C) (±s, n = 6)Fig.2 HE staining (A), ultra microstructure (B) of cerebral ehippocampus tissue and rate of water content in brain tissue(C) of rats in each group under myocardial ischemia (±s , n = 6)

3.2 腦心通膠囊改善MCAO 大鼠的腦和心臟損傷

如圖3 所示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦梗死率、神經(jīng)功能評(píng)分、腦組織含水率均顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，腦心通組大鼠腦梗死率、神經(jīng)功能評(píng)分、腦組織含水率均顯著降低（P＜0.05、0.01），且海馬CA1 區(qū)病理?yè)p傷明顯減少。與假手術(shù)組比較，模型組心電圖紊亂，心肌細(xì)胞排列稀疏，細(xì)胞間隙變大，細(xì)胞胞體皺縮，心肌纖維紊亂；與模型組比較，各給藥組大鼠的心電圖紊亂情況減少、心肌組織損傷減輕。

圖3 腦缺血狀態(tài)下各組大鼠的腦梗死率 (A)、神經(jīng)功能評(píng)分 (B)、腦組織含水率 (C)、腦組織HE 染色 (D) 和超微結(jié)構(gòu)(E) (±s , n = 6)Fig.3 Cerebral infarction rate (A), neural function score (B), rate of water content in brain tissue (C), HE staining (D) and ultra microstructure (E) in brain tissue of rats in each group under cerebral ischemia (±s , n = 6)

透射電鏡實(shí)驗(yàn)主要觀(guān)察心肌組織的肌節(jié)、肌纖維、線(xiàn)粒體形狀、線(xiàn)粒體嵴結(jié)構(gòu)、基質(zhì)密度等的變化情況。如圖4 所示，假手術(shù)組均未見(jiàn)異常，其肌節(jié)保持完整，肌纖維及線(xiàn)粒體均排列緊密，線(xiàn)粒體連續(xù)外膜明顯。與假手術(shù)組比較，造模1 d 后細(xì)胞內(nèi)線(xiàn)粒體出現(xiàn)腫脹，形成不規(guī)則空泡，嵴歪曲、斷裂，甚至溶解；與模型組比較，腦心通組線(xiàn)粒體腫脹、嵴歪曲、斷裂現(xiàn)象減少，有所改善。心肌酶譜結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清中AST、LDH 活性顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠血清中AST、LDH 活性顯著降低（P＜0.01）。

圖4 腦缺血狀態(tài)下各組大鼠的心電圖 (A)、心肌組織HE 染色 (B)、超微結(jié)構(gòu) (C) 和心肌酶譜 (D) (±s , n = 6)Fig.4 Electrocardiogram (A), HE staining (B), ultra microstructure (C) in myocardium and myocardial enzyme spectrum(D) of rats in each group under cerebral ischemia (±s , n = 6)

3.3 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)“心腦同治”的免疫和炎癥標(biāo)志物

如圖5 所示，運(yùn)用HERB 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索腦心通16味中藥的靶點(diǎn)，得到黃芪166 個(gè)靶點(diǎn)、赤芍75 個(gè)靶點(diǎn)、丹參173 個(gè)靶點(diǎn)、當(dāng)歸39 個(gè)靶點(diǎn)、川芎36 個(gè)靶點(diǎn)、桃仁24 個(gè)靶點(diǎn)、紅花142 個(gè)靶點(diǎn)、乳香58個(gè)靶點(diǎn)、沒(méi)藥204 個(gè)靶點(diǎn)、雞血藤91 個(gè)靶點(diǎn)、牛膝89 個(gè)靶點(diǎn)、桂枝519 個(gè)靶點(diǎn)、桑枝75 個(gè)靶點(diǎn)、全蝎7 個(gè)靶點(diǎn)、水蛭18 個(gè)靶點(diǎn)、地龍0 個(gè)靶點(diǎn)，去重得到腦心通939 個(gè)靶點(diǎn)。Genecards 數(shù)據(jù)庫(kù)得到心肌缺血656 個(gè)靶點(diǎn)、腦缺血771 個(gè)靶點(diǎn)，TTD 數(shù)據(jù)庫(kù)得到心肌缺血4 個(gè)靶點(diǎn)、腦缺血4 個(gè)靶點(diǎn)，去重得到心肌缺血657 個(gè)靶點(diǎn)、腦缺血773 個(gè)靶點(diǎn)。腦心通、心肌缺血、腦缺血的3 個(gè)靶點(diǎn)集合取交集，得到腦心通“心腦同治”的122 個(gè)靶點(diǎn)，導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)，cytoHubba 插件計(jì)算度值最高的前30 個(gè)靶點(diǎn)，進(jìn)行KEGG 富集分析，篩選P值最小的前 30 條通路。得到白細(xì)胞介素-17（interleukin-17，IL-17）信號(hào)通路、TNF 信號(hào)通路、Toll 樣受體信號(hào)通路、核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號(hào)通路4 條免疫炎癥相關(guān)通路，結(jié)合前期蛋白質(zhì)組學(xué)研究，不論是腦缺血狀態(tài)，還是心肌缺血狀態(tài)，Toll 樣受體相關(guān)蛋白在大腦和心臟中發(fā)揮重要作用，因此，選擇Toll 受體信號(hào)通路上的相關(guān)蛋白作為大腦海馬中“心腦同治”的蛋白標(biāo)志物。

圖5 腦心通膠囊“心腦同治”生物信息學(xué)分析的韋恩圖 (A)、PPI 網(wǎng)絡(luò) (B)、核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò) (C) 和KEGG 富集分析氣泡圖 (D)Fig.5 Venn diagram (A), PPI network (B), core target network (C) and KEGG enrichment bubble diagram (D) of “simultaneous treatment of heart and brain” bioinformatics analysis of Naoxintong Capsules

3.4 蛋白質(zhì)組學(xué)篩選腦心通膠囊“心腦同治”的免疫和炎癥標(biāo)志物

通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)研究腦心通組和模型組之間的差異表達(dá)蛋白，并對(duì)差異表達(dá)蛋白進(jìn)行KEGG 富集分析，選擇富集分?jǐn)?shù)最高的前20 個(gè)通路進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)圖6?；?4 d LAD 模型，在心肌組織中共檢測(cè)到1 625 種蛋白質(zhì)，腦心通組與模型組相比，共有116 個(gè)差異表達(dá)蛋白；在腦組織中檢測(cè)到2 966種蛋白質(zhì)，腦心通組與模型組相比，共有138 個(gè)差異表達(dá)蛋白。在心肌缺血狀態(tài)下，腦心通膠囊干預(yù)心肌組織和腦組織共有的信號(hào)通路為NOD 樣受體信號(hào)通路、視黃酸誘導(dǎo)基因蛋白-I（retinoic acid inducible gene-I，RIG-I）樣受體信號(hào)途徑和Toll 樣受體信號(hào)通路?；? d MCAO 模型，在腦組織中共檢測(cè)到2 952 種蛋白質(zhì)，腦心通組與模型組相比，共有134 個(gè)差異表達(dá)蛋白；在心肌組織中檢測(cè)到1 745 種蛋白質(zhì)，腦心通組與模型組相比，共有217 個(gè)差異表達(dá)蛋白。在腦缺血狀態(tài)下，絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號(hào)通路、磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信號(hào)通路和Toll 樣受體信號(hào)通路是腦心通膠囊干預(yù)腦組織和心肌組織的常見(jiàn)信號(hào)通路。因此，腦心通膠囊干預(yù)心肌缺血和腦缺血大鼠的心肌組織和腦組織共有通路是Toll 樣受體信號(hào)通路。Toll 樣受體信號(hào)通路的關(guān)鍵靶點(diǎn)可以作為腦心通膠囊“心腦同治”的免疫和炎癥標(biāo)志物。結(jié)合前期研究基礎(chǔ)，生物信息學(xué)預(yù)測(cè)以及蛋白質(zhì)組學(xué)篩選，IFN-α、IRF3、IRF7、TLR2、TLR4、TLR7、TLR9 和TNF-α 為T(mén)oll 樣受體信號(hào)通路的關(guān)鍵靶點(diǎn)，具有成為“心腦同治”免疫和炎癥標(biāo)志物的潛力。

圖6 腦心通膠囊治療LAD 和MCAO 大鼠的蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果 (n = 3)Fig.6 Proteomic results of Naoxintong Capsules in treatment of LAD and MCAO rats (n = 3)

3.5 qRT-PCR 檢測(cè)海馬中Toll 樣受體相關(guān)靶點(diǎn)的mRNA 表達(dá)水平

對(duì)IFN-α、IRF3、IRF7、TLR2、TLR4、TLR7、TLR9 和TNF-α 共8 個(gè)關(guān)鍵免疫和炎癥靶點(diǎn)進(jìn)行qRT-PCR 分析。如表2 所示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬IFN-α、IRF3、IRF7、TLR2、TLR4、TLR7、TLR9和TNF-α的mRNA 表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05、0.01）；與模型組比較，腦心通組上述靶點(diǎn)的mRNA 表達(dá)量顯著降低（P＜0.05、0.01）。結(jié)果表明，腦心通膠囊顯著降低LAD 大鼠和MCAO大鼠的海馬中IFN-α、IRF3、IRF7、TLR2、TLR4、TLR7、TLR9和TNF-α的mRNA 表達(dá)水平。

表2 心肌缺血和腦缺血大鼠的海馬中Toll 樣受體相關(guān)靶點(diǎn)的mRNA 表達(dá)水平 (±s, n = 3)Table 2 mRNA expression levels of Toll-like receptor related targets in hippocampus of rats with myocardial ischemia and cerebral ischemia (±s, n = 3)

表2 心肌缺血和腦缺血大鼠的海馬中Toll 樣受體相關(guān)靶點(diǎn)的mRNA 表達(dá)水平 (±s, n = 3)Table 2 mRNA expression levels of Toll-like receptor related targets in hippocampus of rats with myocardial ischemia and cerebral ischemia (±s, n = 3)

狀態(tài) 組別 劑量/(mg·kg?1)mRNA 相對(duì)表達(dá)量IFN-α IRF3 IRF7 TLR2 TLR4 TLR7 TLR9 TNF-α心肌缺血 假手術(shù) — 1.00±0.10 1.00±0.06 1.00±0.03 1.00±0.04 1.02±0.24 1.00±0.08 1.00±0.09 1.00±0.04模型 — 36.12±8.85** 19.59±0.96** 9.17±0.48** 5.14±1.16** 6.36±0.52** 7.52±2.15** 13.29±0.63** 18.58±1.23**腦心通 110 20.31±0.98## 6.38±0.29## 2.47±0.26## 3.58±0.43# 2.83±0.22## 3.02±0.26## 2.76±0.26## 1.00±0.13##腦缺血 假手術(shù) — 1.01±0.19 1.00±0.05 1.01±0.13 1.01±0.18 1.04±0.39 1.04±0.37 1.13±0.66 1.02±0.24模型 — 7.60±0.94** 1.79±0.58* 3.83±1.06** 3.16±0.49** 3.43±0.62** 3.03±1.21* 3.81±1.35* 4.40±0.04**腦心通 220 1.40±1.91## 0.60±0.17## 1.76±0.91# 1.73±0.11## 1.63±0.23## 1.42±0.11# 0.88±0.51## 3.05±0.71##

與假手術(shù)組比較：*P＜0.05 **P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01。*P < 0.05 **P < 0.01 vs sham group; #P < 0.05 ##P < 0.01 vs model group.

3.6 Western blotting 檢測(cè)海馬中Toll 樣受體相關(guān)靶點(diǎn)的蛋白表達(dá)水平

基于生物信息學(xué)和前期研究，對(duì)8 個(gè)關(guān)鍵免疫蛋白進(jìn)行Western blotting 分析。如圖7 所示，在心肌缺血狀態(tài)下，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬組織中IFN-α、IRF3、IRF7、TLR2、TLR4、TLR7、TLR9、TNF-α 蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，腦心通組IFN-α、IRF3、IRF7、TLR2、TLR4、TLR7、TLR9、TNF-α 蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05、0.01）。說(shuō)明在心肌缺血狀態(tài)下，腦心通膠囊顯著回調(diào)大腦海馬中IFN-α、IRF3、IRF7、TLR2、TLR4、TLR7、TLR9、TNF-α 共8 個(gè)蛋白的表達(dá)。

圖7 心肌缺血大鼠海馬的Toll 樣受體相關(guān)蛋白表達(dá)量 (±s , n = 3)Fig.7 Toll-like receptor-associated protein expression levels in hippocampus of rats with myocardial ischemia (±s , n = 3)

如圖8 所示，在腦缺血狀態(tài)下，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬組織中IFN-α、IRF3、IRF7、TLR2、TLR4、TLR7、TLR9、TNF-α 蛋白表達(dá)水平均顯著增加（P＜0.01）；與模型組比較，腦心通組IFN-α、TLR4、TLR7、TNF-α 蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05、0.01）。說(shuō)明在腦缺血狀態(tài)下，腦心通膠囊顯著回調(diào)大腦海馬中IFN-α、TLR4、TLR7、TNF-α 共4 個(gè)蛋白的表達(dá)。

圖8 腦缺血大鼠海馬的Toll 樣受體相關(guān)蛋白表達(dá)量 (±s, n = 3)Fig.8 Toll-like receptor-associated protein expression levels in hippocampus of rats with cerebral ischemia (±s , n = 3)

在心肌缺血和腦缺血2 種狀態(tài)下，IFN-α、TLR4、TLR7、TNF-α 共4 個(gè)靶點(diǎn)的mRNA 和蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著變化，表明大腦海馬中出現(xiàn)炎癥因子風(fēng)暴和免疫反應(yīng)瀑布，因此，大腦海馬中IFN-α、TLR4、TLR7、TNF-α 能夠作為“心腦互損”“心腦同治”的免疫和炎癥標(biāo)志物。

4 討論

隨著時(shí)間推移，全球居民心腦血管疾病的發(fā)病率不斷升高，心腦血管疾病成為影響健康和生命的危險(xiǎn)因素，加重了全球疾病負(fù)擔(dān)[20]。臨床上，壓力會(huì)影響心臟病患者預(yù)后，說(shuō)明心血管疾病中具備腦心聯(lián)系[21]。急性缺血性卒中患者會(huì)發(fā)生心腦串?dāng)_，涉及的腸道菌群失調(diào)和炎癥反應(yīng)等機(jī)制已得到初步驗(yàn)證[22]。依托大鼠的LAD 和MCAO 模型，本研究進(jìn)行多時(shí)間點(diǎn)的“心腦互損”研究。心肌缺血損傷導(dǎo)致心電圖、心肌梗死體積的顯著變化，同時(shí)腦組織發(fā)生病理變化，含水率增加，證明心損及腦。腦缺血損傷導(dǎo)致腦梗死體積、神經(jīng)功能評(píng)分、含水率顯著提高，同時(shí)心肌組織發(fā)生病理變化，心肌酶譜數(shù)據(jù)發(fā)生變化，證實(shí)腦損及心。目前，大多數(shù)藥理學(xué)研究均為單模型、單時(shí)間點(diǎn)研究，但臨床心腦疾病大多隨時(shí)間變化。本課題組前期研究顯示，在體內(nèi)，心肌缺血14 d 和腦缺血1 d 被認(rèn)為是心腦相互損傷的臨界時(shí)間點(diǎn)。LAD 模型大鼠腦損傷的時(shí)間點(diǎn)相對(duì)較晚，相比之下，MCAO 大鼠損傷心臟的時(shí)間更短。這表明“心腦互損”的嚴(yán)重程度受時(shí)間影響。

在心腦血管系統(tǒng)疾病中，炎癥和免疫不可或缺。本研究顯示，心肌缺血大鼠的大腦出現(xiàn)水腫，同時(shí)MCAO 大鼠的腦水腫率增加，其心肌組織也出現(xiàn)病理改變，表明LAD 和MCAO 大鼠產(chǎn)生免疫和炎癥反應(yīng)。免疫炎癥反應(yīng)參與動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病等多種心血管疾病，其中，心肌缺血可能涉及或平行于先天免疫反應(yīng)的信號(hào)傳導(dǎo)[23-24]。急性心肌梗死引發(fā)局部炎癥組織反應(yīng)和神經(jīng)炎癥，決定患者預(yù)后。免疫激活可能使心臟和大腦功能障礙相互關(guān)聯(lián)，為“心腦同治”提供生物信號(hào)基礎(chǔ)[25]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)之間的交流位于神經(jīng)免疫軸的核心。缺血性腦損傷會(huì)帶來(lái)神經(jīng)炎癥，導(dǎo)致細(xì)胞死亡、心臟損傷。免疫介質(zhì)是促炎的信號(hào)來(lái)源，促進(jìn)多種炎癥細(xì)胞類(lèi)型在受感染區(qū)域內(nèi)的滲透。心肌梗塞、感染性心內(nèi)膜炎都是心源性卒中的危險(xiǎn)因素[26]。臨床上，較高水平的炎癥標(biāo)志物與缺血性卒中后較差預(yù)后相關(guān)[27]。上述證據(jù)表明，心肌缺血和缺血性腦卒中伴有炎癥浸潤(rùn)和免疫激活。此外，心臟和脾臟介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)可能導(dǎo)致腦缺血誘導(dǎo)的急性和慢性心臟功能障礙和病理性心臟重塑[28]，進(jìn)一步說(shuō)明免疫反應(yīng)介導(dǎo)腦出血后腦心相互作用。上述研究表明，免疫和炎癥在心腦血管相互損傷的機(jī)制中起著關(guān)鍵作用。

針對(duì)心腦血管疾病的防治，“心腦同治”、心-腦軸等理念被提出。在“心腦同治”理念指導(dǎo)下，腦心通應(yīng)運(yùn)而生。腦心通方中重用黃芪，補(bǔ)中益氣、利水消腫，為君藥。丹參歸心經(jīng)，活血祛瘀，治療瘀血諸癥；當(dāng)歸活血補(bǔ)血，破惡血而養(yǎng)新血；川芎為血中氣藥，活血行氣止痛，除卒急腫痛；桃仁、紅花活血止痛，除卒暴擊血；赤芍苦寒，清熱涼血、散瘀止痛，破凝滯之血、活血化瘀，共為臣藥。君臣相配，行氣行血，解卒中之氣滯血瘀。醋乳香、醋沒(méi)藥行氣活血、破血止痛；雞血藤舒筋活絡(luò)；桂枝溫通經(jīng)脈、助陽(yáng)化氣；蟲(chóng)類(lèi)藥地龍、全蝎、水蛭功活血化瘀、通經(jīng)活絡(luò)，佐助活血化瘀通絡(luò)止痛。牛膝、桑枝為佐使藥，引藥入經(jīng)，前者引藥下行，后者偏走于上。諸藥合用，對(duì)癥治療，上利頭目、中溫脾陽(yáng)、下行血海，活血不留瘀、祛瘀不傷正?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示，腦心通含有阿魏酸、丹酚酸B 等多種抗炎抗氧化藥效成分，對(duì)心臟[29]、大腦有多重保護(hù)作用，與腦心通減輕神經(jīng)炎癥、細(xì)胞凋亡等作用相關(guān)[30-31]。藥效學(xué)結(jié)果顯示，不論是心肌缺血狀態(tài)，還是腦缺血狀態(tài)，腦心通膠囊均有效改善心肌缺血和腦缺血狀態(tài)下的“心腦互損”情況，驗(yàn)證了腦心通保護(hù)心臟、大腦，改善“心腦互損”的藥效。腦心通膠囊能減少模型大鼠心、腦水腫和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，說(shuō)明腦心通膠囊具有抗炎作用，與以往研究一致。另外，還發(fā)現(xiàn)在LAD 和MCAO 模型中，腦心通最佳給藥劑量不同。疾病的發(fā)生、發(fā)展和機(jī)制不同，藥物劑量受疾病的影響也不同。藥物在不同疾病的治療中達(dá)到最佳效果的劑量是不同的。而且藥物的劑量也會(huì)受到時(shí)間影響。LAD 和MCAO 模型時(shí)間不相同，也是影響給藥劑量的因素之一。所以，腦心通膠囊在心肌缺血和腦缺血的病理?xiàng)l件下使用劑量受到疾病和時(shí)間2 個(gè)因素的影響。劑量雖不一致，但藥理學(xué)指標(biāo)顯示，在心肌缺血和腦缺血狀態(tài)下腦心通膠囊均達(dá)到“心腦同治”的效果。在不同的疾病狀態(tài)下選擇腦心通膠囊的最佳劑量，保證在心肌缺血或腦缺血下“心腦同治”效果最好。

為探索“心腦互損”“心腦同治”中免疫炎癥相關(guān)機(jī)制，本研究進(jìn)行生物信息學(xué)研究篩選出IL-17信號(hào)通路、TNF 信號(hào)通路、Toll 樣受體信號(hào)通路、NF-κB 信號(hào)通路。結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果，Toll 樣受體信號(hào)通路是腦心通膠囊改善LAD 和MCAO 模型大鼠心臟和海馬損傷的關(guān)鍵通路。Toll 樣受體信號(hào)通路位于免疫和炎癥反應(yīng)機(jī)制的上游。IFN-α、IRF3、IRF7、TLR2、TLR4、TLR7、TLR9 和TNF-α 是Toll樣受體信號(hào)通路的核心節(jié)點(diǎn)。因此，Toll 樣受體信號(hào)通路和Toll 樣受體相關(guān)靶點(diǎn)被選為免疫和炎癥研究的重點(diǎn)。作為參與宿主抵抗外界致病微生物入侵機(jī)體的第一道防線(xiàn)，Toll 樣受體在非感染性疾病中與體內(nèi)相應(yīng)的內(nèi)源性配體結(jié)合可觸發(fā)免疫炎癥反應(yīng)，以其在檢測(cè)和防御微生物病原體的先天免疫中的作用[32]。研究顯示，動(dòng)脈粥樣硬化會(huì)激活Toll 樣受體，引發(fā)強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)[33]。壞死細(xì)胞釋放的危險(xiǎn)信號(hào)會(huì)激活先天免疫通路并引發(fā)強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)，對(duì)心肌梗死后心臟修復(fù)至關(guān)重要[34]。調(diào)節(jié)TLR4介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在腦缺血再灌注損傷中表現(xiàn)出潛在的神經(jīng)保護(hù)作用[35]。

海馬體位于大腦丘腦和內(nèi)側(cè)顳葉之間，主要負(fù)責(zé)短時(shí)記憶的存儲(chǔ)、轉(zhuǎn)換和定向等功能，與學(xué)習(xí)和記憶密切相關(guān)[36]。海馬不僅在神經(jīng)系統(tǒng)中尤為重要，與心臟的關(guān)系也很密切。海馬體和基底神經(jīng)節(jié)是心臟驟停復(fù)蘇后缺血性病理的前哨[37]。同時(shí)，海馬CA1 區(qū)神經(jīng)元在腦缺血和再灌注損傷后容易死亡[38]。抑制microRNA-155 能夠緩解短暫性全身缺血后的神經(jīng)功能障礙以及海馬中神經(jīng)炎癥和氧化應(yīng)激損傷[39]。也有研究證明腹側(cè)海馬結(jié)構(gòu)異常與心衰大鼠的抑郁癥狀有關(guān)[40]。心臟驟停和心肺復(fù)蘇會(huì)損害海馬體，海馬體是下丘腦-垂體-腎上腺軸的重要組成部分，而該軸活動(dòng)的改變會(huì)影響免疫功能[41]。心肌梗死引起的海馬損傷也有報(bào)道。心肌梗死誘導(dǎo)的焦慮樣行為與大鼠海馬的表觀(guān)遺傳學(xué)變化有關(guān)[42]。系統(tǒng)評(píng)價(jià)顯示，心力衰竭患者以及認(rèn)知障礙或抑郁模型動(dòng)物的海馬和額葉出現(xiàn)異常[43]。這些研究顯示，在心肌缺血和腦缺血中，海馬發(fā)生病理改變，改善海馬炎癥有助于疾病治療。

本研究首次運(yùn)用全息醫(yī)學(xué)思維，以海馬為關(guān)鍵部位，觀(guān)測(cè)“心腦互損”的藥理變化。Western blotting結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，大腦海馬中IFN-α、TLR4、TLR7、TNF-α 表達(dá)量顯著增加，表明“心腦互損”狀態(tài)下大腦海馬中發(fā)生炎癥和免疫反應(yīng)。腦心通膠囊干預(yù)后，海馬中這4 個(gè)靶點(diǎn)表達(dá)量顯著下降。由此說(shuō)明，IFN-α、TLR4、TLR7、TNF-α 能夠作為海馬中“心腦互損”“心腦同治”的免疫和炎癥標(biāo)志物。本研究通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證心損及腦、腦損及心的病理變化，以及腦心通膠囊具有“心腦同治”的藥理作用，表明Toll 樣受體相關(guān)蛋白是“心腦互損”“心腦同治”的關(guān)鍵免疫蛋白，為“心腦同治”的深入研究提供依據(jù)和思路。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突