基于電子舌技術(shù)研究蜜炙枇杷葉配方顆粒的“炮制痕跡”

奉 梅，徐 楊，時(shí)小東，楊文蓉，鄧夢(mèng)雨，李秭鈺，劉 濤,3，羅 勇，徐玉玲,3*

1.成都大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 610106

2.成都大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，四川 成都 610106

3.四川省抗病毒中藥產(chǎn)業(yè)化工程技術(shù)研究中心，四川 成都 610106

4.江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，江蘇 連云港 222001

枇杷葉為薔薇科枇杷屬植物枇杷Eriobotrya japonica(Thunb.) Lindl.的葉，臨床上有蜜炙枇杷葉和枇杷葉2 種飲片，枇杷葉有清肺止咳、和胃利尿、止渴的功效，而蜜枇杷葉則起到治療肺熱咳嗽、氣逆喘急、胃熱嘔逆的作用，兩者功效不同。中藥炮制是指在中醫(yī)理論的指導(dǎo)下，按中醫(yī)用藥要求將中藥材加工成中藥飲片的傳統(tǒng)方法和技術(shù)，是中醫(yī)藥臨床用藥的特色之一。炮制前后部分化學(xué)成分會(huì)發(fā)生變化，藥效也會(huì)產(chǎn)生一定差異[1-3]。研究表明，枇杷葉經(jīng)蜜炙后，其醇溶性浸出物增多[4]。魯湘鄂等[5]采用氣相色譜-質(zhì)譜法對(duì)枇杷葉飲片炮制前后的揮發(fā)油進(jìn)行化學(xué)成分的分析，證明了枇杷葉蜜炙前后揮發(fā)油水平上存在差異，汪世浩等[6]通過(guò)紫外光譜技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，蜜炙后的枇杷葉飲片的總?cè)坪棵黠@增加。葉廣億等[7]通過(guò)對(duì)生枇杷葉和炙枇杷葉的水提物、醇提物止咳化痰平喘作用進(jìn)行比較，結(jié)果表明，蜜炙枇杷葉的止咳化痰平喘總體效果明顯優(yōu)于生枇杷葉。

枇杷葉飲片蜜炙前后可以從飲片性狀進(jìn)行有效的區(qū)別，但當(dāng)其制備為配方顆粒后由于經(jīng)過(guò)提取、濃縮、干燥等工藝，顆粒喪失了原飲片的物理特征，不能通過(guò)性狀進(jìn)行辨識(shí)[8]。由于2 種配方顆粒的現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)沒(méi)有差異性，無(wú)法以檢識(shí)其原料是否經(jīng)過(guò)炮制，而不同炮制品的枇杷葉配方顆粒（Eriobotryae Foliumformula granules，EF-FG）臨床功效不同，適應(yīng)證有異，臨床不能混用。由于蜜炙枇杷葉生產(chǎn)成本較高，在配方顆粒生產(chǎn)過(guò)程中投料造假，用非炮制品原料替代炮制品原料等亂投料生產(chǎn)的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，影響了藥品的安全性和有效性，對(duì)中藥配方顆粒產(chǎn)業(yè)的良性發(fā)展帶來(lái)了潛在不良影響。

ASTREE 型電子舌是一種仿生人體舌頭的智能味覺(jué)感官系統(tǒng)，由味覺(jué)傳感列陣及信號(hào)處理、識(shí)別系統(tǒng)組成的智能儀器技術(shù)，其工作原理類似于人類味蕾[9]。分類主要有電位分析、伏安分析、電導(dǎo)分析及生物傳感器電子舌，目前已廣泛應(yīng)用到食品及藥品領(lǐng)域[10-14]。

本實(shí)驗(yàn)采用電子舌技術(shù)，對(duì)EF-FG 及蜜枇杷葉配方顆粒（honey-friedEriobotryaeFoliumformula granules，HEF-FG）的各滋味進(jìn)行測(cè)定，結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)模式識(shí)別分析方法，探討枇杷葉蜜炙前、后制成配方顆粒其本身滋味的改變，并以此為基礎(chǔ)，通過(guò)對(duì)EF-FG 與HEF-FG“炮制痕跡”的研究，為中藥配方顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)無(wú)法檢識(shí)原料是否炮制的問(wèn)題提供解決思路。

1 儀器與材料

1.1 儀器

BS-6KII 型電子分析天平，上海友聲衡器有限公司；ASTREE 型電子舌，法國(guó)Alpha MOS 公司；TG20G 型離心機(jī)，天津廣豐科技公司；PS-40 型超聲波清洗器，深圳得康清洗設(shè)備有限公司。

1.2 試劑與材料

0.01 mol/L 氯化鈉、0.01 mol/L 谷氨酸鈉、0.01 mol/L 鹽酸，法國(guó)Alpha MOS 公司；怡寶蒸餾水，華潤(rùn)怡寶飲料（控股）有限公司。

本實(shí)驗(yàn)樣品EF-FG 與HEF-FG 為自制配方顆粒，枇杷葉藥材選擇標(biāo)準(zhǔn)為不同的枇杷樹(shù)上大小相近顏色相近的葉子，經(jīng)成都大學(xué)郭曉恒副教授鑒定，為薔薇科枇杷屬植物枇杷E.japonica(Thunb.) Lindl.的新鮮葉。枇杷葉藥材樣品詳細(xì)信息見(jiàn)表1。

表1 枇杷葉藥材和枇杷葉、蜜枇杷葉飲片及其配方顆粒樣品信息Table 1 Information of Eriobotryae Folium medicinal herbs, and Eriobotryae Folium decoction pieces, honey-fried Eriobotryae Folium decoction pieces, and its formula granules samples

枇杷葉飲片、蜜枇杷葉飲片根據(jù)《中國(guó)藥典》2020 年版一部“枇杷葉”項(xiàng)下和四部炮制通則項(xiàng)下的蜜炙法炮制（蜜枇杷葉飲片蜜炙時(shí)，枇杷葉飲片-煉蜜5∶1）而成，具體信息見(jiàn)表1。

EF-FG 及HEF-FG 均按照《中藥配方顆粒國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)公示》制成。配方顆粒樣品詳細(xì)信息見(jiàn)表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 EF-FG 及HEF-FG 的制備

取枇杷葉（蜜枇杷葉飲片）100 g，加入2 000 mL水，靜置30 min 后煎煮，待沸后，保持微沸狀態(tài)繼續(xù)煎煮30 min，濾過(guò)，濾渣再次加入2 000 mL 水，煎煮，待沸后，保持微沸狀態(tài)繼續(xù)煎煮30 min，濾過(guò)，合并2 次煎液。濾液于80 ℃下濃縮成清膏，加入糊精輔料適量，混勻，于80 ℃下減壓干燥，再加糊精輔料適量（使得最終干浸膏-輔料1∶1），混勻，制粒，即得EF-FG 及HEF-FG。

2.2 電子舌技術(shù)檢測(cè)EF-FG 及HEF-FG 的電子滋味

2.2.1 電子舌技術(shù)檢測(cè)條件 采用蒸餾水和0.01 mol/L 鹽酸水溶液進(jìn)行ASTREE 型電子舌預(yù)平衡的標(biāo)定，在20 ℃環(huán)境下進(jìn)行。經(jīng)過(guò)處理后的試樣盛放入專屬燒杯中，試樣容量為80 mL，對(duì)每一種試樣進(jìn)行6 次測(cè)量，每次進(jìn)行測(cè)量的時(shí)間為傳感器進(jìn)入盛裝試樣的燒杯之后120 s，攪拌速率一般為1 r/s。用蒸餾水循環(huán)測(cè)試共4 次，每個(gè)洗滌時(shí)間均為30 s。以最后4 次循環(huán)記錄的各味值平均值作為各滋味響應(yīng)值。

2.2.2 供試品溶液的制備 通過(guò)干膏總量及配方顆粒中干膏-輔料1∶1 進(jìn)行計(jì)算，根據(jù)每克枇杷葉配方顆粒的枇杷葉飲片生藥量＝1/2/干膏總量×飲片投入量，每克蜜枇杷葉配方顆粒的枇杷葉飲片生藥量＝1/2/干膏總量×飲片投入量×5/6，計(jì)算出不同配方顆粒所含生藥量（指枇杷葉飲片），結(jié)果見(jiàn)表2。分別取相應(yīng)量的對(duì)應(yīng)配方顆粒粉末（過(guò)三號(hào)篩）適量，精密加入80 mL 怡寶蒸餾水，超聲提30 min（功率100 W、頻率40 kHz），定容至100 mL，超聲5 min（功率100 W、頻率40 kHz）使均勻，3 000 r/min離心（離心半徑為4 cm）5 min 后，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得（供試品溶液所含枇杷葉飲片生藥量為0.02 g/mL，相同質(zhì)量枇杷葉飲片與蜜枇杷葉飲片中枇杷葉飲片質(zhì)量比例為6∶5）。

表2 枇杷葉飲片生藥量計(jì)算結(jié)果及取樣量Table 2 Calculation results and sampling amount of raw materials of Eriobotryae Folium decoction pieces

2.2.3 樣品質(zhì)量濃度考察 用于電子舌測(cè)定的樣品，其質(zhì)量濃度應(yīng)較稀，樣品應(yīng)澄清。將樣品配制成質(zhì)量濃度分別為1、5、10、20、30 mg/mL，進(jìn)樣測(cè)定，并實(shí)時(shí)觀察在線譜圖，結(jié)果表明當(dāng)質(zhì)量濃度20 mg/mL 時(shí)，在滋味響應(yīng)值區(qū)域內(nèi)并沒(méi)有變異，據(jù)此，將20 mg/mL 作為該實(shí)驗(yàn)供試的樣品質(zhì)量濃度。

2.2.4 檢驗(yàn)結(jié)果 分取EF-FG 和HEF-FG 各10 批進(jìn)行測(cè)定，各味道［酸味（AHS）、咸味（CTS）、鮮味（NMS）、通用（CPS）、甜味（ANS）、苦味（SCS）］響應(yīng)值的平均值見(jiàn)表3。

表3 EF-FG 及HEF-FG 各味道響應(yīng)值 (n = 4)Table 3 Each taste response value of EF-FG and HEF-FG (n = 4)

2.3 EF-FG 與HEF-FG 各味道響應(yīng)值配對(duì)的t 檢驗(yàn)

使用SPSS 26 軟件，通過(guò)對(duì)表2 中生制品與炮制品的各口味響應(yīng)值數(shù)據(jù)進(jìn)行配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表4，其中AHS、CPS、SCS 的雙側(cè)P值差均低于0.05，表明枇杷葉蜜炙前后所制成配方顆粒中的上述3 種口味響應(yīng)值具有統(tǒng)計(jì)意義，即枇杷葉蜜炙對(duì)上述3 種口味的影響程度較大。

表4 EF-FG 及HEF-FG 各味道響應(yīng)值配對(duì)t 檢驗(yàn)結(jié)果Table 4 Paired t test results of each taste response value of EF-FG and HEF-FG

2.4 EF-FG 與HEF-FG 的鑒別

2.4.1 配方顆粒特征滋味指紋圖譜的建立 以各味值為坐標(biāo)軸，再根據(jù)各味覺(jué)響應(yīng)值自動(dòng)變換的值，獲得EF-FG 和HEF-FG 的滋味指紋圖，結(jié)果見(jiàn)圖1。HEF-FG 的AHS、CPS、SCS 味值區(qū)域具有明顯差異，與EF-FG 區(qū)別顯著。

圖1 EF-FG 與HEF-FG 特征滋味指紋圖Fig.1 Characteristic taste fingerprint of EF-FG and HEFFG

2.4.2 電子舌結(jié)果主成分分析（principal component analysis，PCA） 使用SIMCA 14 軟件，對(duì)EF-FG和HEF-FG 2 組樣本進(jìn)行PCA，結(jié)果見(jiàn)圖2。結(jié)果表明2 組樣本處于2 個(gè)不同方位，并存在著明顯組內(nèi)差別，第1 主成分和第2 主成分的變異數(shù)貢獻(xiàn)率均為96.90%（＞70%），因此，EF-FG 和HEF-FG 可以利用電子舌進(jìn)行區(qū)分。

圖2 EF-FG 與HEF-FG 滋味PCA 得分3D 圖Fig.2 PCA score 3D diagram of EF-FG and HEF-FG taste

2.4.3 電子舌結(jié)果正交偏最小二乘法-判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA） 使用SIMCA 14 軟件，將EF-FG 與HEF-FG 2 個(gè)樣本的各味道響應(yīng)值進(jìn)行OPLS-DA 模擬，結(jié)果見(jiàn)圖3。從圖3 中可發(fā)現(xiàn)，EF-FG 和HEFFG 被判在2 個(gè)不同位置，鑒別意義非常明顯。該模型對(duì)X矩陣的解釋率（RX2）＝0.978，對(duì)Y矩陣的解釋率（RY2）＝0.852，該模型的預(yù)言能力（Q2）＝0.788，表明了該模型擬合度高、預(yù)測(cè)性較好（圖4）。

圖3 EF-FG 和HEF-FG 的OPLS-DA 得分圖Fig.3 OPLS-DA score plot of HEF-FG and HEF-FG

圖4 OPLS-DA 的模型驗(yàn)證圖Fig.4 Model validation diagram of OPLS-DA

以變量重要性投影（variable importance projection，VIP）＞1 為篩選標(biāo)準(zhǔn)，與配對(duì)樣本t檢驗(yàn)結(jié)合篩選標(biāo)志差異物，共篩選出2 個(gè)差異標(biāo)志物（圖5），分別是AHS、SCS，本實(shí)驗(yàn)研究條件下，OPLS-DA 技術(shù)能夠?qū)F-FG 與HEF-FG 電子舌數(shù)據(jù)的結(jié)果進(jìn)行有效判別。

圖5 OPLS-DA 置換VIP 圖Fig.5 Replacement VIP diagram of OPLS-DA

結(jié)合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果得出，EF-FG 酸味閾值為2 947.21～3 602.15，苦味閾值為3 403.63～4 159.99；HEF-FG 酸味閾值為2 480.49～2 947.21，苦味閾值為3 137.02～3 403.63。經(jīng)3 批驗(yàn)證，EF-FG 與HEFFG 酸味、苦味味值位于相應(yīng)區(qū)間，該方法能對(duì)EFFG 及HEF-FG 進(jìn)行有效鑒別。

3 討論

本研究從“炮制痕跡”及滋味評(píng)價(jià)出發(fā)，采用電子舌技術(shù)對(duì)EF-FG 及HEF-FG 滋味進(jìn)行定量表征。藥材在炮制過(guò)程中及中藥配方顆粒的制備過(guò)程中，由于受熱等因素的影響，藥材與輔料相互作用，配方顆粒的味值與所用輔料的味值不一定完全相關(guān)，本研究表明，蜜炙可顯著降低EF-FG 的酸味值，未增加其甜味值。各味值變化的原因可能與各味道相關(guān)的內(nèi)在成分因炒制發(fā)生變化有關(guān)，樣品中各味值與樣品所含化學(xué)成分的相關(guān)性有待進(jìn)一步研究。

PCA、OPLS-DA 技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)EF-FG 與HEFFG 的快速識(shí)別，2 種識(shí)別模型可以相互驗(yàn)證。結(jié)合數(shù)據(jù)結(jié)果劃分EF-FG 及HEF-FG 酸味、苦味閾值區(qū)間，3 批驗(yàn)證結(jié)果位于相應(yīng)區(qū)間內(nèi)。因此，電子舌技術(shù)可以從數(shù)值上客觀化體現(xiàn)蜜炙對(duì)枇杷葉各味道的影響，可以對(duì)EF-FG 與HEF-FG 進(jìn)行有效鑒別。

四氣五味是中藥藥性理論的重要內(nèi)容，研究表明，中藥的味道與中藥質(zhì)量及其真假偽劣密切相關(guān)，是中藥的一種自身的信息體現(xiàn)[15-16]。但對(duì)于建立以傳統(tǒng)感官評(píng)價(jià)通過(guò)人體自身器官體驗(yàn)，依靠人體所觀、所感不斷的總結(jié)而推理出中藥性能，把中藥所擁有的自然屬性與其內(nèi)在有效成分所代表的內(nèi)在屬性關(guān)聯(lián)到一起[17]，從而建立人體與自然的屬性聯(lián)接，但由于藥物成分不確定性，傳統(tǒng)感官評(píng)價(jià)對(duì)人體有一定的危害，且傳統(tǒng)感官技術(shù)個(gè)人主觀性較強(qiáng)，難以對(duì)中藥及中藥配方顆粒作出客觀評(píng)價(jià)運(yùn)用電子舌等感官技術(shù)可規(guī)避這些風(fēng)險(xiǎn)，為目前中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)研究多為指紋圖譜、特征圖譜及物質(zhì)基礎(chǔ)研究而面臨耗時(shí)長(zhǎng)及標(biāo)準(zhǔn)品浪費(fèi)等一系列問(wèn)題[18-21]及中藥配方顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)完善提供參考。

中藥配方顆粒是中藥飲片經(jīng)提取、濃縮、干燥等處理制成的顆粒劑，制備完成后保留中藥飲片藥效，其性狀卻發(fā)生改變，利用人體感觀無(wú)法對(duì)中藥配方顆粒進(jìn)行是否炮制進(jìn)行判斷。在國(guó)家藥品監(jiān)督管理局頒布的《中藥配方顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)公示》中，枇杷葉顆粒與HEF-FG 鑒別標(biāo)準(zhǔn)完全一致，不良廠家可能會(huì)利用這點(diǎn)進(jìn)行偷工減料，兩者藥效存在一定差異，混淆使用可能無(wú)法達(dá)到治療目的，延誤病情，造成更加惡劣的結(jié)果。由于無(wú)法確認(rèn)市場(chǎng)銷售HEF-FG 原料是否經(jīng)過(guò)炮制，為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，本研究自制10 批樣品進(jìn)行研究，后續(xù)還將應(yīng)用建立的方法對(duì)市場(chǎng)上的成品進(jìn)行對(duì)比研究。

本研究運(yùn)用電子舌等智能感官技術(shù)對(duì)中藥配方顆?！芭谥坪圹E”進(jìn)行研究，以一種安全有效便攜的方式對(duì)炮制前后配方顆粒進(jìn)行辨別，為中藥配方顆粒是否經(jīng)過(guò)炮制無(wú)法檢識(shí)得問(wèn)題提供解決參考。由于其檢測(cè)閾值濃度較低，往往低于人體真實(shí)味覺(jué)閾值，可能對(duì)測(cè)定結(jié)果有一定的影響。結(jié)合參考文獻(xiàn)及電子舌檢測(cè)技術(shù)現(xiàn)狀[22-24]，本研究對(duì)其測(cè)定方法進(jìn)行了研究，但其完整性的方法學(xué)考察，目前尚未見(jiàn)報(bào)道，有待進(jìn)一步研究。針對(duì)中藥多靶標(biāo)成分發(fā)揮效果的特點(diǎn)[25-27]，在后續(xù)研究還可對(duì)電子舌技術(shù)等感官技術(shù)結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)有效成分篩選方法及近紅外檢測(cè)等快檢技術(shù)進(jìn)行探討，以期為中藥配方顆?！芭谥坪圹E”研究提供思路。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突