超聲輔助低共熔溶劑提取萊菔子中蘿卜硫素的工藝優(yōu)化及其銅綠假單胞菌生物膜抑制活性研究

梁佩云，黃鈺景，陳浩銘，曹昊恒，吳銀冰，陳婷婷，陳楚汕，范紅霞，鄭俊霞

廣東工業(yè)大學生物醫(yī)藥學院，廣東 廣州 510006

萊菔子，別名“蘿卜子”“菜子頭”，為十字花科萊菔屬植物蘿卜RaphanussativusL.的干燥成熟種子，歸肺、脾、胃經(jīng)，具有消食除脹、降氣化痰等眾多功效，其主要活性成分為異硫氰酸酯及硫代葡萄糖苷等，其中蘿卜硫素是萊菔子中含量較大的異硫氰酸酯類化合物，因此，從萊菔子中提取蘿卜硫素應(yīng)用于藥品和食品領(lǐng)域具有重大意義[1-4]。目前，蘿卜硫素的提取主要以溶劑萃取法、酶解法和現(xiàn)代提取技術(shù)為主。

溶劑萃取法常用的提取溶劑為二氯甲烷[5-9]、醋酸乙酯[10-15]、丙酮[16]、熱乙醇溶液[17]等，然而，有機溶劑易揮發(fā)、有毒，對環(huán)境有害，此外，廢液處理成本高。酶解法是目前人們從植物中獲得天然蘿卜硫素的主要方法[18]，但酶的活性極易受到環(huán)境影響和酶的成本較高，且硫苷酶解后存在大量副產(chǎn)物，后續(xù)的純化工作復(fù)雜。

現(xiàn)代提取技術(shù)主要包括超臨界流體萃取[19]、超聲波輔助提取[9]和微波輔助提取[20]等儀器分析技術(shù)的應(yīng)用，有效的縮短了蘿卜硫素提取時間，提高了提取效率，但對儀器分析的準確度要求高，難以實現(xiàn)大范圍推廣。因此，尋找綠色溶劑用于萊菔子中蘿卜硫素的提取倍受重視。

綠色溶劑的開發(fā)促進了現(xiàn)代綠色化學的發(fā)展，與傳統(tǒng)有機試劑相比，低共熔溶劑（deep eutectic solvents，DESs）具有熔點低、綠色、無毒以及可提高中藥化合物提取率等突出優(yōu)點，是提取中藥活性成分的理想試劑，具有廣闊的開發(fā)前景和商業(yè)應(yīng)用前景[21-23]。低共熔溶劑是指由一定化學計量學比的氫鍵受體（hydrogen bond acceptor，HBA）和氫鍵供體（hydrogen bond donors，HBD）組合而成的低共熔混合物，其凝固點顯著低于各個組分純物質(zhì)的熔點[24-29]。針對DESs 諸多優(yōu)點，研究人員已將其運用于食品、藥品等領(lǐng)域，作為一種綠色提取介質(zhì)，用于酚酸類[30]、生物堿類[31]、多糖類[32]等活性成分的提取，但DESs 提取萊菔子中活性成分研究仍然有限，且國內(nèi)報道不多。

因此，本實驗采用超聲輔助低共熔溶劑提取技術(shù)[18,33]，研究不同低共熔溶劑對萊菔子中的蘿卜硫素提取率的影響，并利用響應(yīng)面對工藝進行優(yōu)化；同時采用大孔吸附樹脂法回收萊菔子中的蘿卜硫素和DESs 溶劑，評價該方法的可持續(xù)利用度，以期為DESs 提取該成分提供可靠的理論基礎(chǔ)，具體流程如圖1 所示。

圖1 DESs 提取萊菔子中蘿卜硫素的流程Fig.1 DESs extraction process of sulforaphane from Raphani Semen

1 儀器與材料

1.1 儀器

Forma 3111 型超純水系統(tǒng)，深圳洪森環(huán)保科技有限公司；1260 Infinity II 型高效液相色譜儀，支元儀器有限公司；SW-CJ-2FD 型超凈工作臺，蘇州安泰公司；YXQ-LS-70A 型高壓滅菌鍋、THZ-300 型恒溫培養(yǎng)搖床，上海一恒醫(yī)療器械有限公司；DWHL100 型?80 ℃超低溫冰箱，美國Thermo Fisher Scientific 公司。

1.2 材料

萊菔子藥材購于廣州市場，經(jīng)暨南大學生物醫(yī)藥研究院王一飛教授鑒定，為十字花科萊菔屬植物蘿卜RaphanussativusL.的干燥成熟種子。D-101 大孔樹脂、AB-8 大孔樹脂、氯化膽堿、乙酸、乙二醇、丙三醇、乳酸、檸檬酸、尿素、乙酰胺等均購于廣州化學試劑廠；蘿卜硫素對照品，批號CKA454，質(zhì)量分數(shù)99.0%，購于德國Sigma 公司；水解酪蛋白胨（MH）肉湯和MH 瓊脂購于青島海博生物技術(shù)有限公司；結(jié)晶紫、酸水解酪蛋白、二甲基亞砜（DMSO）等均購于廣州市光華科技股份有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 試劑、緩沖液和培養(yǎng)基的配制

2.1.1 A10 溶液、BT 溶液的配制

（1）A10 溶液：由4.785 g Na2HPO4·12 H2O、2.994 g KH2PO4、2.992 g NaCl、1.995 g (NH4)2SO4用超純水溶解并定容至100 mL，即得。

（2）BT 溶液：由5.549 0 g CaCl2·2H2O（C）、4.760 5 g MgCl2·6H2O（M）、0.135 1 g FeCl3·6H2O（F）先分別加入蒸餾水定容至50 mL，再按500 μL M、50 μL C、500 μL F、450 mL 蒸餾水混合，即得。

2.1.2 PBS緩沖溶液 準確稱取磷酸氫二鈉1.44 g，磷酸二氫鉀0.2 g，氯化鉀0.2 g，氯化鈉8.0 g 后加入去離子水溶解，調(diào)節(jié)pH 值至7.4，用超純水定容至1 L，高溫高壓滅菌后，冷卻，備用。

2.1.3 最簡（ABTGC）培養(yǎng)基（含有葡萄糖和酸水解酪蛋白）配制 ABTGC 培養(yǎng)基由A10 溶液、BT溶液、20%葡萄糖溶液及20%酸水解酪蛋白溶液混合配制而成。A10 和BT 溶液分別用高壓蒸汽滅菌，冷卻至室溫后，準確取450 mL BT 溶液，加入50 mL A10 溶液，并加入5 mL 20%葡萄糖及5 mL 20%酸水解酪蛋白（20%葡萄糖及20%酸水解酪蛋白用濾過除菌），混合均勻后置于?4 ℃冰箱，備用。

2.2 前處理

萊菔子樣品用去離子水洗凈，并在40 ℃干燥后，用中藥粉碎機粉碎并過篩（60 目），備用。根據(jù)文獻報道，用加熱攪拌法制備DESs，HBD 和HBA按一定物質(zhì)的量比在80 ℃左右下加熱攪拌，直至形成均一、透明的液體。HBD 和HBA 組合形成不同種類的DESs，如表1 所示。常見的DESs 是由不同配體與氯化膽堿按照一定物質(zhì)的量比形成的，主要由于氯化膽堿價格便宜、來源廣泛、無毒且可生物降解。參考文獻報道的方法處理新購買的大孔吸附樹脂[30]，將其裝入潔凈的樹脂柱內(nèi)，以95%乙醇洗至流出液加3 倍量水后無白色混濁現(xiàn)象，改用蒸餾水沖洗至無醇味，備用[34]。

表1 不同種類的DESsTable 1 Different kinds of DESs

2.3 對照品溶液的制備及線性關(guān)系考察

精密稱取蘿卜硫素對照品5.0 mg，置于5 mL量瓶中，加入色譜級甲醇稀釋至刻度，配制成1.0 mg/mL 的蘿卜硫素對照品溶液，然后用1.0 mg/mL對照品溶液分別配制成0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL 的系列對照品溶液，進行HPLC 分析。

色譜條件[18,23]：色譜柱為Cosmosil Cholester 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為水-乙腈；體積流量0.8 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長201 nm；進樣量10 μL；洗脫梯度設(shè)置為0～10 min，10%～80%乙腈；10～15 min，80%～100%乙腈。色譜圖見圖2。

圖2 不同質(zhì)量濃度的蘿卜硫素對照品溶液在201 nm 下的HPLC 圖Fig.2 HPLC diagram of sulforaphane standard solution with different concentrations at 201 nm

各質(zhì)量濃度的標準溶液經(jīng)色譜分析后，以標準溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標（X），對照品溶液的峰面積為縱坐標（Y），繪制標準曲線，得到線性回歸方程Y＝1×107X＋5×106，r2＝0.999 5，結(jié)果表明蘿卜硫素在0.1～0.6 mg/mL 呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.4 萊菔子中蘿卜硫素提取率的計算

精密移取萊菔子提取液0.5 mL，加入色譜級的甲醇溶液0.5 mL，搖勻，在201 nm 下測定溶液中的蘿卜硫素的峰面積。將峰面積代入標準曲線求得相應(yīng)的蘿卜硫素質(zhì)量濃度，再利用如下公式計算萊菔子中蘿卜硫素的提取率。

提取率＝CVD/M

C為據(jù)標準曲線計算求得的蘿卜硫素質(zhì)量濃度，V為上清液的體積，D為稀釋倍數(shù)，M為樣品質(zhì)量

2.5 萊菔子中蘿卜硫素的提取

精密稱量萊菔子粉末5.00 g 置于錐形瓶中，按照液料比10∶1 加入DESs 50.0 mL（含水量為30%），混合均勻，靜置2 h 后，放入超聲儀中，在35 ℃、350 W 下超聲提取30 min，冷卻至室溫，溶液轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)，8 000 r/min 離心15 min（離心半徑10 cm），棄沉淀，量取并記錄上清液的體積。同時，選取文獻報道[2-3]的萊菔子常用的提取方法（95%乙醇超聲提取法），在同等條件下，與本研究的低共熔溶劑提取法進行比較。

2.6 DESs 種類的選擇

稱取5.0 g 萊菔子粉末8 份于提取器中，分別按照液料比10∶1 加入95%乙醇和物質(zhì)的量比2∶1 的DESs（DESs-1、DESs-2、DESs-3、DESs-4、DESs-5、DESs-6、DESs-7），其含水量均為30%（含水量指水與溶劑的體積比），超聲溫度30 ℃、超聲時間30 min、超聲功率350 W 進行DESs 的選擇，實驗重復(fù)3 次。結(jié)果見圖3 和表2，各種低共熔溶劑的提取率均高于有機試劑95%乙醇對萊菔子中蘿卜硫素的提取率，且7 種低共熔溶劑中DESs-3（乳酸-氯化膽堿）的提取率較其他低共熔溶劑高，故本實驗選取DESs-3（乳酸-氯化膽堿）作為提取溶劑。

表2 提取溶劑對蘿卜硫素提取率的影響Table 2 Effects of extractants on the extraction rate of sulforaphane

圖3 95%乙醇提取液和DESs 提取液在201 nm 下的HPLC 圖Fig.3 HPLC images of 95% ethanol extracting solution and DESs extracting solution at 201 nm

2.7 單因素試驗考察各影響因素對蘿卜硫素提取率的影響

在確定最佳DESs 的種類的基礎(chǔ)上，按照“2.5”項下提取方法，精密稱量萊菔子粉末5.00 g 置于錐形瓶中，按照液料比10∶1 加入DESs（乳酸與氯化膽堿物質(zhì)的量比2∶1）50.0 mL（含水量為30%），混合均勻，靜置2 h 后，放入超聲儀中，在35 ℃、350 W 下超聲提取30 min，冷卻至室溫，溶液轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)，8 000 r/min 離心15 min（離心半徑10 cm），棄沉淀，量取并記錄上清液的體積。依次考察乳酸與氯化膽堿物質(zhì)的量比、含水量、液料比、超聲時間、超聲溫度、超聲功率對蘿卜硫素提取率的影響。分析上述6 個單因素對萊菔子中蘿卜硫素提取的影響程度，并選擇其中對萊菔子中蘿卜硫素提取率影響程度最大的4 個因素的各自最佳水平進行后續(xù)Box-Behnken 設(shè)計（Box-Behnken design，BBD）實驗。

2.7.1 乳酸與氯化膽堿物質(zhì)的量比對蘿卜硫素提取率的影響 不同乳酸與氯化膽堿物質(zhì)的量比1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1 時，萊菔子中蘿卜硫素的提取率分別為7.273 3、9.863 2、15.504 9、15.068 9、8.411 4、4.103 7 mg/g。隨著乳酸比例的增加，提取液中蘿卜硫素含量快速上升，當乳酸與氯化膽堿的比例為3∶1 時，提取率達到最大值，繼續(xù)增加乳酸量，蘿卜硫素提取率又下降。其原因可能是，在常溫下DESs 的黏度很大，增加乳酸的量可降低DESs 的黏度和表面張力，從而增加目標組分的擴散和質(zhì)量轉(zhuǎn)移能力，使得蘿卜硫素的提取率升高；但隨著乳酸含量的增多，氯化膽堿含量逐漸降低，又會導(dǎo)致目標組分與DESs 的相互作用減弱，從而使得提取率下降。因此，選擇乳酸與氯化膽堿的物質(zhì)的量比為3∶1，作為物質(zhì)的量比因素的最佳水平。

2.7.2 含水量對蘿卜硫素提取率的影響 不同含水量10%、20%、30%、35%、40%、45%、50%、60%時，萊菔子中蘿卜硫素的提取率分別為2.272 8、3.685 0、10.016 0、11.117 5、15.209 1、14.409 2、12.460 4、6.433 2 mg/g。當含水量為40%時，蘿卜硫素提取率最大。含水量是影響DESs 提取效率的重要參數(shù)，具有調(diào)節(jié)DESs 的黏度和極性作用。增大含水量會降低DESs 的黏度，同時也會影響DESs的極性，黏度的降低可增加溶劑與萊菔子的接觸，進而增加萊菔子中蘿卜硫素的提取率；然而含水量過高會使DESs 中的氫鍵被破壞，削弱了DESs 與萊菔子間的相互作用。故選擇40%為含水量因素的最佳水平。

2.7.3 液料比對蘿卜硫素提取率的影響 不同液料比為10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1 時，萊菔子中蘿卜硫素的提取率分別為9.140 1、16.459 1、17.165 0、13.475 6、5.258 4、4.253 3、2.236 3 mg/g。隨著液料比的降低，蘿卜硫素提取率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，其可能是因為DESs 的體積決定了萊菔子粉末是否能充分浸潤、目標化合物能否有效溶出。隨著液料比的降低，萊菔子粉末充分浸潤，蘿卜硫素提取率不斷增加，當液料比達到20∶1 時，蘿卜硫素提取率達到最大值；此時再降低液料比，增加溶液量，會使得超聲破壞萊菔子細胞壁的效果變差，導(dǎo)致部分蘿卜硫素無法溶解到溶液中，從而使得其提取率下降。因此，選擇20∶1 作為液料比因素的最佳水平。

2.7.4 超聲時間對蘿卜硫素提取率的影響 不同超聲時間10、20、30、35、40、45、50、60 min 時，萊菔子中蘿卜硫素的提取率分別為5.154 3、9.068 1、13.026 4、16.382 6、17.709 4、16.802 2、13.795 3、9.028 2 mg/g。在10～40 min 時間段內(nèi)提取率隨著超聲時間的增加而上升，原因是超聲時間越長，超聲對于萊菔子細胞壁的破壞程度越大，蘿卜硫素溶解增多，提取率上升；在40～60 min 的時間段內(nèi)提取率下降，可能是因為隨著超聲時間的增加，蘿卜硫素的溶解率逐漸接近飽和，而其他化合物溶出增多；也可能是超聲時間過長對蘿卜硫素的穩(wěn)定性有一定影響，故提取率下降。因此，選擇40 min 作為超聲時間因素的最佳水平。

2.7.5 超聲溫度對蘿卜硫素提取率的影響 不同超聲溫度25、30、35、40、45、50、60 ℃時，萊菔子中蘿卜硫素的提取率分別為2.575 0、3.013 1、8.647 2、13.785 3、14.539 1、13.407 7、11.936 8 mg/g。隨著超聲溫度的升高，蘿卜硫素的提取率先升后降，這是因為隨著超聲溫度的升高，會進一步增加萊菔子細胞壁的破壞程度，加大溶劑與萊菔子中蘿卜硫素的傳質(zhì)能力；但隨著超聲溫度再升高，反而會使化合物降解，故提取率下降。因此，選擇40 ℃作為超聲溫度因素的最佳水平。

2.7.6 超聲功率對蘿卜硫素提取率的影響 不同超聲功率200、250、300、350、400、450、500 W 時，萊菔子中蘿卜硫素的提取率分別為3.962 8、5.056 2、5.209 5、6.182 4、10.356 4、9.753 1、7.624 3 mg/g。隨著超聲功率的升高，萊菔子中蘿卜硫素的提取率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。原因可能是隨著超聲功率的升高，高密度渦流和大氣泡的產(chǎn)生增加，介質(zhì)的物理和化學作用增強，提取率提高；但當功率超過一定值時，提取率開始降低，這是因為當功率過高時，產(chǎn)生的高密度渦流和大氣泡將使得目標組分的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而導(dǎo)致提取率下降。因此，選擇400 W 作為超聲功率因素的最佳水平。

結(jié)合單因素實驗的結(jié)果，以萊菔子中蘿卜硫素提取率為響應(yīng)值比較可知，各因素對萊菔子中蘿卜硫素提取的影響程度：超聲時間＞液料比＞物質(zhì)的量比＞含水量＞超聲溫度＞超聲功率。

2.8 BBD 實驗優(yōu)化提取工藝

2.8.1 BBD 實驗設(shè)計 采取3 水平4 因素BBD 實驗優(yōu)化萊菔子中蘿卜硫素的提取條件。在單因素實驗的基礎(chǔ)上，以蘿卜硫素提取率為響應(yīng)值，選取乳酸（HBD）與氯化膽堿（HBA）物質(zhì)的量比（X1）、含水量（X2）、液料比（X3）和超聲時間（X4）因素中影響最大的3 水平，分別以?1、0、+1 編碼，因素與水平設(shè)計見表3，且超聲溫度和超聲功率分別為40 ℃和400 W。利用Design-Expert 軟件對各種因素進行回歸擬合，優(yōu)化萊菔子中的蘿卜硫素的提取條件。

表3 BBD 實驗設(shè)計與結(jié)果Table 3 Experiment design and results of BBD

2.8.2 響應(yīng)面（RSM）優(yōu)化提取條件結(jié)果分析 采用BBD 實驗涉及到3 個水平、4 個因素，具有5 個重復(fù)數(shù)據(jù)用于評價模型變異性和穩(wěn)定性。BBD 實驗表格設(shè)計及其實驗數(shù)據(jù)如表3 所示，實驗結(jié)果如表4 和圖4 所示，在數(shù)據(jù)分析軟件中，根據(jù)實驗數(shù)據(jù)，采用多元回歸擬合分析，以提取率Y為響應(yīng)值。就能夠獲得如下的2 次多項回歸方程Y＝21.97＋1.16X1＋0.71X2＋0.82X3＋0.19X4＋2.40X1X2＋0.22X1X3－2.29X1X4＋0.81X2X3－1.12X2X4＋1.45X3X4－5.07X12－3.87X22－2.52X32－3.18X42。根據(jù)提取率方程的方差分析的結(jié)果（表4）可以看出，該回歸模型顯著（P＜0.000 1），失擬項不顯著（P＞0.05），表明模型擬合程度好，模型回歸系數(shù)R2＝0.969 8，調(diào)整后R2＝0.939 5，表明該模型與實際提取過程的擬合度良好，方程的可靠性較高。通過對方差數(shù)據(jù)進行分析，可以得出，在物質(zhì)的量比（X1）、含水量（X2）、液料比（X3）以及提取時間（X4）4 個1 次項中，物質(zhì)的量比和液料比對提取率具有極顯著影響（P＜0.01），含水量對提取率具有顯著影響（P＜0.05），分析各個因素的主效應(yīng)關(guān)系為X1＞X3＞X2＞X4。2 次項交互作用X1X2、X1X4對提取率具有極顯著的影響（P＜0.01），X3X4、X2X4對提取率具有顯著影響（P＜0.05），X1X3、X2X3對提取率的影響不顯著（P＞0.05）。各個交互因素對提取率影響的顯著性順序排列為X1X2＞X1X4＞X3X4＞X2X4＞X2X3＞X1X3。根據(jù)回歸模型的方程，得到的最優(yōu)提取工藝條件為乳酸與氯化膽堿物質(zhì)的量比為3.16∶1、含水量為40.82%、液料比為20.96∶1、超聲時間為39.94 min、超聲溫度40 ℃、超聲功率400 W；最佳提取率為22.20 mg/g。

表4 響應(yīng)面回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis for response surface regression mode

圖4 X1、X2、X3、X4 交互作用對萊菔子中蘿卜硫素提取率影響的響應(yīng)面Fig.4 Response surfaces (3D) of effects of interaction of X1, X2, X3 and X4 on extraction rate of sulforaphane from Raphani Semen

2.9 最優(yōu)提取條件的驗證及DESs 重復(fù)利用實驗

2.9.1 最優(yōu)提取條件的驗證 在DESs 最佳提取條件下提取5.00 g 萊菔子，然后測定萊菔子中蘿卜硫素的提取率，并與預(yù)測值相比較，從而評價該模型模擬的準確度。在最佳提取條件下進行多次實驗可得萊菔子中蘿卜硫素的提取率為22.01 mg/g，實驗值與預(yù)測值（22.20 mg/g）接近，說明該模型模擬結(jié)果準確可靠，為萊菔子中蘿卜硫素的進一步開發(fā)利用提供了一定的理論依據(jù)。

響應(yīng)面分析以及最佳工藝的測定是該研究中決定性的步驟，也是對整個研究的總結(jié)，其準確度直接影響了研究的結(jié)果。在該步驟中，通過對軟件的熟練應(yīng)用，對響應(yīng)面實驗結(jié)果進行了處理，得到了2 次多項回歸方程、直觀的響應(yīng)面圖、并且完成了本研究的最終目的得到提取萊菔子中蘿卜硫素的最佳工藝條件。為超聲輔助低共熔溶劑提取萊菔子中的蘿卜硫素求出了一種綠色、環(huán)保、高效的蘿卜硫素提取工藝。

2.9.2 DESs 重復(fù)利用實驗 取已處理好的3 種不同型號的大孔樹脂（D-101、AB-8、HPD600）進行萊菔子中蘿卜硫素回收實驗。在DESs 最佳提取條件下，精密移取DESs 提取液10 mL，分別加入不同型號的大孔樹脂3.0 g 和6.0 g，混合均勻后，在室溫下于搖床振搖12 h（150 r/min），至大孔樹脂充分吸附溶液后，取上清液用于測定萊菔子中蘿卜硫素的吸附率；對吸附飽和的大孔樹脂進行濾過，大孔樹脂中加入與DESs 提取液等量95%乙醇，振搖6 h（150 r/min），濾過大孔樹脂，得95%乙醇解吸附溶液；DESs 溶劑回收利用，用于下一次萊菔子中蘿卜硫素的提取，測定其重復(fù)利用的蘿卜硫素提取率。

綠色化學的發(fā)展在很大程度上得利于溶劑的回收。DESs 作為合成溶劑，其蒸氣壓較低，常規(guī)減壓濃縮不適合回收溶劑。因此，尋找合適的回收方法對DESs 的進一步發(fā)展至關(guān)重要。目前報道的文獻中，DESs 可用超臨界CO2、固相萃取等方法進行回收，但其存在價格昂貴或操作復(fù)雜的劣勢[35-36]。相比于前者，大孔樹脂吸附法具有操作簡單、成本低廉等優(yōu)勢，已被用于回收DESs[37]。

本研究考察3 種不同型號的大孔樹脂（AB-8、D-101、HPD600）對萊菔子中蘿卜硫素吸附率的影響，結(jié)果表明（表5），3 種樹脂具有一定的吸附率，隨著樹脂的增加，吸附率明顯增加且效果較好，其中，AB-8 吸附率最高達97.49%。當樹脂用量均為3.0 g 時，檢驗結(jié)果表明AB-8 吸附效果顯著優(yōu)于D-101 和AB-8。同時，采用95%乙醇對吸附飽和后的AB-8 解吸附，解吸附率達82.63%。因此，采用大孔樹脂回收NADESs 簡單、有效。蘿卜硫素經(jīng)大孔樹脂吸附后，DESs 溶液可被回收利用，用于下一循環(huán)繼續(xù)提取?？鄢龤埩粲贒ESs中的蘿卜硫素影響，本實驗回收后的DESs 第2 次用于提取萊菔子中的蘿卜硫素，其提取率達20.92 mg/g（n＝3），回收利用率為95.05%。由此說明，DESs 經(jīng)大孔樹脂吸附后，溶劑完整性較好，可再次回收利用。

表5 不同大孔樹脂對萊菔子中蘿卜硫素吸附率比較 (n = 3)Table 5 Comparison of adsorption rates of sulforaphane in Raphani Semen by different macroporous resins (n = 3)

2.10 銅綠假單胞菌生物膜抑制實驗

2.10.1 銅綠假單胞菌最低抑制濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）實驗 稱取適量樣品，用分子生物學級DMSO 溶解，配制256 mg/mL 的母液（蘿卜硫素質(zhì)量分數(shù)為22.01 mg/g），并用MH肉湯培養(yǎng)基稀釋至一定質(zhì)量濃度備用（最終培養(yǎng)基中DMSO 不超過0.2%）；將過夜培養(yǎng)的菌液，用MH肉湯培養(yǎng)基稀釋至在600nm 波長處的吸光度（A600）值為0.01，備用。

細菌MIC 的測定：復(fù)蘇PA 菌株，統(tǒng)一采用CLSI 推薦的微量肉湯稀釋法檢測DESs 提取物和抗菌藥物（阿奇霉素）的MIC，質(zhì)控菌株為銅綠假單胞菌[38]。準確移取100 μL 含樣品的培養(yǎng)基加入到96 孔板中，并二倍稀釋至一系列質(zhì)量濃度，接種100 μL 稀釋后的菌液，同時設(shè)置空白組（只加培養(yǎng)基）、對照組（含0.02% DMSO 菌液）、陽性對照組（阿奇霉素），置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后，觀察各質(zhì)量濃度對應(yīng)孔的渾濁程度，出現(xiàn)澄清現(xiàn)象時即為細菌的MIC。

檢測提取物與陽性對照（阿奇霉素）的MIC，探究提取物對細菌的正常生長是否存在影響，是為了確保其對銅綠假單胞菌生物膜的抑制作用不是通過抑制細菌生長活性實現(xiàn)的，而是基于其他機制的調(diào)控達到抑制效果。實驗結(jié)果表明，與陽性對照組（阿奇霉素）相比，萊菔子的提取物對銅綠假單胞菌具有抑制活性，其MIC 值為256 μg/mL。在遠大于MIC 的濃度下研究對細菌的調(diào)控，很大程度上避免了對細菌耐藥性產(chǎn)生的誘導(dǎo)，可作為群體感應(yīng)活性抑制劑的初步篩選。

2.10.2 銅綠假單胞菌生物膜抑制實驗 采用結(jié)晶紫法測定萊菔子提取物對銅綠假單胞菌生物膜的抑制活性[38-39]。將含萊菔子提取物的母液用ABTGC培養(yǎng)基稀釋至一定質(zhì)量濃度，備用（最終培養(yǎng)基中DMSO 含量不超過0.2%）；將過夜培養(yǎng)的菌液用ABTGC 培養(yǎng)基稀釋至A600＝0.01，備用。

準確移取100 μL 含藥培養(yǎng)基于96 孔板中，并接種100 μL 稀釋后的菌液，同時設(shè)置空白組（只加培養(yǎng)基）、對照組（含0.02% DMSO 菌液），陽性對照組（阿奇霉素），96 孔板外周用200 μL 空白培養(yǎng)基封邊，每組數(shù)據(jù)設(shè)置6 個復(fù)孔；用封口膜包裹96孔板周邊，防止培養(yǎng)基揮發(fā)，并置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；24 h 后，棄去孔板中菌液，并用PBS 溶液洗凈多余浮菌后晾干；向96 孔板中加入120 μL 甲醇，室溫固定20 min；棄去甲醇，晾干后加入120 μL 0.1%結(jié)晶紫染料，染色15 min；棄去結(jié)晶紫染料，并用PBS 溶液洗滌至無多余紫色染料溶出；烘干后，向孔板中加入120 μL 33%冰醋酸溶液，置于搖床上振蕩搖勻后，測定A570，計算生物膜的抑制率。

生物膜的抑制率＝(A對照－A藥敏)/(A對照－A空白)

采用結(jié)晶紫染色法，檢測萊菔子DESs 提取物對銅綠假單胞菌生物膜的抑制活性，實驗結(jié)果如表6 所示，4～256 μg/mL 質(zhì)量濃度下提取物均能抑制銅綠假單胞菌生物膜的形成，且呈良好的量效關(guān)系，在最高質(zhì)量濃度256 μg/mL 下，萊菔子提取物的生物膜抑制率達到53.84%，表明其具有開發(fā)為新型群體感應(yīng)抑制劑的潛力。

表6 萊菔子提取物對銅綠假單胞菌生物膜的抑制率Table 6 Biofilm inhibition rate of extracts from Raphani Semen against P.aeruginosa

3 討論

本實驗考察了超聲輔助綠色提取溶劑DESs 用于萊菔子中的蘿卜硫素的提取，發(fā)現(xiàn)由氯化膽堿和乳酸合成的溶劑為最佳溶劑。經(jīng)單因素實驗和響應(yīng)面法優(yōu)化得到超聲輔助提取萊菔子中蘿卜硫素的最佳條件：物質(zhì)的量比為3.16∶1、含水量為40.818%、液料比為20.962∶1、超聲時間為39.937 min、超聲溫度40 ℃、超聲功率400 W；且最佳提取率為22.199 mg/g。同時，在最佳實驗條件下驗證，萊菔子中的蘿卜硫素的提取率達22.013 mg/g，與預(yù)測值（22.199 mg/g）接近，說明該模型模擬結(jié)果準確可靠。此外，DESs 經(jīng)大孔樹脂吸附后，溶劑完整性較好，可再次回收利用，說明DESs 提取法具有重復(fù)使用、高效、綠色環(huán)保等優(yōu)點。

本研究對DESs 提取液采用群體感應(yīng)抑制活性實驗表明，萊菔子提取液對銅綠假單胞菌生物膜具有一定的抑制活性。生物膜的形成已成為銅綠假單胞菌耐藥性增加的主要原因之一，避開傳統(tǒng)抗生素的作用靶點，研究特異性針對生物膜的新型抗菌藥物已成為研究熱點。群體感應(yīng)系統(tǒng)是細菌間進行交流的“語言系統(tǒng)”，調(diào)控生物膜的形成和分散過程。當細菌相互聚集且數(shù)量達到一定閾值時，可分泌大量的高絲氨酸內(nèi)酯類自誘導(dǎo)信號分子，這些信號分子可與菌體相應(yīng)的雙組分調(diào)控受體相結(jié)合，并通過信號傳導(dǎo)調(diào)控生物膜的形成[40-41]。因群體感應(yīng)系統(tǒng)在生物膜形成中起決定性作用，群體感應(yīng)抑制劑的研發(fā)已成為研究的熱點，而本實驗結(jié)果表明，萊菔子DESs 提取物能抑制銅綠假單胞菌生物膜的形成，是一種潛在的群體感應(yīng)抑制劑。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突