經(jīng)典名方清寧散HPLC 指紋圖譜及其質(zhì)量標(biāo)志物（Q-Marker）預(yù)測(cè)分析

劉玉婷，李 菡，趙宇晴，周晶晶，柯昌華，王燕子，趙倩倩，謝曉林，張德柱，高 鴻，梁承遠(yuǎn)*

1.陜西科技大學(xué)生物與醫(yī)藥學(xué)院，陜西 西安 710021

2.陜西盤(pán)龍藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，陜西 西安 710025

3.陜西帕尼爾生物科技有限公司，陜西 西安 710082

中醫(yī)藥是中華民族的瑰寶，經(jīng)典名方是我國(guó)歷代醫(yī)家在不斷的傳承和實(shí)踐中凝結(jié)的智慧結(jié)晶[1]，是中醫(yī)理論、方劑發(fā)展的核心載體，更是其中的精華[2]。近年來(lái)，國(guó)家中醫(yī)藥管理局秉承“以健康為導(dǎo)向，圍繞優(yōu)勢(shì)病種”的原則，于2018 年發(fā)布《古代經(jīng)典名方目錄（第一批）》[3]，2023 年再度出臺(tái)《古代經(jīng)典名方目錄（第二批兒科部分）》的通知[3]，以發(fā)揮中醫(yī)藥治療疾病的優(yōu)勢(shì)，推動(dòng)中醫(yī)藥復(fù)方制劑的快速發(fā)展。近年來(lái)，小兒疾病發(fā)病率逐年上升，兒童用藥也愈加受到關(guān)注，中藥因其療效穩(wěn)定、藥性溫和、藥物不良反應(yīng)少等優(yōu)點(diǎn)，廣泛用于兒科疾病治療。清寧散收錄于《古代經(jīng)典名方目錄（第二批兒科部分）》，出自清代陳復(fù)正所著的《幼幼集成》，全方由桑白皮、甜葶藶、赤茯苓、車(chē)前子、甘草5 味藥材組成，“治心肺有熱而令咳嗽，宜從小便利出[4]?！睘槊C肺利水止咳喘之劑。目前，對(duì)清寧散的研究多集中在臨床應(yīng)用方面，其加減方常用于治療小兒痰熱壅肺型咳嗽、痤瘡等疾病，未其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。

中藥復(fù)方成分復(fù)雜，通過(guò)多成分、多靶點(diǎn)、多途徑協(xié)同發(fā)揮療效[5]，對(duì)其單一成分的研究不能代表整體藥效，中藥指紋圖譜能夠全面、定量地反映中藥的化學(xué)信息[6]，是中藥及其制劑質(zhì)量控制的有效手段。為保障中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的科學(xué)性，需要確認(rèn)影響其品質(zhì)的功效關(guān)聯(lián)物質(zhì)[7]，劉昌孝院士[8]于2016 年提出質(zhì)量標(biāo)志物（quality markers，Q-Marker）概念，從系統(tǒng)角度分析藥物與機(jī)體的交互作用，從而體現(xiàn)中醫(yī)治療疾病多途徑、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)[9-10]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)具有整體性、系統(tǒng)性的特點(diǎn)與中醫(yī)藥整體觀、辨證論治原則一致[11-12]，本研究對(duì)清寧散的物質(zhì)構(gòu)成進(jìn)行初步研究，并利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)，綜合預(yù)測(cè)分析清寧散發(fā)揮臨床療效的潛在Q-Marker，揭示其治療疾病的科學(xué)內(nèi)涵，為清寧散及其制劑的質(zhì)量控制及作用機(jī)制研究打下基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

LC-16 型高效液相色譜儀，島津儀器有限公司；Ulti-Mate 3000 型超高效液相色譜-Orbitrap 質(zhì)譜儀，戴安中國(guó)有限公司；LE204E/02 型電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；YM-100S 型超聲波清洗機(jī)，深圳市方奧微電子有限公司；FSJ-A05N6 型多功能粉碎機(jī)，小熊電器股份有限公司；WFH-203B 型紫外線分析儀，上海精科實(shí)業(yè)有限公司；JHG-9123A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，西安莫吉娜儀器制造有限公司；30MF53L 型煎藥鍋，潮州市潮安區(qū)龍光電器有限公司。

1.2 試藥

對(duì)照品異鼠李素（批號(hào)110860-202012，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.1%）、甘草苷（批號(hào)111610-202209，質(zhì)量分?jǐn)?shù)95.2%）、芥子堿硫氰酸鹽（批號(hào)111702-202107，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.4%）、甘草酸銨（批號(hào)110731-202122，質(zhì)量分?jǐn)?shù)94.4%）、槲皮素（批號(hào)100081-201610，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.8%）、綠原酸（批號(hào)110753-202119，質(zhì)量分?jǐn)?shù)96.3%）、京尼平苷酸（批號(hào)111828-201805，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.1%）、桑皮苷A（批號(hào)112086-202101，質(zhì)量分?jǐn)?shù)97.2%）、毛蕊花糖苷（批號(hào)111530-201914，質(zhì)量分?jǐn)?shù)95.2%）、芹菜素（批號(hào)111901-202004，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.4%），均購(gòu)自于中國(guó)食品藥品檢定研究院；對(duì)照品β-胡蘿卜苷（批號(hào)PS0811-0025，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%）、松苓新酸（批號(hào)PS0533-0020，質(zhì)量分?jǐn)?shù)97%）、去氫土莫酸（批號(hào)PS1095-0020，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%）、甘草查耳酮A（批號(hào)PS0389-0020，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%）、桑黃酮G（批號(hào)PS1823-0020，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.5%）、桑辛素（批號(hào)PS1304-0025，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%）、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷（批號(hào)PS0618-0020，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%）、茯苓新酸A（批號(hào)PS1094-0010，質(zhì)量分?jǐn)?shù)97%），均購(gòu)自于成都普思生物科技股份有限公司；對(duì)照品甘草酸（批號(hào)20070203，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.27%）購(gòu)自于成都普菲德生物技術(shù)有限公司；乙腈、磷酸，色譜純，美國(guó)Fisher公司；甲醇，天津市天力化學(xué)試劑有限公司；超純水，上海娃哈哈飲用水有限公司；其他試劑均為分析純。

方中桑白皮、甜葶藶、赤茯苓、車(chē)前子、甘草5 味藥材均購(gòu)自道地產(chǎn)區(qū)或主產(chǎn)區(qū)，每味藥材收集于多個(gè)產(chǎn)地，總批次不少于15 批次，由青海省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)院中藥檢驗(yàn)員王珺檢驗(yàn)，留樣標(biāo)本存放于青海省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)院，各藥材基原、藥用部位、產(chǎn)地及采收加工方法均已明確。其中桑白皮來(lái)自河南、四川、湖南3 個(gè)產(chǎn)地共15 批，均為?？粕僦参锷orusalbaL.的干燥根皮；甜葶藶來(lái)自江蘇、安徽、山東3 個(gè)產(chǎn)地共15 批，為十字花科播娘蒿屬植物播娘蒿Descurainiasophia(L.) Webb.ex Prantl.的干燥成熟種子，也稱(chēng)南葶藶；赤茯苓來(lái)自安徽、云南、河北3 個(gè)產(chǎn)地共15 批，為多孔菌科茯苓屬真菌茯苓Poriacocos(Schw.) Wolf 呈淡棕色、淡紅色的干燥菌核；車(chē)前子來(lái)自廣東、吉林、河北3 個(gè)產(chǎn)地共15 批，為車(chē)前科車(chē)前屬植物車(chē)前Plantago asiaticaL.的干燥成熟種子；甘草來(lái)自山西、寧夏、新疆3 個(gè)產(chǎn)地共15 批，為豆科甘草屬植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.的干燥根和根莖。

本實(shí)驗(yàn)前期已按照《中國(guó)藥典》2020 年版一部各“藥材和飲片”項(xiàng)下各單味藥材項(xiàng)下的檢測(cè)方法對(duì)藥材進(jìn)行檢測(cè)，各藥材質(zhì)量均符合要求。藥材來(lái)源與批號(hào)見(jiàn)表1。

表1 清寧散藥材來(lái)源信息Table 1 Source information of Qingning Powder

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Hypersil ODS C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脫：0～10 min，10%乙腈；10～20 min，10%～20%乙腈；20～30 min，20%～23%乙腈；30～40 min，23%～30%乙腈；40～60 min，30%～40%乙腈；60～80 min，40%～45%乙腈；80～100 min，45%～58%乙腈；100～120 min，58～63%乙腈；檢測(cè)波長(zhǎng)：0～15 min，254 nm；15～43 min，280 nm；43～120 min，254 nm；柱溫30 ℃；體積流量0.8 mL/min；進(jìn)樣量25 μL。

2.2 清寧散基準(zhǔn)樣品的制備

2.2.1 桑白皮炮制研究 根據(jù)《中國(guó)藥典》2020 年版炮制通則，確定桑白皮的炮制方法為煉蜜加水稀釋后拌入桑白皮中，悶透后炒至規(guī)定程度，以桑皮苷A 的含量為響應(yīng)值（Y），考察煉蜜量（X1）、悶透時(shí)間（X2）、炮制溫度（X3）的影響，單因素實(shí)驗(yàn)表明，每100 千克煉蜜量25 kg、悶透時(shí)間4 h、炮制溫度95 ℃時(shí)桑皮苷A 含量最高，以上述數(shù)據(jù)為中心點(diǎn)，采用Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)3 因素3 水平的試驗(yàn)方案，具體結(jié)果見(jiàn)表2。采用Design Expert 13 軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面分析，并進(jìn)行模型擬合，得到線性回歸方程：Y＝1.780＋0.009 7X1－0.009 3X2－0.006 4X3－0.014 5X1X2＋0.028 0X1X3＋0.005 7X2X3－0.427 4X12－0.797 4X22－0.273 2X32，R2＝0.994 9，失擬項(xiàng)P＝0.193 4＞0.05，表明線性回歸模型對(duì)數(shù)據(jù)的擬合良好，該模型可信度高，能夠可靠預(yù)測(cè)和分析，3D 響應(yīng)面圖見(jiàn)圖1。

圖1 桑白皮炮制的3D 響應(yīng)面圖Fig.1 3D response surface plots of Morus Cortex processing

表2 桑白皮炮制試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果Table 2 Experimental design and results of Mori Cortex processing

最佳炮制工藝的確定基于Design Expert 13 軟件對(duì)所建模型進(jìn)行參數(shù)最優(yōu)分析，得出最優(yōu)炮制工藝：每100 千克煉蜜量25.054 kg、悶透時(shí)間3.994 h、炮制溫度94.886 ℃，結(jié)合實(shí)際情況，最終確定桑白皮飲片的炮制方法為取桑白皮，加入25 kg 的蜂蜜以適量沸水稀釋拌勻，悶制4 h，置炒制容器內(nèi)，95 ℃炒干，取出，放涼。按最佳工藝條件平行制備3 份蜜桑白皮飲片，測(cè)定桑皮苷A 含量，所得綜合評(píng)分平均值為96.13，RSD 為2.58%，符合預(yù)測(cè)值波動(dòng)范圍，表明模型預(yù)測(cè)性良好，穩(wěn)定可靠。

2.2.2 赤茯苓炮制研究 根據(jù)《中國(guó)藥典》2020 年版炮制通則，確定赤茯苓的炮制方法為取赤茯苓，加黃酒拌勻，悶透后炒至規(guī)定程度，以茯苓新酸A的含量為響應(yīng)值（Y），考察黃酒量（X1）、悶透時(shí)間（X2）、炮制溫度（X3）的影響，單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，每100 千克黃酒量16 kg、悶透時(shí)間4 h、炮制溫度105 ℃時(shí)茯苓新酸A 含量最高，以上述數(shù)據(jù)為中心點(diǎn)，采用Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)3 因素3 水平的試驗(yàn)方案，具體結(jié)果見(jiàn)表3。采用Design Expert 13軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面分析和模型擬合，得到線性回歸方程Y＝0.819 5－0.003 2X1－0.005 3X2＋0.005 8X3＋0.009 3X1X2－0.002 6X1X3－0.002 4X2X3－0.180 8X12－0.281 1X22－0.187 3X32，R2＝0.993 6，失擬項(xiàng)P＝0.952 7＞0.05，表明線性回歸模型對(duì)數(shù)據(jù)的擬合良好，該模型可信度高，能夠可靠預(yù)測(cè)和分析，3D 響應(yīng)面圖見(jiàn)圖2。

圖2 赤茯苓炮制的3D 響應(yīng)面圖Fig.2 3D response surface plots of Rubra Poria processing

表3 赤茯苓炮制試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果Table 3 Experimental design and results of Rubra Poria processing

最佳炮制工藝的確定基于Design Expert 13 軟件對(duì)所建模型進(jìn)行參數(shù)最優(yōu)分析，得出最優(yōu)炮制工藝：每100 千克黃酒量16.469 kg、悶透時(shí)間3.990 h、炮制溫度105.153 ℃，結(jié)合實(shí)際情況，最終確定赤茯苓飲片的炮制方法為取赤茯苓，加16.469 kg 黃酒拌勻，悶制4 h，置炒制容器內(nèi)，105 ℃炒干，取出，放涼。按最佳工藝條件平行制備3 份酒炙茯苓飲片，測(cè)定茯苓新酸A 含量，所得綜合評(píng)分平均值為95.47，RSD 為2.08%，符合預(yù)測(cè)值波動(dòng)范圍，表明模型預(yù)測(cè)性良好，穩(wěn)定可靠。

2.2.3 甘草炮制研究 根據(jù)《中國(guó)藥典》2020 年版，確定甘草的炮制方法為煉蜜加水稀釋后拌入甘草中，悶透后炒至規(guī)定程度，以甘草苷和甘草酸銨含量之和為響應(yīng)值（Y），考察煉蜜量（X1）、悶透時(shí)間（X2）、炮制溫度（X3）的影響[13-14]，單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，每100 千克煉蜜量25 kg、悶透時(shí)間3 h、炮制溫度105 ℃時(shí)甘草苷和甘草酸銨含量最高，以上述數(shù)據(jù)為中心點(diǎn)，采用Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)3 因素3 水平的試驗(yàn)方案，具體結(jié)果見(jiàn)表4。采用Design Expert 13 軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面分析和模型擬合，得到線性回歸方程Y＝3.660－0.015 6X1－0.035 4X2－0.006 2X3－0.024 3X1X2＋0.043 6X1X3＋0.011 0X2X3－0.539 8X12－0.891 2X22－0.501 7X32，R2＝0.991 5，失擬項(xiàng)P＝0.295 7＞0.05，結(jié)果表明，線性回歸模型對(duì)數(shù)據(jù)的擬合良好，該模型可信度高，能夠可靠預(yù)測(cè)和分析，3D 響應(yīng)面圖見(jiàn)圖3。最佳炮制工藝的確定基于Design Expert 13 軟件對(duì)所建模型進(jìn)行參數(shù)最優(yōu)分析，得出最優(yōu)炮制工藝：每100 kg 煉蜜量24.930 kg、悶透時(shí)間為2.980 h、炮制溫度為104.936 ℃，結(jié)合實(shí)際情況，取甘草，加入25 kg 的蜂蜜以適量沸水稀釋拌勻，悶制3 h，置炒制容器內(nèi)，105 ℃炒干，取出，放涼。按最佳工藝條件平行制備3 份炙甘草飲片，測(cè)定甘草苷和甘草酸銨含量，所得綜合評(píng)分平均值為96.18，RSD 為1.97%，符合預(yù)測(cè)值波動(dòng)范圍，表明模型預(yù)測(cè)性良好，穩(wěn)定可靠。

圖3 甘草炮制的3D 響應(yīng)面圖Fig.3 3D response surface plots of Glycyrrhizae Radix et Rhizoma processing

表4 甘草炮制試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果Table 4 Experimental design and results of Glycyrrhizae Radix et Rhizoma processing

2.2.4 甜葶藶炮制研究 按《中國(guó)藥典》2020 年版0213 炮制通則項(xiàng)，取甜葶藶，照清炒法炒至有爆聲。

2.2.5 車(chē)前子炮制研究 按《中國(guó)藥典》2020 年版0213 炮制通則項(xiàng)，取車(chē)前子，照鹽水炙法炒至起爆裂聲時(shí)，噴灑鹽水，炒干。

2.2.6 基準(zhǔn)樣品的制備 根據(jù)國(guó)家中醫(yī)藥管理局于2023 年5 月發(fā)布的古代經(jīng)典名方關(guān)鍵信息表[3]，并查閱相關(guān)文獻(xiàn)典籍[15-16]確定清代1 錢(qián)約折合成現(xiàn)今3.73 g，1 錢(qián)等于10 分。根據(jù)文獻(xiàn)并結(jié)合前期實(shí)驗(yàn)確定清寧散基準(zhǔn)樣品的制備方法為稱(chēng)取上述蜜桑白皮、炒甜葶藶、酒炒赤茯苓、炒車(chē)前子各0.42 g，炙甘草0.21 g，以上藥材粗粉混合，粉碎后過(guò)120 目篩，即得。

2.3 混合對(duì)照品溶液的制備

精密稱(chēng)取異鼠李素、甘草苷、芥子堿硫氰酸鹽、甘草酸銨、槲皮素、綠原酸、京尼平苷酸、桑皮苷A、毛蕊花糖苷、芹菜素、β-胡蘿卜苷、松苓新酸、去氫土莫酸、甘草查耳酮A、桑黃酮G、桑辛素、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷、茯苓新酸A、甘草酸適量置于50 mL 量瓶中，加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為128.14、200.32、80.31、20.17、80.12、19.30、100.14、9.87、100.27、50.41、50.35、200.29、15.38、10.26、60.32、100.38、90.37、30.12、25.09 μg/mL 的混合對(duì)照品溶液。

2.4 供試品溶液的制備

取按“2.2.6”項(xiàng)下方法制備得到的清寧散基準(zhǔn)樣品0.45 g，置于25 mL 量瓶中，加80%甲醇至刻度，搖勻，超聲30 min，濾過(guò)，取續(xù)濾液過(guò)0.45 μm微孔濾膜，即得清寧散基準(zhǔn)樣品的供試品溶液。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 精密度試驗(yàn) 取同一份清寧散基準(zhǔn)樣品，按照“2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次進(jìn)行分析，記錄色譜圖。以10 號(hào)色譜峰為參照峰（S），計(jì)算各共有峰的相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間。結(jié)果表明，各共有峰相對(duì)峰面積的RSD 值均小于2.87%；相對(duì)保留時(shí)間的RSD 值均小于0.93%，表明儀器精密度良好。

2.5.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份清寧散基準(zhǔn)樣品，按照“2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別在制樣后0、2、4、8、12、24 h 后，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。以10 號(hào)色譜峰為參照峰（S），計(jì)算各共有峰的相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間。結(jié)果表明，各共有峰相對(duì)峰面積的RSD 值均小于2.93%；相對(duì)保留時(shí)間的RSD 值均小于0.27%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一清寧散基準(zhǔn)樣品，按照“2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行制備6 份，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖。以10 號(hào)峰為參照峰（S），計(jì)算各共有峰的相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間。結(jié)果表明，各共有峰相對(duì)峰面積的RSD 值均小于2.87%；相對(duì)保留時(shí)間的RSD 值均小于0.89%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.6 基準(zhǔn)樣品指紋圖譜的建立及相似度評(píng)價(jià)

利用隨機(jī)數(shù)表法，將蜜桑白皮、炒葶藶子、酒炒赤茯苓、炒車(chē)前子、炙甘草5 種飲片的不同批次隨機(jī)組合，按照“2.4”項(xiàng)下方法制備15 批清寧散基準(zhǔn)樣品（S1～S15），并按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖。將色譜圖導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2012A），以S1 為參照?qǐng)D譜，采用中位數(shù)法，進(jìn)行多點(diǎn)校正和Mark 峰匹配，得到15 批樣品疊加圖，共確認(rèn)39 個(gè)共有峰。結(jié)果見(jiàn)圖4。與對(duì)照指紋圖譜（R）相比，計(jì)算得15 批清寧散基準(zhǔn)樣品（S1～S15）的相似度分別為1.000、0.998、0.987、0.993、0.996、0.991、0.978、0.957、0.999、0.993、0.967、0.984、0.995、0.988、0.991，均＞0.93，表明基準(zhǔn)樣品特征圖譜相似度良好，主要物質(zhì)群差異性小，形成的基準(zhǔn)樣品對(duì)照?qǐng)D譜能夠作為衡量清寧散基準(zhǔn)樣品的標(biāo)準(zhǔn)參照物。

圖4 15 批清寧散基準(zhǔn)樣品 (S1～S15) 的HPLC 指紋圖譜和對(duì)照指紋圖譜 (R)Fig.4 HPLC fingerprint of 15 batches of Qingning Powder substance reference (S1—S15) and reference fingerprint (R)

2.7 共有峰歸屬

按“2.4”項(xiàng)下的供試品溶液制備方法分別制備單味藥材飲片供試品溶液、缺單味藥材飲片陰性樣品溶液和清寧散基準(zhǔn)樣品供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖。分別將清寧散基準(zhǔn)樣品、單味藥材飲片、缺單味藥材飲片供試品溶液進(jìn)行疊加比較，具體歸屬情況見(jiàn)表5。

表5 清寧散基準(zhǔn)樣品共有峰歸屬情況Table 5 Attribution of common peaks of Qingning Powder substance reference

為進(jìn)一步明確活性成分，按照“2.4”項(xiàng)下的供試品溶液制備方法和“2.1”項(xiàng)下的色譜條件，使用Dionex UltiMate 3000 超高效液相色譜-Orbitrap 質(zhì)譜儀檢測(cè)，測(cè)試條件為電噴霧電離（electrospray ionization，ESI），噴霧電壓3 500 V，鞘氣體積流量40 arb，輔助氣體積流量10 arb，輔助氣溫度300 ℃，毛細(xì)管溫度300 ℃，掃描模式為全掃描模式，掃描范圍m/z為100～1 300，得到總離子流圖，見(jiàn)圖5。經(jīng)質(zhì)譜與對(duì)照品比對(duì)，指認(rèn)18 個(gè)色譜峰，分別為1號(hào)峰異鼠李素、2 號(hào)峰甘草苷、3 號(hào)峰芥子堿硫氰酸鹽、4 號(hào)峰β-胡蘿卜苷、10 號(hào)峰松苓新酸、15 號(hào)峰去氫土莫酸、16 號(hào)峰甘草酸銨、19 號(hào)峰槲皮素、20號(hào)峰綠原酸、21 號(hào)峰甘草查耳酮A、22 號(hào)峰桑黃酮G、24 號(hào)峰京尼平苷酸、26 號(hào)峰桑皮苷A、29 號(hào)峰桑辛素、31 號(hào)峰槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷、34 號(hào)峰毛蕊花糖苷、35 號(hào)峰芹菜素、38號(hào)峰茯苓新酸A。

圖5 清寧散基準(zhǔn)樣品質(zhì)譜總離子流圖Fig.5 Total ion chromatogram of Qingning Powder substance reference

綜上可知，各味藥材飲片特征圖譜中主要物質(zhì)群可以從飲片-基準(zhǔn)樣品較為完整地傳遞，且物質(zhì)群的歸屬關(guān)系清晰，說(shuō)明清寧散基準(zhǔn)樣品的物質(zhì)群可清晰地追溯到飲片，且色譜峰歸屬明確，指認(rèn)率較高。

2.8 化學(xué)計(jì)量學(xué)分析

2.8.1 系統(tǒng)聚類(lèi)分析（hierarchical cluster analysis，HCA） 將15 批清寧散基準(zhǔn)樣品39 個(gè)共有峰的相對(duì)峰面積數(shù)據(jù)輸入SPSS 27.0 數(shù)據(jù)分析軟件，進(jìn)行HCA，采用組間連接法，以平方歐式距離為評(píng)分依據(jù)，聚類(lèi)結(jié)果見(jiàn)圖6。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)平方歐式距離為15 時(shí)，15 批清寧散基準(zhǔn)樣品被聚為3 類(lèi)，S1～S3、S5、S6、S8～S14 為第1 類(lèi)，S4、S15 為第2類(lèi)，S7 為第3 類(lèi)，表明15 批基準(zhǔn)樣品不完全相同，不同產(chǎn)地藥材質(zhì)量及成分含量存在一定差異。

圖6 15 批清寧散基準(zhǔn)樣品聚類(lèi)樹(shù)狀圖Fig.6 Cluster dendrogram of 15 batches of Qingning Powder substance reference

2.8.2 主成分分析（principal component analysis，PCA） 將15 批清寧散基準(zhǔn)樣品的18 個(gè)特征峰的相對(duì)峰面積數(shù)據(jù)輸入SPSS 27.0 并進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，主成分特征值和累積方差貢獻(xiàn)率作為依據(jù)進(jìn)行PCA，結(jié)果見(jiàn)表6，其中5 個(gè)主成分的特征值＞1，累積方差貢獻(xiàn)率為85.882%，可以較為全面地表征樣品共有峰的信息。旋轉(zhuǎn)后的共有峰因子載荷矩陣見(jiàn)表7，第1 主成分的主要影響因素來(lái)自于峰1～4、16；第2 主成分的主要影響因素來(lái)自于峰26、31、34、35；第3 主成分的主要影響因素來(lái)自于峰19、22、29；第4 主成分的主要影響因素來(lái)自于峰10、26；第5 主成分的主要影響因素來(lái)自于峰15。以SIMCA 14.1 進(jìn)行分析得主成分得分圖，見(jiàn)圖7，15批清寧散基準(zhǔn)樣品大致被分為3 類(lèi)，與聚類(lèi)分析結(jié)果一致。

圖7 15 批清寧散基準(zhǔn)樣品PCA 得分圖Fig.7 PCA score plot of 15 batches of Qingning Powder substance reference

表6 PCA 特征值及方差貢獻(xiàn)率Table 6 PCA eigenvalue and variance contribution rate

表7 主成分因子載荷矩陣Table 7 Principal component factor load matrix

2.9 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的清寧散功效關(guān)聯(lián)物質(zhì)預(yù)測(cè)分析

2.9.1 基于可測(cè)性和可塑性的活性成分篩選 根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)調(diào)研，桑白皮為清寧散君藥，其主要活性成分為黃酮類(lèi)和香豆素類(lèi)，包括桑皮苷A、桑辛素、環(huán)桑色醇、桑根酮、傘形花內(nèi)酯、東莨菪素、東莨菪內(nèi)酯等，具有抗炎鎮(zhèn)痛、抗病毒、降血糖、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等多重藥理作用[17-19]；甜葶藶為臣藥，主要成分為黃酮類(lèi)和異硫氰酸類(lèi)，具有改善心血管功能、抗腫瘤、止咳、祛痰、平喘等作用[20-21]；赤茯苓和車(chē)前子為佐藥，茯苓的主要化學(xué)成分是茯苓多糖，具有抗衰老、提高免疫力、消水利腫等作用[22]，京尼平苷酸、毛蕊花糖苷為車(chē)前子的質(zhì)量控制指標(biāo)，發(fā)揮清熱、利尿通淋、滲濕止瀉、明目、祛痰等功效[23]；甘草為使藥，主要活性成分為三萜類(lèi)和黃酮類(lèi)，具有抗炎、抗腫瘤、抗菌、抗病毒、抗氧化等藥理作用[24-25]。

《中國(guó)藥典》2020 年版對(duì)于組方藥的控制主要為葶藶子的槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷，車(chē)前子的京尼平苷酸、毛蕊花糖苷，甘草的甘草苷、甘草酸銨?；谖墨I(xiàn)研究結(jié)合指紋圖譜及特征圖譜的可測(cè)性和可追溯性，確認(rèn)指紋圖譜中指認(rèn)出的桑皮苷A、桑辛素、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷、茯苓新酸A、京尼平苷酸、毛蕊花糖苷、甘草苷、甘草酸銨8 個(gè)活性成分為候選化合物，通過(guò)Pubchem Compound 化合物數(shù)據(jù)庫(kù)（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）獲取8 個(gè)候選化合物的Canonical SMILES 編號(hào)，為后續(xù)清寧散“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建做準(zhǔn)備。

2.9.2 蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction networks，PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將8 個(gè)候選化合物的的Canonical SMILES 編號(hào)分別導(dǎo)入 Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.swisstarget prediction.ch/）進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，去除重復(fù)靶點(diǎn)，獲得與8 個(gè)化合物相關(guān)的共計(jì)386 個(gè)靶點(diǎn)，導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://cn.string-db.org/），選擇物種為“Homo sapiens”，蛋白交互參數(shù)評(píng)分值為“high confidence＞0.9”，獲得PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖8。

圖8 靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)圖Fig.8 Target PPI network

將分析結(jié)果網(wǎng)絡(luò)圖以TVS 格式導(dǎo)入Cytoscape 3.10.0 軟件，利用軟件中的“Network Analyzer”功能對(duì)PPI 網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行拓?fù)鋵傩苑治?，選取度值（degree）、介數(shù)中心性（betweenness centrality）和接近中心性（closeness centrality）3 個(gè)重要拓?fù)鋮?shù)均大于中位數(shù)且度值≥15 的靶點(diǎn)作為核心靶點(diǎn)，經(jīng)篩選得到共計(jì)61 個(gè)核心靶點(diǎn)。

2.9.3 基因本體（gene ontology，GO）功能富集分析和京都基因和基因組百科全書(shū)（ Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析 將通過(guò)PPI 網(wǎng)絡(luò)篩選得到的61 個(gè)核心靶點(diǎn)利用David 6.8 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://david.ncifcrf.gov/）對(duì)其進(jìn)行GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析。選擇物種為“Homo sapiens”，GO 功能分析取“P≤0.005”和KEGG 通絡(luò)分析取“P≤0.01”，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

GO 富集分析共獲取92 個(gè)GO 條目，其中生物過(guò)程（biological process，BP）占63 條；細(xì)胞組成（cell composition，CC）占13 條；分子功能（molecular function，MF）占16 條，根據(jù)顯著性程度進(jìn)行部分展示，結(jié)果見(jiàn)圖9。BP 顯著富集在細(xì)胞對(duì)多巴胺的反應(yīng)、骨化調(diào)節(jié)、胰島素受體信號(hào)調(diào)節(jié)、DNA 損傷反應(yīng)信號(hào)傳導(dǎo)等過(guò)程；CC 顯著富集在膜筏、突觸、細(xì)胞外、細(xì)胞質(zhì)膜側(cè)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等區(qū)域；MF 顯著富集在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合、MAP 激酶活性、RNA聚合酶II 核心啟動(dòng)子近端區(qū)域序列特異性DNA 結(jié)合、血紅素結(jié)合、類(lèi)固醇激素受體活性等功能。KEGG 富集分析中前20 條與清寧散關(guān)聯(lián)程度較高的通路如圖10 所示，主要涉及癌癥信號(hào)通路、T 細(xì)胞受體信號(hào)通路、C 型凝集素受體信號(hào)通路、脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化信號(hào)通路、TNF 信號(hào)通路、甲狀腺激素信號(hào)通路、雌激素信號(hào)通路等，表明61 個(gè)核心靶點(diǎn)可能是主要通過(guò)調(diào)節(jié)這些通路來(lái)起到治療或干預(yù)疾病的作用。

圖9 清寧散核心靶點(diǎn)GO 功能富集分析Fig.9 GO function enrichment analysis of Qingning Powder key targets

圖10 KEGG 富集分析結(jié)果Fig.10 Results of KEGG enrichment pathway analysis

2.9.4 “成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析及整合分析 將篩選得到的清寧散中8 個(gè)活性成分、61 個(gè)核心靶點(diǎn)以及20 條信號(hào)通路，運(yùn)用Cytoscape 3.10.0軟件，構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖，結(jié)果見(jiàn)圖11。結(jié)果表明，清寧散中的多個(gè)有效成分通過(guò)調(diào)控不同通路的多個(gè)靶點(diǎn)，以發(fā)揮疾病治療作用。其中，8 個(gè)活性成分中茯苓新酸A、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-18-O-β-D-龍膽雙糖苷、京尼平苷酸、桑辛素的 連接度相對(duì)較高；在61 個(gè)核心靶點(diǎn)中有絲分裂原活化蛋白激酶1（mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1）、MAPK3、基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP9）、核因子-κB1（nuclear factor kappa B subunit 1，NF-κB1）、腫瘤蛋白p53（tumour suppressor p53，TP53）、原癌基因-JUN（proto-oncogene c-Jun proto-oncogene，JUN）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的連接程度高于其他靶點(diǎn)，在20 條核心通路中，癌癥信號(hào)通路、癌癥蛋白多糖信號(hào)通路、磷脂酰肌醇-3-激酶-蛋白激酶B（phosphatidylinositol-3-hydroxykinaseprotein kinase B，PI3K-Akt）信號(hào)通路與、白細(xì)胞介素-17（interleukin-17，IL-17）信號(hào)通路的連接程度相對(duì)較高。

圖11 “成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖Fig.11 “Compound-target-pathway” network diagram

清寧散可消除肺瘀血，減輕肺部滲出，改善心肺功能，為肅肺利水止咳喘之劑，現(xiàn)代臨床上常用來(lái)治療小兒心肺蘊(yùn)熱所致發(fā)驚、咳嗽等病證[26]。小兒咳嗽的發(fā)生涉及多個(gè)因素，包括氣道高反應(yīng)性、氣道上皮受損、炎性反應(yīng)和咳嗽高敏感性等。其中，炎癥反應(yīng)在這一過(guò)程中起到了關(guān)鍵作用[27]。

通過(guò)對(duì)核心靶點(diǎn)進(jìn)行整合分析發(fā)現(xiàn)，NF-κB 是可以調(diào)節(jié)廣泛基因表達(dá)的核蛋白因子，為控制炎癥反應(yīng)的核心因子[28]，促進(jìn)炎癥因子增加，從而加重炎癥反應(yīng)[29]，在參與炎癥反應(yīng)，細(xì)胞增殖、分化與凋亡，免疫反應(yīng)和腫瘤形成等相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中有重要作用[30]；MMP9 在肺損傷和疾病發(fā)展過(guò)程中，可以降解由Ⅳ型膠原等組成的毛細(xì)血管和肺泡上皮的基膜[31]，參與炎癥和組織修復(fù)的調(diào)節(jié)[32]；TNF-α 主要由單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的一種肽類(lèi)炎性介質(zhì)[33]，能夠使得呼吸道血管內(nèi)皮細(xì)胞表面黏附分子異常表達(dá)，增強(qiáng)血管的通透性，引起氣道產(chǎn)生炎性改變和黏膜水腫，導(dǎo)致氣道反應(yīng)性增加，加劇氣道炎癥反應(yīng)[34]；MAPK 是細(xì)胞外信號(hào)從細(xì)胞表面?zhèn)鲗?dǎo)到細(xì)胞核內(nèi)部的重要傳遞者[35]，激活后可促進(jìn)多種因子的表達(dá)和釋放，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)失衡[36]。

KECG 通路富集分析結(jié)果表明，清寧散8 個(gè)活性成分主要涉及癌癥、炎癥因子介導(dǎo)的調(diào)節(jié)信號(hào)通路、離子信號(hào)通路等。PI3K-Akt 信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)傳導(dǎo)通路，可通過(guò)一系列蛋白因子的表達(dá)來(lái)參與蛋白質(zhì)的合成、細(xì)胞凋亡分化，在炎癥性疾病、惡性腫瘤中均發(fā)揮重要作用[37]，研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)激活PI3K-Akt 信號(hào)通路，活化下游NF-κB，使得激活的NF-κB 轉(zhuǎn)位進(jìn)核而產(chǎn)生免疫應(yīng)答[38]，并誘導(dǎo)γ-干擾素（interferon-γ，IFN-γ）、TNF-α 等多種炎性因子分泌，并介導(dǎo)中性粒細(xì)胞募集及趨化因子生成[39]，加速氣道損害進(jìn)程，加劇肺組織損傷。

IL-17 是由輔助性T 細(xì)胞（T helper cell 17，Th17）分泌的主要效應(yīng)因子，具有強(qiáng)大的募集和中性粒細(xì)胞激活作用[40]，可以誘導(dǎo)活化的T 細(xì)胞和成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及上皮細(xì)胞產(chǎn)生多種促炎遞質(zhì)如IL-1、IL-6、TNF-α、MMP 和化學(xué)激活素從而引起炎癥，IL-17 受體通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合體Act1-TRAF6 激活下游NF-κB、MAPK 等信號(hào)通路[41]，調(diào)節(jié)促炎介質(zhì)和細(xì)胞因子的產(chǎn)生。環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）信號(hào)通路的活化可以抑制NF-κB 活性，減少巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α、免疫細(xì)胞釋放白細(xì)胞介素，從而阻斷炎癥介質(zhì)和免疫相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，減輕肺部炎癥。

由此可見(jiàn)，清寧散中關(guān)鍵效應(yīng)成分通過(guò)作用于多個(gè)靶點(diǎn)，干預(yù)多條通路協(xié)同發(fā)揮治療/干預(yù)疾病的作用?；谥讣y圖譜和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究，清寧散中的桑皮苷A、桑辛素、京尼平苷酸、毛蕊花糖苷等8 個(gè)活性成分具有傳遞性和可溯性，且與清寧散的功能屬性密切相關(guān)，可預(yù)測(cè)其為影響清寧散品質(zhì)的潛在功效關(guān)聯(lián)物質(zhì)。

3 討論

清寧散由桑白皮、赤茯苓、車(chē)前子、甜葶藶和甘草5 味藥材組成，在基準(zhǔn)樣品制備時(shí)采用響應(yīng)面優(yōu)化法以確定最佳制備工藝，為了能夠盡可能全面的分析其化學(xué)成分，對(duì)供試品溶液的制備以及色譜條件進(jìn)行優(yōu)化考察。結(jié)合方中藥材在《中國(guó)藥典》2020 年版中供試品溶液的制備方法對(duì)提取溶劑（超純水、80%甲醇水溶液、甲醇）和提取方法（超聲時(shí)間15、30、45、60 min）進(jìn)行優(yōu)化比較，結(jié)果表明，以80%甲醇超聲30 min，所得色譜圖所包含的信息量最全面、成分含量最高且基線平穩(wěn)，因此，選擇80%甲醇超聲30 min 提取。通過(guò)考察不用的檢測(cè)波長(zhǎng)（254、275、280 nm）、體積流量（0.6、0.7、0.8、1.0 mL/min）、洗脫體系（甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.05%磷酸水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液，乙腈-0.1%冰醋酸水溶液）對(duì)色譜峰的影響，確立了清寧散指紋圖譜的分析方法為流動(dòng)相乙腈-0.1%磷酸水溶液；梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)：0～15 min，254 nm；15～43 min，280 nm；43～120 min，254 nm；柱溫30 ℃；體積流量0.8 mL/min。

經(jīng)典名方組方藥味眾多、成分復(fù)雜，本研究以指紋圖譜作為指標(biāo)，全面考察清寧散原料飲片-基準(zhǔn)樣品的關(guān)鍵質(zhì)量屬性的傳遞性。結(jié)果顯示，清寧散基準(zhǔn)樣品共確認(rèn)39 個(gè)峰，通過(guò)液質(zhì)聯(lián)用共指認(rèn)18個(gè)峰，且歸屬關(guān)系清晰。從色譜峰個(gè)數(shù)和峰強(qiáng)度看，甘草對(duì)指紋圖譜的貢獻(xiàn)最大，桑白皮、車(chē)前子、甜葶藶對(duì)指紋圖譜的貢獻(xiàn)度相對(duì)較大，赤茯苓對(duì)指紋圖譜的貢獻(xiàn)較低。

中藥質(zhì)量是中藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要保障，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一種基于“疾病-基因-靶點(diǎn)-藥物”相互作用網(wǎng)絡(luò)的方法，它能夠系統(tǒng)地觀察藥物對(duì)疾病網(wǎng)絡(luò)的影響和作用。在中藥領(lǐng)域，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)能夠?yàn)橹兴幍娜藤|(zhì)量控制和質(zhì)量溯源提供指標(biāo)和方法。本研究基于中藥化學(xué)和中藥藥理學(xué)，整合多學(xué)科技術(shù)方法，將指紋圖譜與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)相結(jié)合，通過(guò)對(duì)經(jīng)典名方清寧散進(jìn)行指紋圖譜研究，并構(gòu)建清寧散“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)，不僅對(duì)清寧散質(zhì)量控制指標(biāo)成分的合理性進(jìn)行了驗(yàn)證，而且揭示了清寧散物質(zhì)基礎(chǔ)的相關(guān)性，為后續(xù)研究清寧散及其相關(guān)復(fù)方的作用機(jī)制提供思路，也為清寧散的質(zhì)量控制提供了更全面的參考。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突