新疆維吾爾自治區(qū)阿克蘇地區(qū)牛羊體表蜱攜帶斑點(diǎn)熱群立克次體調(diào)查

馬愛軍，李 佳，金 敏，金依璇，劉詩語，劉凱強(qiáng)，劉 燕，甘 露，巴音查汗·蓋力克

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052；2.新疆維吾爾自治區(qū)阿克蘇地區(qū)動物疫病控制診斷中心，新疆阿克蘇 843000）

蜱是專性吸血體外寄生蟲， 寄生在宿主體表期間，以吸食宿主血液為生，同時會將攜帶的病原傳播給宿主，可導(dǎo)致宿主出現(xiàn)發(fā)熱、組織損傷、身體麻痹、貧血等癥狀［1］。 據(jù)《動物寄生蟲病學(xué)》［2］記載，蜱可攜帶83 種病毒、14 種細(xì)菌、18 種螺旋體、32 種原蟲、1 種衣原體、1 種支原體、1 種巴爾通體和2 種線蟲。在我國，已報道的蜱攜帶的病原體包括真菌、病毒、立克次體、螺旋體和寄生蟲，能傳播的重大疫病有蜱傳回歸熱、立克次體病、新型布尼亞病毒感染引起的發(fā)熱伴血小板減少綜合征、萊姆病、森林腦炎、克里米亞-剛果出血熱和Q 熱［3-7］。

立克次體屬 （Rickettsia） 隸屬于變形菌門（Proteobacteria），α-變形桿菌綱（Alphaproteobacteria）， 立克次體目 （Rickettsiales）， 立克次體科（Rickettsiaceae）［8］。立克次體是一種細(xì)胞內(nèi)專性革蘭陰性菌， 可以寄生于哺乳動物和節(jié)肢動物 （如蜱、螨、蚤和虱）體內(nèi)［9］。 目前，立克次體屬相對被認(rèn)可的分類為以下4 個群：斑點(diǎn)熱群（spotted fever group Rickettsia，SFGR）、 斑 疹 傷 寒 群（typhus group，TG）、 貝 氏 立 克 次 體 群 （Rickettsia bellii group）和加拿大立克次體群（Rickettsia canadensis group）［1］。蜱傳立克次體病主要由屬于立克次體屬斑點(diǎn)熱群的專性胞內(nèi)細(xì)菌引起［1］。 由于癥狀的非特異性，立克次體感染難以診斷。 同時，該病常呈無癥狀感染，因此，感染情況容易被低估，造成其廣泛流行。

目前， 在新疆維吾爾自治區(qū)已有節(jié)肢動物攜帶多種立克次體的報道，如：從伊犁哈薩克自治州邊境地區(qū)的圖蘭扇頭蜱中首次檢測到埃氏立克次體、馬賽立克次體、康氏立克次體印度亞種和暫定巴布瑞立克次體［10］；在民豐縣采集的花蠕形蚤中檢測到斑點(diǎn)熱群立克次體［11］，這也是在世界上首次證實蚤類可攜帶立克次體； 在艾丁湖的短墊血蜱中首次檢測到饒氏立克次體［12］。 阿克蘇地區(qū)地處南疆腹地，地理、氣候條件多樣，蜱種類豐富，為了解該地區(qū)蜱攜帶立克次體情況， 本研究在阿克蘇地區(qū)采集牛羊體表蜱并開展立克次體流行病學(xué)調(diào)查， 以期為該地區(qū)蜱及蜱傳疾病的科學(xué)防控提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品來源

2023 年4—6 月， 在新疆維吾爾自治區(qū)阿克蘇地區(qū)牛羊體表采集蜱574 只， 其中， 阿克蘇市344 只、 溫宿縣93 只、 沙雅縣98 只， 烏什縣39只。每只蜱單獨(dú)分裝于含有70%乙醇的1.5 mL EP管中，存放于4 ℃冰箱保存待檢。

1.1.2 主要試劑

DNA 提取試劑盒、DNA 凝膠回收試劑盒、GoldenViewTM核酸染料， 購自江蘇康為世紀(jì)生物科技有限公司； 大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞、PMD19-T 載體、Solution I， 購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；DL 2 000 DNA Marker、瓊脂糖、10%NaOH 溶液、1×PBS 溶液， 購自北京鼎國生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 主要儀器

Gel Doc+型SDS-PAGE 凝膠成像系統(tǒng)、S1000型PCR 儀，購自美國Bio-Rad 公司；SPX-70 型恒溫培養(yǎng)箱，購自中儀國科（北京）科技有限公司；TG16D 型離心機(jī)， 購自上海生物科技有限責(zé)任公司；HH-W420 型電熱恒溫水浴鍋、SHA-CAB 型數(shù)顯冷凍水浴恒溫振蕩器， 購自常州榮華儀器制造有限公司；可調(diào)節(jié)微量移液槍，購自德國艾本德股份公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 蜱基因組DNA 提取

先將蜱分別用70%酒精、1×PBS 溶液振蕩清洗3 次，平放于濾紙上晾干后裝入研磨袋中，在研缽中加入液氮將其磨碎， 然后加入200 μL 1×PBS溶液吹打混勻轉(zhuǎn)入EP 管中。離心棄上清液后加入20 μL 蛋白酶K，56 ℃水浴3～4 h 至蜱完全溶解。隨后按照DNA 提取試劑盒說明書提取蜱基因組DNA。

1.2.2 立克次體分子生物學(xué)鑒定

以郭麗萍［10］報道的立克次體外膜蛋白B 基因（ompB）引物序列和周鵬［13］報道的立克次體細(xì)胞表面抗原1 基因（sca1）引物序列（見表1），采用PCR 法對立克次體進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。 PCR 反應(yīng)體系（25 μL）包括：Mix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 9.5 μL。 ompB 基因和sca1 基因的PCR 擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，循環(huán)次數(shù)30 次；72 ℃最后延伸1 min。 陽性對照為阿克蘇地區(qū)動物疫病控制診斷中心保存的經(jīng)測序確定的陽性DNA，陰性對照為ddH2O。所有引物合成與基因測序均由北京新時代眾合科技生物公司完成。

表1 立克次體分子生物學(xué)鑒定所用引物信息

1.2.3 目的片段連接、轉(zhuǎn)化及測序

對ompB 基因和sca1 基因進(jìn)行PCR 擴(kuò)增后，將與預(yù)期片段大小一致的陽性條帶，按照DNA 凝膠回收試劑盒說明書進(jìn)行回收。 膠回收產(chǎn)物與PMD19-T 載體連接，連接體系為：膠回收產(chǎn)物5 μL，SolutionI 1 μL，PMD19-T 載體1 μL。 16 ℃水浴30 min， 然后將連接產(chǎn)物加入50 μL 大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，冰浴30 min，熱激45 s，冰浴2 min，加入800 μL 新鮮無抗性的LB 液體培養(yǎng)基混勻。37 ℃培養(yǎng)箱搖菌1 h，5 000 r/min 離心3 min后棄去700 μL 上清液， 剩余150 μL 上清液重懸菌體，在含氨芐西林抗性的平板上涂板。將平皿放入37 ℃培養(yǎng)箱，先正置培養(yǎng)30 min，后倒置培養(yǎng)8～10 h。 待長出單菌落后，挑取菌落進(jìn)行菌液PCR鑒定，出現(xiàn)陽性條帶的菌落培養(yǎng)后進(jìn)行菌液保存。

1.2.4 同源性比對及系統(tǒng)發(fā)育分析

將測序得到的立克次體ompB 基因和sca1 基因序列，運(yùn)用SeqMan 軟件進(jìn)行核苷酸序列處理后再進(jìn)行Blast 分析， 評估與已報道的序列的相似性， 使用MegAlign 軟件進(jìn)行序列間同源性比對。從GenBank 數(shù)據(jù)庫下載參考序列及外群序列，通過MEGA 11.0 軟件，使用鄰接法（NJ）計算操作分類單元之間的遺傳距離， 使用具有1 000 次迭代的自舉過程，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.3 不同地區(qū)蜱攜帶立克次體情況比較

運(yùn)用Excel 2010 軟件統(tǒng)計不同地區(qū)、 不同種類立克次體感染情況，利用公式計算相對優(yōu)勢度。相對優(yōu)勢度（Dr）=蜱攜帶的某種立克次體總數(shù)/蜱攜帶的立克次體總數(shù)×100%。 運(yùn)用SPSS 27.0 統(tǒng)計學(xué)軟件對不同地區(qū)立克次體感染率進(jìn)行χ2檢驗，P<0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 立克次體ompB 基因及sca1 基因PCR 檢測結(jié)果

采用PCR 法擴(kuò)增立克次體ompB 基因和sca1基因， 經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳儀分析， 分別在812 bp和657 bp 處出現(xiàn)陽性條帶（見圖1、圖2），獲得的陽性產(chǎn)物與預(yù)期片段大小一致。

圖1 立克次體ompB 基因PCR 擴(kuò)增結(jié)果

圖2 立克次體sca1 基因PCR 擴(kuò)增結(jié)果

2.2 立克次體ompB 基因序列比對及系統(tǒng)進(jìn)化分析

立克次體ompB 基因測序結(jié)果經(jīng)Blast 比對分析顯示：主要存在2 種斑點(diǎn)熱群立克次體，序列代表樣品TP-544 與喀什地區(qū)葉城縣檢測到的西伯利亞立克次體（Rickettsia sibirica，GenBank 登錄號：OM475652、OM475651、OM475650） 同源性為99.9%；序列代表樣品TP-55 分別與阿克蘇地區(qū)拜城縣和烏什縣以及石河子市分離出的馬賽立克次體 （Rickettsia massiliae，GenBank 登 錄 號 ：OM475664、MF002502、KY069248、OM475662） 同源性為99.9%（見圖3）。

圖3 立克次體ompB 基因序列同源性比對結(jié)果

以普氏立克次體（Rickettsia prowazekii）和貓立克次體（Rickettsia felis）為外群，基于立克次體ompB 基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。 由圖4 可知，序列代表樣品TP-544 與西伯利亞立克次體親緣關(guān)系很近，聚為一簇；序列代表樣品TP-55 與馬賽立克次體親緣關(guān)系較近，聚為一簇。

圖4 基于立克次體ompB 基因構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.3 立克次體sca1 基因序列比對及系統(tǒng)進(jìn)化分析

立克次體sca1 基因測序結(jié)果經(jīng)Blast 比對分析顯示：主要存在2 種斑點(diǎn)熱群立克次體，序列代表樣品TP-527 分別與新疆維吾爾自治區(qū)拜城縣、石河子市、 和田地區(qū)分離到的馬賽立克次體（Rickettsia massiliae，GenBank 登錄號：MF002499、KY069254、OP503169）同源性為100%；序列代表樣品TP-537 與新疆維吾爾自治區(qū)和田地區(qū)檢測到的暫定巴布瑞立克次體 （Candidatus Rickettsia barbariae，GenBank 登錄號：OP503168、ON168948、MF002505）同源性為99.7%～99.8%（見圖5）。

圖5 立克次體sca1 基因序列同源性比對結(jié)果

以查菲埃立克體（Ehrlichia chaffeensis）和日本立克次體（Rickettsia japonica）為外群，基于立克次體sca1 基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。 由圖6 可知，序列代表樣品TP-527 與馬賽立克次體（Rickettsia massiliae）聚為一簇，且同源關(guān)系接近；而序列代表樣品TP-537 與暫定巴布瑞立克次體（Candidatus Rickettsia barbariae）聚為一簇，且遺傳距離接近。

圖6 基于立克次體sca1 基因構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.4 不同地區(qū)蜱感染立克次體情況統(tǒng)計

由表2 可知，從阿克蘇地區(qū)4 個縣（市）采集的574 只蜱樣品中共檢測出87 份立克次體陽性樣本， 總體陽性率為15.16%（87/574）； 在4 個縣（市） 中， 溫宿縣蜱攜帶立克次體陽性率最高，為23.66%（22/93），沙雅縣蜱攜帶立克次體陽性率最低，為4.08%（4/98）。 在檢出的3 種SFGR 基因型中， 暫定巴布瑞立克次體為阿克蘇地區(qū)立克次體優(yōu)勢種（Dr=44.83%，39/87）。 χ2檢驗結(jié)果顯示，阿克蘇地區(qū)不同縣（市）蜱的立克次體感染率存在顯著差異（P=0.001，χ2=15.834）。

3 討論

蜱是專性吸血體外寄生蟲，可以傳播細(xì)菌、病毒、寄生蟲、支原體［14］。在蜱媒立克次體疾病中，主要病原包括立氏立克次體、康氏立克次體、西伯利亞立克次體和非洲立克次體等［15］。蜱寄生在宿主體表期間，引起各種臨床表現(xiàn)可能衍生其他疾病［16-17］。為更精確鑒別立克次體的種類， 本研究采用立克次體的ompB 基因和sca1 基因進(jìn)行雙重表征。

調(diào)查結(jié)果表明，阿克蘇地區(qū)4 個縣（市）均存在蜱感染立克次體的情況，總體感染率（15.16%，87/574）高于2017 年孫響等［18］報道的巴音郭楞蒙古自治州尉犁縣的感染率（12.35%，63/510），低于2017 年李飛［19］報道的阿克蘇地區(qū)庫車市的感染率（16.1%，15/93）和2020 年郗宇［20］報道的阿克蘇地區(qū)庫車市、 阿瓦提縣、 沙雅縣的總體感染率（59.02%，36/61）。 通過與上述研究報道的數(shù)據(jù)比較， 發(fā)現(xiàn)蜱感染立克次體的情況在阿克蘇地區(qū)近幾年一直存在，但感染率呈下降趨勢。

通過ompB 基因和sca1 基因系統(tǒng)發(fā)育分析，本研究中馬賽立克次體與同地區(qū)烏什縣、 拜城縣分離得到的立克次體序列親緣關(guān)系接近， 暫定巴布瑞立克次體與和田地區(qū)分離得到的序列相近。郗宇［20］也從阿克蘇地區(qū)阿瓦提縣、沙雅縣及庫車市檢測到暫定巴布瑞立克次體。 本研究中西伯利亞立克次體與喀什地區(qū)葉城縣分離得到的立克次體關(guān)系接近。喀什地區(qū)、和田地區(qū)及阿克蘇地區(qū)同屬塔克拉瑪干沙漠周邊地區(qū)，氣候條件相近，蜱可通過牛羊交易等方式傳播。從《伯杰系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊》［8］對立克次體的分類不斷更新推測，立克次體的種內(nèi)變異速度很快。 本研究基于sca1 基因測序及比對結(jié)果鑒定出了暫定巴布瑞立克次體，而ompB 基因測序及比對結(jié)果未鑒定出暫定巴布瑞立克次體， 提示該病原還需通過立克次體其他基因的擴(kuò)增來進(jìn)一步確定。

4 結(jié)論

從阿克蘇地區(qū)574 只牛羊體表蜱中共檢測到3 種SFGR 基因型， 分別為暫定巴布瑞立克次體、西伯利亞立克次體、馬賽立克次體，其中，暫定巴布瑞立克次體為優(yōu)勢種。 阿克蘇地區(qū)為蜱及立克次體流行區(qū)，建議加強(qiáng)蜱及蜱傳疾病的防控工作。