新疆維吾爾自治區(qū)塔額墾區(qū)牛源大腸桿菌耐藥性、CTX-M 基因攜帶情況與毒力基因檢測(cè)

趙 耀，邢國(guó)鋒，蘇帆帆，高 攀，彭 健，吳自豪，吳 靜

［1.塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院/新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木動(dòng)物疫病診斷與防控工程實(shí)驗(yàn)室，新疆 阿拉爾 843300；2.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第九師農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所（畜牧科學(xué)研究所），新疆 額敏 834601；3.塔里木大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300］

大腸桿菌是人和動(dòng)物正常腸道菌群的成員之一。 通常，寄居于腸道的大腸桿菌不具有致病性，但當(dāng)致病性大腸桿菌侵入或大腸桿菌寄生部位發(fā)生改變時(shí)，可引起宿主腹瀉、胃腸道感染、尿路感染和乳腺炎等多種疾病［1］。 在奶牛生產(chǎn)上，致病性大腸桿菌可隨母牛乳汁進(jìn)入犢牛胃腸道， 引起犢牛腹瀉，造成經(jīng)濟(jì)損失。

目前， 抗菌藥物療法仍是臨床上治療細(xì)菌感染性疾病的主要方法，但細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生與擴(kuò)散、病原菌在人畜間的水平傳播以及新型抗菌藥物研發(fā)難度大等問題， 使得抗菌藥物的應(yīng)用受到巨大限制。 大腸桿菌產(chǎn)生的超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（extended-spectrum beta-lactamases，ESBLs）可水解含β-內(nèi)酰胺環(huán)的抗菌藥物，是介導(dǎo)大腸桿菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物特別是頭孢菌素類抗菌藥物、單酰胺酶類抗菌藥物以及青霉素耐藥的主要機(jī)制，具有廣泛的水解酶活性［2］。 產(chǎn)ESBLs 的臨床菌株不僅對(duì)β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥，而且還對(duì)氨基糖苷類藥物、氟喹諾酮類藥物、多西環(huán)素、氟苯尼考等耐藥，表現(xiàn)出多重耐藥特性［3］。 ESBLs 編碼基因包括TEM、SHV、CTX-M、OXA 和KPC 基因，均可編碼產(chǎn)生絲氨酸β-內(nèi)酰胺酶［4］。在過去的十幾年中，CTX-M 取代TEM 和SHV 成為流行最為廣泛的ESBLs 編碼基因之一， 成為介導(dǎo)革蘭陰性菌多重耐藥的主要因素［5］。 研究表明，大腸桿菌中攜帶的CTX-M 基因分為5 個(gè)亞型（CTX-M-1G、CTX-M-2G、CTX-M-8G、CTX-M-9G 和CTX-M-25G）［6］，較為常見的是CTX-M-1G 和CTX-M-9G。 前人研究發(fā)現(xiàn)，CTX-M 型ESBLs 耐藥基因可以通過質(zhì)粒、整合子、轉(zhuǎn)座子等可移動(dòng)遺傳元件，在質(zhì)粒與染色體間，或從一個(gè)質(zhì)粒到另一個(gè)質(zhì)粒，或從一種細(xì)菌到另一種細(xì)菌進(jìn)行轉(zhuǎn)移， 具有復(fù)雜的遺傳傳播背景［7-9］，可在人畜間進(jìn)行水平傳播，給世界各地的公共衛(wèi)生安全和動(dòng)物食品生產(chǎn)安全造成嚴(yán)重威脅和重大經(jīng)濟(jì)損失。

目前已在新疆維吾爾自治區(qū)的牛、羊、駱駝、馬、豬、禽和寵物源大腸桿菌中檢測(cè)到CTX-M 型ESBLs 耐藥基因，包括CTX-M-1G 和CTX-M-9G等亞型。 但關(guān)于塔額墾區(qū)牛腹瀉樣本中大腸桿菌攜帶CTX-M 型耐藥基因的流行情況報(bào)道較少。塔額墾區(qū)作為新疆維吾爾自治區(qū)重要的牛養(yǎng)殖地區(qū)之一，攜帶CTX-M 型耐藥基因的大腸桿菌在牛養(yǎng)殖中的潛在危害不容忽視。因此，本研究從新疆維吾爾自治區(qū)塔額墾區(qū)的牛腹瀉糞便中分離大腸桿菌，對(duì)其進(jìn)行分子分型、藥敏試驗(yàn)、CTX-M 型ESBLs 鑒定、耐藥基因檢測(cè)、毒力基因檢測(cè)和生物被膜形成能力檢測(cè)，以期為CTX-M 型大腸桿菌引起的牛感染性疾病的臨床防治提供基礎(chǔ)試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品采集與菌株

從新疆維吾爾自治區(qū)塔額墾區(qū)某牛場(chǎng)采集16 份（約50 g/份）新鮮牛腹瀉糞樣，置無菌管中于4 ℃保存，低溫運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行處理。

大腸桿菌ATCC 25922 和表皮葡萄球菌ATCC 35984 均由新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木動(dòng)物疫病診斷與防控工程實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑和儀器

PCR 引物、Taq PCR Master Mix（2×）試劑盒，購自生工生物工程（上海）股份有限公司；藥敏紙片，購自溫州市泰康生物科技有限公司；胰蛋白胨大豆瓊脂/液體培養(yǎng)基（tryptic soy agar，TSA；tryptic soy broth，TSB）、 水解酪蛋白胨瓊脂/液體培養(yǎng)基（Mueller-Hinton agar，MHA；Mueller-Hinton broth，MHB）、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（MacConkey agar）、伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng)基（eosin-methylene blue agar），購自青島海博生物科技有限公司；EasyPureRBacteria Genomic DNA Kit， 購自北京全式金生物科技有限公司。 PCR 試驗(yàn)所用引物合成及測(cè)序工作由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

PCR 儀、 凝膠成像系統(tǒng)、 電泳儀， 購自Bio-Rad 公司；超凈工作臺(tái)，購自上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司；移液器，購自Eppendorf 公司；高速冷凍離心機(jī)，購自Thermo Scientific 公司；電子天平，購自奧豪斯儀器（上海）有限公司；恒溫培養(yǎng)振蕩器，購自上海智城分析儀器制造有限公司；光學(xué)顯微鏡，購自Zeiss 公司；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，購自Gene Company Limited 公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 大腸桿菌的分離鑒定

用接種環(huán)挑取樣品至TSB 中過夜培養(yǎng)， 劃線接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上，然后挑取圓形、光滑的玫紅色菌落劃線接種于伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng)基上， 將呈黑色金屬光澤的菌落劃線接種在TSA 上進(jìn)行純化。純化后的菌株進(jìn)行革蘭染色鏡檢，將鏡下觀察呈短直桿狀的粉紅色菌株作為疑似大腸桿菌菌株。 利用PCR 方法對(duì)疑似菌株進(jìn)行大腸桿菌特 異 性 基 因phoA 擴(kuò) 增 檢 測(cè) （phoA F：GTGACAAAAGCCCGGACACCATAAATGCC；phoA R：TACACTGTCATTACGTTGCGGATTTGGCGT）［10］。將phoA 基因擴(kuò)增陽性的菌株進(jìn)行16S rDNA 擴(kuò)增（27 F：CCAGGCAAAGAGTTTATGTTGA；1 492 R：GCTATTTCCCTGCCGATA AGAGA）［11］，對(duì)PCR 陽性產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。 16S rDNA 的PCR 擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃最后延伸5 min。將分離菌株的16S rDNA 序列在NCBI 網(wǎng)站上（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/） 與 已 知 序 列 進(jìn) 行BLAST 比對(duì)，確定菌株種屬。

1.2.2 分子分型（系統(tǒng)發(fā)育群和脂多糖核心型）

參照Clermont 等［12］報(bào)道的方法和判斷標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)chuA、yiaA 和TspE4.C2 基因進(jìn)行三重PCR 檢測(cè)，根據(jù)PCR 檢測(cè)結(jié)果判定大腸桿菌的系統(tǒng)發(fā)育群。 PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃最后延伸10 min。

根據(jù)Amor 等［13］發(fā)表的文獻(xiàn)中大腸桿菌脂多糖 （LPS） 核心型PCR 檢測(cè)方法， 檢測(cè)大腸桿菌LPS 核心型。PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性40 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸130 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃最后延伸10 min。

1.2.3 藥物敏感性試驗(yàn)以及耐藥基因檢測(cè)

參考美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)指南（CLSI，2021） 操作要求和判斷標(biāo)準(zhǔn)， 以大腸桿菌ATCC 25922 作為質(zhì)量控制菌株， 使用K-B 紙片法對(duì)牛源大腸桿菌進(jìn)行藥物敏感性檢測(cè)。 使用以下藥物進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，包括β-內(nèi)酰胺類：青霉素G （P，10 μg/片）、 頭孢噻吩 （FUR，30 μg/片）、 美羅培南（MRP，10 μg/片）；氟喹諾酮類：諾氟沙星（NOR，10 μg/片）、恩諾沙星（ENR，5 μg/片）；利福霉素類：利福平（RD，5 μg/片）；四環(huán)素類：替加環(huán)素（TGC，15 μg/片）；氨基糖苷類：鏈霉素（S，10 μg/片）、阿米卡星（AK，30 μg/片）；氯霉素類：氟苯尼考（FFC，30 μg/片）；多肽類：多黏菌素（PB，100 IU/片）；磺胺類：復(fù)方新諾明（SXT，25 μg/片）共8 類12 種藥物。參考文獻(xiàn)［14］中多重耐藥菌的判斷標(biāo)準(zhǔn)，將對(duì)3 類及以上抗菌藥物同時(shí)耐藥的菌株作為多重耐藥（multiple drug resistance，MDR）菌株。

參考文獻(xiàn)［10］中報(bào)道的大腸桿菌耐藥基因引物序列和擴(kuò)增程序，使用PCR 技術(shù)對(duì)β-內(nèi)酰胺類（TEM、CTX-M、SHV、OXA-1）、 氨基糖 苷類［ant（6′）、aac （6′）-Ib、aph （3′）、rmtA）］、 四 環(huán)素 類（tetB、tetM、tetA）、氯霉素類（cmlA、dfrIA、floR）、磺胺類（sul1、sul2）、氟喹諾酮類（parC、gyrA、gyrB、qnrA）、多重耐藥泵相關(guān)類（marA、oqxA、oqxB）、多肽類（mcr-1）共8 大類24 種耐藥基因進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.4 產(chǎn)ESBLs 大腸桿菌鑒定

根據(jù)美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)指南（CLSI，2021） 標(biāo)準(zhǔn)操作要求和判斷標(biāo)準(zhǔn)， 使用頭孢噻肟（CTX）與頭孢噻肟/克拉維酸（TCL）雙紙片法對(duì)牛源大腸桿菌進(jìn)行產(chǎn)ESBLs 表型試驗(yàn)。判斷標(biāo)準(zhǔn)為：若待檢菌株頭孢噻肟抑菌圈≤27 mm， 并在加入克拉維酸后抑菌圈減小5 mm 及以上時(shí)，則判定其產(chǎn)ESBLs。

參考文獻(xiàn)［15］中報(bào)道的方法對(duì)產(chǎn)ESBLs 的大腸桿菌進(jìn)行CTX-M 基因擴(kuò)增檢測(cè)，PCR 反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃最后延伸10 min。 參考文獻(xiàn)［16］對(duì)檢測(cè)出CTX-M 基因的牛源大腸桿菌進(jìn)行CTX-M 基因亞型鑒定（CTX-M-1G、CTX-M-2G 和CTX-M-9G 亞型， 引物序列見表1）。 PCR 反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，52 ℃/55 ℃/60 ℃退 火30 s，72 ℃延 伸1 min，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃最后延伸10 min。

表1 CTX-M 基因亞型引物信息

1.2.5 毒力基因檢測(cè)

參考文獻(xiàn)［17-20］中報(bào)道的大腸桿菌毒力基因引物序列和PCR 反應(yīng)條件，對(duì)大腸桿菌進(jìn)行耶爾菌素（irp2）、沙門菌素（iroN）、有氧肌動(dòng)蛋白（iucD）、curli 菌毛（csgA）、Ⅰ型菌毛（fimH）、P 菌毛（papG）、輔助性黏附素（aatA）、Ⅳ型菌毛（facG）、熱修飾蛋白（ompA）、血清抗性蛋白（issⅠ）、超氧化物酶歧化酶（sodA）、血清抗性基因（bor）、莢膜多糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（kspM）、表面膜蛋白（yijP）、腦血管內(nèi)皮細(xì)胞侵襲素 （ibeB）、 腦膜炎相關(guān)溫度敏感菌毛（mat）、沉默溶血素（sheA）、溶血素（hlyA）、熱敏性腸毒素（toxA）、耐熱性腸毒素（estA）、志賀菌毒素（sxt1 和sxt2）、空泡化自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（vat）、大腸桿菌素（cavC）共24 種毒力基因進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.6 生物被膜形成能力檢測(cè)

采用結(jié)晶紫染色法半定量檢測(cè)生物被膜，將活化后的待檢菌株接于TSB 液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)接至新鮮TSB 中培養(yǎng)至菌液呈云霧狀，用無菌TSB 液體培養(yǎng)基將菌液進(jìn)行1∶200 稀釋，取200 μL 稀釋后的菌液加入96 孔板。 以表皮葡萄球菌ATCC 35984 為陽性對(duì)照， 無菌TSB 液體培養(yǎng)基為空白對(duì)照。 放至恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)36 h 后用無菌水洗去未黏附細(xì)菌。56 ℃烘干后，每孔加入200 μL 1%結(jié)晶紫染色5 min。 染色完成后用PBS 溶液沖洗掉多余染液， 再次烘干后使用丙醇和乙醇（體積比為2∶8）混合溶液進(jìn)行溶解，并測(cè)定OD570nm值。根據(jù)OD570nm值的不同將生物被膜表型分為4 組：OD570nm≤1ODC， 無成膜能力 （-）；1ODC4ODC，強(qiáng)成膜能力（+++）；界定值ODC 為陰性對(duì)照孔的平均值［21］。

2 結(jié)果與分析

2.1 大腸桿菌的分離鑒定結(jié)果

經(jīng)選擇性分離培養(yǎng)、 革蘭染色鏡檢及分子生物學(xué)鑒定 （PCR 產(chǎn)物目的條帶大小為1 500 bp），本研究從新疆維吾爾自治區(qū)塔額墾區(qū)的16 份牛腹瀉糞便樣品中分離出16 株大腸桿菌，分離率為100%。

2.2 分子分型結(jié)果

系統(tǒng)發(fā)育群分群結(jié)果顯示，16 株大腸桿菌中有14 株（87.50%）屬于B1 群，1 株（6.25%）屬于A群，1 株（6.25%）屬于D 群。 LPS 核心型分析表明，15 株菌（93.75%）屬于R1 型，1 株（6.25%）菌屬于R3 型。

2.3 藥物敏感性試驗(yàn)以及耐藥基因檢測(cè)

2.3.1 藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)指南（CLSI，2021）的判斷標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)16 株牛源大腸桿菌藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行判斷，12 種抗菌藥物的藥敏試驗(yàn)結(jié)果見圖1。 16 株大腸桿菌對(duì)不同抗菌藥物的耐藥率如下：青霉素（P）為100%、氟苯尼考（FFC）為50.00%、多黏菌素（PB）為0、阿米卡星（AK）為37.50%、替加環(huán)素（TGC）為0、恩諾沙星（NOR）為31.25%、復(fù)方新諾明（SXT）為68.75%、鏈霉素（S）為43.75%、諾氟沙星（ENR）為18.75%、頭孢噻吩（FUR）為50.00%、利福平（RD）為68.75%、美羅培南 （MRP） 為0。 16 株牛源大腸桿菌中有12 株（75.00%）為多重耐藥菌株。

圖1 牛源大腸桿菌藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

2.3.2 耐藥基因檢測(cè)結(jié)果

對(duì)選取的β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、四環(huán)素類、氯霉素類、磺胺類、氟喹諾酮類、多重耐藥泵相關(guān)類、 多肽類共8 大類24 種耐藥基因進(jìn)行檢測(cè)，共檢出17 種耐藥基因，檢出結(jié)果見圖2。 16 株牛源大腸桿菌中，TEM、CTX-M、ant （6′）、sul1、sul2、parC、gyrA 和marA 8 種基因檢出率為100%，aac（6′）-Ib、floR 和gyrB 3 種基因檢出率為93.75%，tetB 基因檢出率為68.75%，cmlA、oqxA 和oqxB 3種基因檢出率為25.00%，tetM 基因檢出率為18.75%，dfrIA 基因檢出率為12.50%。

圖2 牛源大腸桿菌耐藥基因檢出情況

2.4 產(chǎn)ESBLs 大腸桿菌鑒定結(jié)果

根據(jù)美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)指南（CLSI，2021） 判斷標(biāo)準(zhǔn)，CTX 與TCL 雙紙片法篩選結(jié)果顯示，16 株牛源大腸桿菌中有11 株產(chǎn)ESBLs，占比68.75%。 16 株大腸桿菌中14 株 （87.50%）為CTX-M-1G 基因亞型 （見圖3），1 株 （6.25%）為CTX-M-2G 基因亞型，1 株（6.25%）未檢出所屬基因亞型。

圖3 CTX-M-1G 基因亞型電泳圖

2.5 毒力基因檢測(cè)結(jié)果

從24 種毒力基因中檢測(cè)出12 種毒力基因（見圖4），其中，iroN、ompA、yijP、mat 和sheA 5 種基因檢出率為100%。 其他毒力基因檢出率較低，irp2、iucD、csgA、fimH、issⅠ、sodA、ibeB 基因檢出率 分 別 為 18.75% 、31.25% 、25.00% 、56.25% 、18.75%、87.50%、37.50%。

圖4 牛源大腸桿菌毒力基因檢出情況

2.6 生物被膜形成能力檢測(cè)結(jié)果

16 株牛源大腸桿菌中，有15 株（93.75%）可形成生物被膜，其中，1 株（6.25%）具有強(qiáng)生物被膜形成能力，5 株（31.25%）具有中等生物被膜形成能力，9 株（56.25%）具有弱生物被膜形成能力；1 株（6.25%）沒有生物被膜形成能力。

3 討論

大腸桿菌宿主范圍廣泛，在人、畜禽和野生動(dòng)物中均可寄生，并可造成宿主疾病。 攜帶CTX-M基因的大腸桿菌在全球各地均有報(bào)道， 對(duì)公共衛(wèi)生安全和畜禽養(yǎng)殖與食品安全存在嚴(yán)重威脅。2003—2012 年，Rao 等［22］在中國(guó)廣東、廣西和四川等多個(gè)省份的患病動(dòng)物（雞、豬和水禽）中檢測(cè)到攜帶CTX-M 基因的大腸桿菌（24.10%，677/2 815），并且其對(duì)環(huán)丙沙星、 慶大霉素和氟苯尼考等具有較高的耐藥率（>70.00%）。 田國(guó)寶等［23］于2006—2008 年從全國(guó)19 個(gè)省市97 個(gè)規(guī)模化豬場(chǎng)分離鑒定602 株大腸桿菌，其中，有57 株（9.50%）產(chǎn)ESBLs，35 株為CTX-M 型ESBLs，檢出率61.40%（35/57）。 鄭紅青等［24］從分離自養(yǎng)殖場(chǎng)的1 273 株大腸桿菌中篩選出產(chǎn)ESBLs 陽性菌181 株（14.20%），其中151 株（83.40%）為CTX-M 型。 本研究中分離自塔額墾區(qū)的16 株牛腹瀉糞便大腸桿菌均攜帶CTX-M 基因， 通過雙紙片法驗(yàn)證，其中11 株（68.75%）具有產(chǎn)ESBLs 表型，高于之前的研究。 16 株大腸桿菌對(duì)青霉素（100%）、 利福平（68.75%）和復(fù)方新諾明（68.75%）等耐藥率較高，并且75.00%（12/16） 的大腸桿菌具有多重耐藥表型，耐藥情況較為嚴(yán)重。但所有菌株均對(duì)碳青霉烯類抗菌藥物敏感， 這一現(xiàn)象與文獻(xiàn)報(bào)道類似，產(chǎn)ESBLs 大腸桿菌對(duì)碳青霉烯類抗生素的耐受性較低， 其可能原因是ESBLs 通常不能水解頭孢素類（頭孢西丁、頭孢美唑等）和碳青霉烯類（亞胺培南、美羅培南等）抗菌藥物。 不僅如此，15 株大腸桿菌具有生物被膜形成能力， 生物被膜的形成可以提高大腸桿菌對(duì)抗生素的耐受能力， 并且可以協(xié)助病原菌實(shí)現(xiàn)免疫逃避［25］。 本研究表明新疆塔額墾區(qū)攜帶CTX-M 基因的大腸桿菌在牛身上可能廣泛流行存在， 而且對(duì)臨床常用抗生素具有較強(qiáng)的耐受性。

耐藥基因的產(chǎn)生和傳播是導(dǎo)致細(xì)菌耐藥的重要原因之一， 并且由于其產(chǎn)生和傳播速率遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于抗生素的研發(fā)速度， 因此對(duì)耐藥基因的流行情況進(jìn)行檢測(cè)， 可為細(xì)菌耐藥性的控制和臨床用藥提供試驗(yàn)數(shù)據(jù)。 本研究檢測(cè)的耐藥基因中，TEM、CTX-M、ant （6′）、sul1、sul2、parC、gyrA、marA、aac（6′）-Ib、floR、gyrB 的檢出率較高，與田國(guó)寶等［23］、楊鑫等［26］、杜向黨等［27］的報(bào)道相似。周萬蓉等［28］從四川省10 個(gè)規(guī)?；i場(chǎng)和16 種野生動(dòng)物糞樣中分離鑒定出的124 株菌中sul1 基因的檢出率為47.60%，sul2 基因的檢出率為17.70%， 本研究中sul1（100.00%，16/16）、sul2（100.00%，16/16）基因檢出率高于其報(bào)道， 但本研究中對(duì)磺胺類藥物的耐藥率（68.75%，11/16）與其報(bào)道的豬源分離菌類似（72.00%，72/100）。 這可能與新疆塔額墾區(qū)在飼養(yǎng)管理和臨床藥物有關(guān)， 需要在飼養(yǎng)管理和臨床用藥上對(duì)磺胺類藥物的使用加以規(guī)范。 本研究表明新疆塔額墾區(qū)牛源大腸桿菌可攜帶多種耐藥基因，可能會(huì)造成大腸桿菌耐藥基因的水平傳播，給公共衛(wèi)生安全造成威脅。

致病性大腸桿菌發(fā)揮致病作用需要多種毒力因子的共同協(xié)作，如毒素、菌毛以及毒力島等，其中irp2、tsh、iucD 和issⅠ等基因與大腸桿菌的致病性關(guān)系密切［29］。 呂殿紅等［30］從105 株大腸桿菌中檢出iucD（49.52%）和iss（23.81%）。 與之類似，在本研究中共檢測(cè)到12 種毒力基因， 其中iroN、ompA、yijp、mat、sheA 的檢出率均為100%，其他毒力基因的檢出率較低，并且檢測(cè)到iucD（31.25%）和issⅠ（18.75%）。 這表明新疆塔額墾區(qū)牛源大腸桿菌攜帶多種毒力基因， 這些毒素可在大腸桿菌侵襲宿主與致病時(shí)發(fā)揮重要作用， 存在潛在的致病風(fēng)險(xiǎn)。

分子分型與大腸桿菌的致病性、 免疫原性以及毒力基因分布等特性具有相關(guān)性。研究表明，根據(jù)LPS 核心多糖的不同，LPS 核心型可將大腸桿菌分為R1、R2、R3、R4 和K12，共5 種。 在張宇曦等［31］的研究中R1 為主要核心型，并且R1 核心型大腸桿菌與neuC、cva/cvi、irp2 等毒力基因具有顯著正相關(guān)性， 攜帶毒力基因的數(shù)目高于其他核心型。 與該研究類似，在本研究中的15 株（93.75%）牛源大腸桿菌屬于R1 核心型，只有1 株（6.25%）菌屬于R3 核心型， 并且攜帶irp2 等多種毒力基因。 根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育群分析可將大腸桿菌分為A、B1、B2 和D 群， 其中共生性大腸桿菌主要集中在A 和B1 群， 致病性大腸桿菌主要集中在B2 和D群［32］。 在本研究中，14 株（87.50%）大腸桿菌為B1群，1 株為（6.25%）D 群菌株，1 株為（6.25%）A 群菌株， 表明在新疆塔額墾區(qū)牛腹瀉樣本中存在致病性較強(qiáng)的大腸桿菌， 可能是導(dǎo)致牛腹瀉的主要病原。分子分型可為大腸桿菌的溯源、致病性和耐藥性研究等方面提供支持， 但在本研究中樣本數(shù)量較少，未能進(jìn)行相關(guān)性分析。

4 結(jié)論

本研究調(diào)查了新疆維吾爾自治區(qū)塔額墾區(qū)牛腹瀉源大腸桿菌CTX-M 基因的攜帶情況，并確定其基因亞型主要為CTX-M-1G 基因亞型 （占87.50%）以及CTX-M-2G 基因亞型（占6.25%）。同時(shí)，還發(fā)現(xiàn)16 株牛腹瀉源大腸桿菌對(duì)多種臨床常用抗菌藥物的耐藥情況嚴(yán)重，多數(shù)（12/16，75.00%）具有多重耐藥特征。 分子分型、生物被膜、耐藥基因和毒力基因檢測(cè)結(jié)果也表明塔額墾區(qū)牛源大腸桿菌存在潛在致病風(fēng)險(xiǎn)， 應(yīng)加強(qiáng)對(duì)其流行情況的監(jiān)測(cè)。