不同水稻品種OsVDAC8的表達模式比較與亞細胞定位分析

蔣曉涵 覃永華 劉學群 李開 王春臺

摘要? ［目的］研究OsVDAC8的理化性質和表達模式，為探究OsVDAC8的功能提供基礎。［方法］用生物信息學分析OsVDAC8的結構特征及表達譜，然后通過定量PCR對3個不同水稻品種日本晴（NIP）、粵泰A（YTA）、粵泰B（YTB）不同發(fā)育時期的不同組織中OsVDAC8的表達模式進行分析，并通過BiFC對亞細胞定位進行驗證。［結果］OsVDAC8編碼區(qū)全長1 014 bp，編碼337 aa，生物信息學分析結果顯示，OsVDAC8是具有1個結構域的穩(wěn)定的定位于線粒體的親水蛋白，通過11次跨膜形成特異的桶狀結構。在ATG上游含有13個與水稻生長發(fā)育及脅迫應答相關的順式作用元件。RiceXPro和 MSU Rice Genome Annotation Project水稻基因表達數據庫分析結果表明，NIP中OsVDAC8在生殖生長期的莖和花序出現(xiàn)前后幼穗中表達水平最高，在胚乳和根中的表達量較低。對NIP、YTA、YTB 3個水稻品種中OsVDAC8的表達譜分析結果顯示，OsVDAC8在3個水稻品種四葉期的葉鞘表達水平都非常高，在花粉內容物充實期都很低，但幼穗發(fā)育的不同時期3個品種中表達水平差異很大，NIP中幼穗發(fā)育的整個時期表達量比較穩(wěn)定，YTB中表達量較低，而在YTA幼穗發(fā)育的中后期表達水平逐漸下降。亞細胞定位結果顯示，OsVDAC8定位于線粒體，與預測結果一致。［結論］OsVDAC8在3個水稻品種中表達模式不同，YTB中整個幼穗發(fā)育過程中表達量較低，YTA幼穗發(fā)育的中后期表達水平逐漸下降，而NIP中幼穗發(fā)育的整個時期表達量都比較穩(wěn)定。OsVDAC8定位于線粒體。

關鍵詞? 水稻；OsVDAC8；表達模式；亞細胞定位

中圖分類號? S511? 文獻標識碼 ?A

文章編號? 0517-6611（2024）04-0081-06

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.04.017

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Comparison of Expression Patterns in Different Rice Varieties and Subcellular Localization Analysis of OsVDAC8

JIANG Xiao.han，QIN Yong.hua，LIU Xue.qun et al

（Hubei Provincial Key Laboratory for Protection and Application of Special Plants in Wuling Area of China，Key Lab for Biotechnology of State Ethnic Affairs Commission，College of Life Science，South.Central University for Nationalities，Wuhan，Hubei 430074）

Abstract? ［Objective］To study the physical and chemical properties and expression patterns of OsVDAC8 for providing a basis for further investigation of the function of OsVDAC8.［Method］The structural characteristics and expression profile of OsVDAC8 were analyzed by bioinformatics.The expression patterns of OsVDAC8 in different tissues of three rice varieties，Nipponbare （NIP），Yuetai A （YTA） and Yuetai B （YTB） at different developmental stages were analyzed by quantitative PCR，and the subcellular localization was verified through BiFC.［Result］There were 1 014 bp and encodes 337 aa in the OsVDAC8 coding region.The results of bioinformatics analysis showed that OsVDAC8 is a stable hydrophilic protein with one domain localized to mitochondria，and forms a specific barrel.like structure through 11 transmembrane.There are 13 cis.acting elements related to rice growth and development and stress response in the upstream of ATG.Analysis via rice XPro and MSU Rice Genome Annotation Project rice gene expression database showed that? OsVDAC8 was expressed in the stem and panicle before and after the appearance of inflorescences during the reproductive growth period，and the expression was low in the endosperm and root in NIP.The expression profile analysis of OsVDAC8 in three rice varieties NIP，YTA and YTB? showed that the leaf sheath expression level of OsVDAC8 was very high in the four.leaf stage of the three rice varieties and very low in the pollen content enrichment stage，but very different in the three rice varieties at different stages of young panicle development.In NIP，the expression level was relatively stable during the whole stage of young panicle development，while in YTB，the expression level was low，and in YTA，the expression level decreased gradually during the middle and late stage of young panicle development.The subcellular localization results showed that OsVDAC8 was localized to mitochondria，which was consistent with the prediction results.［Conclution］The expression patterns of OsVDAC8 were different in different rice varieties.OsVDAC8 was localized to mitochondria.

Key words? Rice;OsVDAC8;Expression pattern;Subcellular localization

基金項目? 國家自然科學基金項目（31170226 ）。

作者簡介? 蔣曉涵（1999—），女，湖北荊門人，碩士研究生，研究方向：分子遺傳學。*通信作者，教授，博士，碩士生導師，從事分子遺傳學研究。

收稿日期? 2023-03-19

電壓依賴性陰離子通道 （VDAC）是定位于線粒體外膜的主要轉運蛋白，最初從酵母中分離出來，存在于從真菌到動物和植物的所有生物體中［1］。哺乳動物和昆蟲 VDAC是一個由19條反向平行反向鏈組成的桶狀結構，其中N端螺旋折疊到孔中［2］。所有生物體的VDAC具有相似的基本電生理特性（電導、選擇性和電壓依賴性）［3］。線粒體和細胞質之間的無機離子和代謝物的交換對于許多線粒體功能是必不可少的。多種轉運蛋白（離子通道、載體和ABC轉運蛋白）介導通過線粒體內膜（MIM）的選擇性轉運［4］。相比之下， VDAC是線粒體外膜（MOM）中多種化合物的主要轉運途徑，如無機離子（如K+、Na+和Cl-）、代謝物（如ATP和AMP）和大分子（如tRNA）等［5］。VDAC的開放狀態(tài)對多價陰離子代謝物（如ATP）具有陰離子選擇性和滲透性。而VDAC的關閉狀態(tài)使通道有陽離子選擇性。然而，通道仍然具有足夠的電導性，可以傳輸小離子［6］。VDAC的開放/關閉對機體的細胞器代謝具有重要的調節(jié)作用。除了調節(jié)代謝物轉運的功能外，VDACs還參與了細胞的程序性死亡［7］。

植物VDAC不僅參與植物發(fā)育過程，還參與環(huán)境應激反應［8］。擬南芥 AtVDAC2和AtVDAC4中的T-DNA插入敲除突變導致成熟葉片的生長嚴重遲緩。除atvdac3外，所有敲除突變體的花粉粒數、花粉發(fā)芽率和發(fā)芽花粉管長度均顯著降低［9］。AtVDAC1 能調節(jié)擬南芥對農桿菌感染的能力［10］，AtVDAC2參與鹽脅迫反應途徑［11］。小麥TaVDAC1 的過表達（OE）增強了轉基因擬南芥對鹽脅迫的耐受性并降低了對干旱的抗性［12］。AtVDAC3 和硫氧還蛋白m2（AtTrx m2）之間存在相互作用均調節(jié)ROS的積累，且 AtVDAC3 的過表達增加了H2O2的積累，而AtTrx m2的過表達減少了NaCl處理中H2O2的積累［13］。因此，植物VDACs在調節(jié)植物生長及應對壓力方面發(fā)揮關鍵作用［14］。

通過水稻全基因組掃描鑒定出了8個OsVDAC 基因［15］，并利用生物信息學網站分析了OsVDAC1-8基因精細結構［16］。OsVDAC3在生殖生長期的莖、花序出現(xiàn)前后幼穗及雄蕊成熟花粉中表達水平最高，OsVDAC3的表達可能與雄性的育性相關［17］。OsVDAC5在水稻各個部位不同時期均有高表達［18］， OsVDAC6可能與水稻耐鹽和耐旱有關［19］；osvdac4純合突變體幼苗對ABA脅迫具有更好的抗性［20］。OsVDAC家族中OsVDAC8鮮見報道。筆者通過生物信息學方法分析其表達譜、預測其順式作用元件，并以3個水稻品種（日本晴、紅蓮型不育系粵泰A和保持系粵泰B）不同發(fā)育時期幼穗以及四葉期幼苗根、鞘和葉為材料，對OsVDAC8基因表達模式進行分析，旨在為研究OsVDAC8的功能提供參考。

1? 材料與方法

1.1? 材料

水稻品種日本晴（NIP）、紅蓮型不育系粵泰 A（YTA）及保持系粵泰 B（YTB）種子，HBT-GFP質粒、DH5α菌株均來源于中南民族大學生物技術國家民委重點實驗室。

1.2? 生物信息學分析

1.2.1? OsVDAC8蛋白的理化性質。使用線上工具ExPASy－Protparam（https：//web.expasy.org /protparam/）進行理化性質分析，Protscale線上軟件（https：//web.expasy.org/protscale/）進行親水性、疏水性分析，CDD軟件（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）進行蛋白保守功能區(qū)分析，SOPMA（https：//npsa.prabi.ibcp.fr/cgi.bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）進行蛋白二級結構分析，Swissmodel（https：//www.expasy.org/resources/swiss-model）進行蛋白三級結構預測，Cell-PLoc 2.0（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/）行蛋白亞細胞定位分析。

1.2.2? 順式作用元件預測。

在 NCBI數據庫下載 OsVDAC8（Chr3 LOC_Os03g20750）起始ATG前5 000 bp的DNA序列，利用PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）在線分析預測順式作用元件。

1.2.3? 表達模式分析預測。

從水稻 4-44K基因表達芯片RAPDB中提取NIP OsVDAC8（Chr3 LOC_Os03g20750）在不同生長發(fā)育階段不同組織中的表達譜（RiceXPro，http：//ricexpro.dna.affrc.go.jp/）［21］，通過Hierarchical cluster分析［22］使用MeV （MultiExperiment Viewer）表示基因的表達模式。在MSU Rice Genome Annotation Project水稻基因表達數據庫中 （http：//rice.plantbiology.msu.edu/expression.shtml）下載基因的表達數據，用omega作圖軟件繪圖分析基因的表達模式。

1.3? 不同水稻品種表達模式分析

1.3.1? RNA提取與反轉錄。

水稻種子按常規(guī)方法萌發(fā)及種植。分別取NIP、YTA和YTB四葉期根、葉鞘和葉， 5個不同發(fā)育時期的幼穗［23］（穗生長期 I：小穗長度小于0.4 cm；穗生長期 Ⅱ：小穗長度0.5～1.0 cm；穗生長期Ⅲ：小穗長度1.5～4.0 cm；穗生長期 IV：小穗長度5.0～<10.0 cm；穗生長期V：小穗長度大于10.0 cm），加液氮磨碎成粉末狀，用TriZOL法提取總RNA并反轉。利用CorYeabio公司反轉試劑盒反轉得到cDNA（體系：All-in-One First-Strand Synthesis MasterMix 4 μL，dsDNase 1 μL，Total RNA 3 μg，加Nuclease-Free Water up to 20 μL），將反應體系放置于 PCR儀，50 ℃，15 min；85 ℃，5 s；處理完后立即置于冰上。將cDNA原液稀釋5倍，混勻，吸取1 μL作為模板，用actin引物檢測cDNA質量（15 μL體系：ddH2O 5.7 μL， Fast Mix 1.5 μL，引物各 0.4 μL，cDNA 1.3 μL），PCR反應程序：96 ℃預變性4 min，96 ℃變性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，34個循環(huán)，72 ℃延伸6 min。反應結束后，取6 μL產物進行電泳檢測。引物序列見表1。

1.3.2? 熒光定量PCR。

用水稻actin為內參基因 ，每個樣品3個重復，15 μL反應體系：水4.7 μL，2× qPCR SYBR Green Master Mix 7.5 μL，引物各0.4 μL，cDNA 2.0 μL。反應程序：95 ℃ 30 s，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s；0 ℃保存。根據儀器生成的數據計算該基因在 3種水稻材料不同組織中的表達量。

1.4? OsVDAC8的亞細胞定位

1.4.1? HBT-GFP-OsVDAC8載體構建。

以NIP cDNA為模板，用設計好的HBT-VDAC8-F和HBT-VDAC8-R進行擴增，PCR體系同cDNA檢測，反應程序：97 ℃預變性5 min，97 ℃變性30 s，68 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)，72 ℃延伸8 min。用Axygen切膠回收試劑盒回收后得到目的片段，用BamHI酶切HBT-GFP載體和目的片段，將酶切產物進行回收，用CorYeabio公司同源重組試劑盒重組后再轉化至DH5α感受態(tài)細胞中，涂布含有氨芐青霉素（100 μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基，并挑取飽滿的單克隆，擴大培養(yǎng)后提取質粒DNA進行PCR及酶切鑒定，將陽性克隆測序。

1.4.2? 水稻原生質體的轉化和亞細胞定位分析。

通過聚乙二醇介導法將質粒導入水稻原生質體。使用暗培養(yǎng) 10～13 d NIP的黃化苗浸泡于0.6 mol/L Mannitol 溶液中，在培養(yǎng)皿中用新刀片將黃化苗快速切割成2 mm左右的小片段，靜置8 min 后過濾，加入酶解液（10 mL 酶解液含 7.5 mL 0.8 mol/L Mannitol，1.0 mL 0.1 mol/L MES，0.150 g Cellulose 和0.075 g Macerozyme），置于28 ℃搖床50 r/min振蕩酶解6 h，加入 10 mL W5（50 mL W5 溶液含 5.00 mL 1.54 mol/L NaCl，6.25 mL 1 mol/L CaCl2，1.25 mL 0.2 mol/L KCl 和 1.00 mL 0.1 mol/L MES，加入 ddH2O 定容至 50 mL）后放置10 min，用W5溶液將裁剪好的6層紗布潤濕，通過紗布將酶解液過濾到新的潔凈離心管中，1 000 r/min加減速度均為1，室溫離心5 min，棄上清。加入1 mL W5溶液輕搖重懸原生質體，冰上靜置30 min，取20 μL懸液鏡檢觀察原生質體質量。1 000 r/min加減速度均為1，離心5 min，棄上清，加入預冷的400 μL MMG溶液（10.0 mL MMG 溶液含7.5 mL 0.8 mol/L Mannitol，0.3 mL 0.5 mol/L MgCl2和 0.4 mL 0.1 mol/L MES，加ddH2O 至 10 mL），重懸原生質體后置于冰上。將質粒加入2 mL EP管底，吸取200 μL原生質體懸液加入離心管中，將質粒和原生質體混勻，加入等體積的PEG-CaCl2溶液（1 mL PEG-CaCl2 含 0.55 mL 0.8 mol/L Mannitol，0.4 g PEG 4 000，置于55 ℃孵育3 h，加入 100 μL CaCl2 和50 μL ddH2O），混勻后避光靜置20 min進行轉化。加入4倍體積W5溶液，輕搖混勻以停止轉化，1 000 r/min加減速度均為1，離心5 min。棄上清，加入3倍體積的W5溶液清洗原生質體去除殘留的PEG-CaCl2，1 000 r/min加減速度均為1，室溫離心5 min。重復該步驟1次。棄上清，加入500 μL W1溶液重懸原生質體，25 ℃避光過夜培養(yǎng)，制片及染色處理后置于CLSM下觀察熒光情況。

2? 結果與分析

2.1? OsVDAC8蛋白生物信息學分析

ExPASy-Protparam線上軟件的分析結果表明，OsVDAC8是1個由337 aa構成，分子式為C1617H2577N443O497S16，相對分子量為37 337.47，理論等電點為6.46的蛋白質（圖1）。該蛋白的不穩(wěn)定指數為36.40，表現(xiàn)出穩(wěn)定性，其脂肪系數為72.64，總平均親水系數為-0.316。用Protscale線上網站對OsVDAC8蛋白的親水性進行預測，結果顯示，信號圖中峰值散布于負值的信號明顯大于正值部分（圖1a），OsVDAC8蛋白是一個穩(wěn)定的具有親水性的蛋白。SOPMA結果表明，OsVDAC8蛋白的空間構象可能主要由無規(guī)則卷曲結構構成（圖1b）。Swissmodel結果顯示，OsVDAC8蛋白含有1個Porin3_Tom40結構域，11次跨膜（圖1c），且折疊形成特異的桶狀結構（圖1d和圖1e）。CDD結果表明，該蛋白屬于Porin3超家族（圖1f）。Cell-PLoc2.0結果顯示其定位于線粒體。

2.2? 順式作用元件預測

用PlantCARE （http：∥bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/） 對OsVDAC8 起始ATG前5 000 bp的序列進行生物信息學分析，發(fā)現(xiàn)了13種可信度較高的順式作用元件（表2）。該啟動子含有多種與植物發(fā)育相關順式作用元件，推測這個基因在水稻的生長發(fā)育過程中可能具有重要作用?；蚝信c發(fā)育相關的順式作用元件為ABRE、ARE、CAT-box、CGTCA-motif、P-box、LTR、MBS、TC-rich repeats、GATA-motif、TCA-element、TGA-element等。

2.3? 表達譜的生物信息學分析

利用RiceXpro（http：∥ricexpro.dna.affrc.go.jp/GGEP/sample.list.php）分析了OsVDAC8在水稻品種NIP中48個發(fā)育階段的表達譜。該基因平均信號值對數的層次聚類結果（圖2）表明，其在不同生長發(fā)育階段表達差異顯著，OsVDAC8在所有組織和時期都表達，在胚乳中表達水平最低，OsVDAC8在花序出現(xiàn)前后及子房中表達量較高。

2.4? OsVDAC8在3個水稻品種中表達模式比較

分別取NIP、不育系 YTA和保持系 YTB四葉期根、葉鞘和葉片， 5個不同發(fā)育時期幼穗，用 TriZOL法提取總 RNA，反轉后的cDNA用actin引物檢測，結果顯示，cDNA不含基因組DNA，且能擴增出特異條帶（圖3）。圖4顯示，OsVDAC8在這3個水稻品種的表達模式差異顯著，不育系YTA中OsVDAC8在四葉期葉、葉鞘和幼穗發(fā)育的前期表達水平都較高，根及幼穗發(fā)育花粉內容物充實期表達水平最低；保持系YTB中在四葉期葉鞘表達水平非常高，根、葉及幼穗發(fā)育過程中都是低水平表達； NIP的四葉期葉鞘和枝梗原基分化期中都有非常高的表達，其他時期的表達差異不大，幼穗發(fā)育的整個時期表達量都比較穩(wěn)定。

2.5? OsVDAC8的亞細胞定位分析

用BamHI酶切HBT-GFP質粒DNA并回收，通過同源重組技術將OsVDAC8全長CDS整合到HBT-GFP線性化載體上轉化大腸桿菌，涂布含有氨芐青霉素（100 μg/mL）的LB 固體培養(yǎng)基，挑取單克隆擴大培養(yǎng)后提取質粒 DNA，進行 PCR 及酶切鑒定，將陽性克隆測序（圖 5），結果顯示，HBT-OsVDAC8-GFP 載體構建成功。HBT-OsVDAC8-GFP 轉化水稻黃化幼苗原生質體，培養(yǎng) 10 h 后用線粒體染料染色 15 min，制片后在激光共聚焦顯微鏡下觀察熒光分布，結果顯示，OsVDAC8 定位于線粒體（圖 6）。

3? 討論與結論

擬南芥中有4個VDAC基因，AtVDAC1、AtVDAC2和AtVDAC4在植物生長、葉片和花粉發(fā)育及維持線粒體膜電位的穩(wěn)定狀態(tài)方面發(fā)揮了重要作用。多項證據表明，線粒體深度參與雄性配子體發(fā)育，許多線粒體基因突變影響雄性配子體發(fā)育，甚至導致細胞質雄性不育。AtVDAC1突變影響雌配子發(fā)育。AtVDAC1普遍存在于擬南芥的根、莖、葉、花序、角果、幼苗和種子中，且表達水平都很高［24］。筆者前期研究了OsVDAC4和OsVDAC6的表達譜，發(fā)現(xiàn)OsVDAC6在幼穗早期發(fā)育時期，Nip 與YTB 中OsVDAC6維持較低的表達，而YTA 中OsVDAC6表達水平出現(xiàn)高峰，OsVDAC4在Nip、YTB和YTA中均在花粉粒充實成熟期時OsVDAC4表達量達到最高，推測其可能參與調控水稻花粉粒的成熟過程。OsVDACs在調控水稻育性中的作用尚不清楚，有待深入研究其作用機理。

為了研究OsVDAC8的功能，首先對其進行了生物信息學分析，OsVDAC8是一個穩(wěn)定的親水蛋白，二級結構主要由

無規(guī)則卷曲構成，可能定位在線粒體上；預測的啟動子序列含有與植物生長發(fā)育、繁殖及脅迫應答等密切相關的元件，推測其在水稻生長發(fā)育的不同時期及組織的表達模式可能有差異。RiceXpro結果表明，OsVDAC8在NIP不同生長發(fā)育階段表達差異顯著，在生殖生長期的葉鞘、花序出現(xiàn)前后幼穗中表達水平最高，在胚乳和根中的表達量較低。

分析了OsVDAC8在3個不同品種 NIP、YTA和 YTB幼穗發(fā)育的不同時期和組織中的表達，結果表明，在3個水稻品種中表達模式不同。在NIP中OsVDAC8在根中的表達量最低，在葉鞘到枝梗分化期的表達量較高，在雌雄蕊開始分化到花粉充實完熟期的表達量差別不大；OsVDAC8在YTB與NIP的幼穗發(fā)育時期的表達模式大同小異，而在YTA中隨著雌雄蕊的形成和穎花的發(fā)育OsVDAC8的表達量逐漸降低，YTB和NIP都是雄性可育品種，而YTA是細胞質雄性不育品種，這些結果可能說明OsVDAC8的表達可能與水稻的育性有關聯(lián)。亞細胞定位結果顯示，OsVDAC8定位于線粒體，與預測結果一致。該研究初步分析了OsVDAC8的特性，為深入研究OsVDAC8基因的功能提供基礎。

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