地質(zhì)環(huán)境中生物標(biāo)志物GDGTs分析技術(shù)研究進(jìn)展

戰(zhàn)楠，孫青，李琪，謝曼曼，尚文郁，郝瑞霞

（1. 國(guó)家地質(zhì)實(shí)驗(yàn)測(cè)試中心，自然資源部生態(tài)地球化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100037；2. 北京大學(xué)地球與空間科學(xué)學(xué)院，北京 100871；3. 中國(guó)科學(xué)院地質(zhì)與地球物理研究所，北京 100029）

生物標(biāo)志物，是從生物體中演化而來(lái)的一系列有機(jī)分子，其含量、分布特征及同位素組成能夠反映地質(zhì)歷史時(shí)期的氣候和環(huán)境變化［1-2］。甘油二烷基甘油四醚脂（Glycerol dialkyl glyceryl tetraethers，簡(jiǎn)稱GDGTs）是古菌或細(xì)菌細(xì)胞膜的骨架成分，也是二十世紀(jì)末發(fā)展起來(lái)的一類新興的生物標(biāo)志物［3］。GDGTs在自然界廣泛分布，包括海洋［4-6］、湖泊［7-10］、河流［11］、熱泉［12-13］、土壤［14-17］、泥炭［18-22］等環(huán)境。GDGTs的組成對(duì)外界環(huán)境變化響應(yīng)敏感，并且其核心脂結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、不易降解，能夠長(zhǎng)期保存在沉積環(huán)境中，因此被認(rèn)為是古氣候重建研究的良好載體和有力工具［23-28］。

目前，GDGTs已被應(yīng)用于重建早白堊紀(jì)以來(lái)的氣候環(huán)境演變歷史［29-30］。例如，Chu等［31］利用湖光巖湖泊沉積物中GDGTs重建了末次冰消期以來(lái)中國(guó)熱帶地區(qū)溫度變化，該結(jié)果與格陵蘭冰芯記錄的溫度變化趨勢(shì)大致相同，證實(shí)高緯度冰蓋與熱帶陸地之間存在耦合作用；Bai等［32］利用土壤中GDGTs指標(biāo)重建了青藏高原南部古海拔變化歷史，為揭示印度板塊與歐亞大陸板塊的碰撞過(guò)程和機(jī)制提供了新線索。大量研究表明GDGTs在古氣候重建中發(fā)揮了重要作用，而進(jìn)行古氣候重建的前提是準(zhǔn)確分析GDGTs［29-32］。然而，GDGTs分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜，其同系物、異構(gòu)體理化性質(zhì)相似，并且環(huán)境中GDGTs的含量較低（通常在ng/g水平），又常與其他有機(jī)化合物共存，因此分析難度較高，現(xiàn)有技術(shù)在其分離、純化、準(zhǔn)確定量等方面仍面臨挑戰(zhàn)［1，3］。

本文在前人研究基礎(chǔ)上，概述了GDGTs的結(jié)構(gòu)與分類，總結(jié)并比較了地質(zhì)環(huán)境樣品中GDGTs的提取、分離、純化等前處理方法，評(píng)述了液相色譜-質(zhì)譜、核磁共振波譜、氣相色譜-同位素比值質(zhì)譜等技術(shù)在含量分析、結(jié)構(gòu)鑒定、同位素分析方面的研究進(jìn)展，同時(shí)提出未來(lái)GDGTs分析技術(shù)的發(fā)展方向。

1 GDGTs的結(jié)構(gòu)與分類

環(huán)境中的GDGTs種類多樣，通常所說(shuō)的GDGTs是指微生物的核心脂（Core Lipids，CLGDGTs），其基本結(jié)構(gòu)包括兩個(gè)烷基長(zhǎng)鏈和兩個(gè)甘油分子，烷基長(zhǎng)鏈末端通過(guò)醚鍵與甘油基團(tuán)結(jié)合形成閉合環(huán)狀大分子［33-34］。在活體細(xì)胞中，CL-GDGTs兩端的甘油基團(tuán)上帶有由磷酸鹽、醣基或葡萄糖醛酸等組成的極性頭基，以完整極性膜類脂（Intact Polar Lipids，IPL- GDGTs）的形式存在（圖1），但隨著細(xì)胞的死亡降解，IPL-GDGTs會(huì)丟失極性頭基而轉(zhuǎn)化成CL-GDGTs［16，18，35］。

圖1 環(huán)境中常見(jiàn)的支鏈GDGTs、類異戊二烯GDGTs和完整極性膜類脂GDGTs的分子結(jié)構(gòu)圖Fig. 1 Molecular structures of brGDGTs, isoGDGTs and IPL-GDGTs in the environment.

目前，研究較多的CL-GDGTs主要包括兩大類：類異戊二烯GDGTs（Isopernoidal GDGTs，簡(jiǎn)稱isoGDGTs）和支鏈GDGTs（Branched GDGTs，簡(jiǎn)稱brGDGTs）。兩者的結(jié)構(gòu)既有相似性，又有明顯差異（圖1）。相同點(diǎn)在于：兩者均是由2條長(zhǎng)鏈烷基和2個(gè)甘油分子形成的四醚類環(huán)狀化合物，并且烷基側(cè)鏈上均含有一定數(shù)量的甲基和五元環(huán)或六元環(huán)。不同點(diǎn)在于：①兩者結(jié)構(gòu)中甘油的立體構(gòu)型不同，isoGDGTs為甘油-1-磷酸（G-1-P）構(gòu)型，而brGDGTs為甘油-3-磷酸（G-3-P）構(gòu)型；②兩者烷基側(cè)鏈的骨架不同，isoGDGTs的烷基側(cè)鏈含有40個(gè)碳原子且為類異戊二烯結(jié)構(gòu)［12］，而brGDGTs的側(cè)鏈僅由28個(gè)碳原子組成且為支鏈烷烴結(jié)構(gòu)［6］（圖1）。

isoGDGTs主要包括GDGT-0到GDGT-8（數(shù)字代表其結(jié)構(gòu)中包含的環(huán)戊烷數(shù)量）、泉古菌醇（Crenarchaeol，簡(jiǎn)稱Cren）及其立體異構(gòu)體（Crenarchaeol regioisomer，簡(jiǎn)稱Cren’）（圖1）［12］。isoGDGTs的母源微生物是古菌，包括泉古菌（Crenarchaeota）、奇古菌（Thaumarchaea）、廣古門菌（Euryarchaeota）等［36-37］。其中，泉古菌主要合成含有0～4個(gè)環(huán)戊烷的GDGTs和Cren，氨氧化古菌主要合成Cren及Cren’，而含有4個(gè)環(huán)戊烷以上的isoGDGTs（GDGT-5至GDGT-8）僅在熱泉和嗜熱菌的培養(yǎng)液中發(fā)現(xiàn)［38］。

brGDGTs含有Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ三個(gè)系列，每個(gè)系列之間相差一個(gè)CH2。目前已發(fā)現(xiàn)Ⅱ和Ⅲ系列烷基側(cè)鏈上的甲基可以在C5、C6、C7位置變動(dòng)，分別形成5-甲基、6-甲基和7-甲基等位置異構(gòu)體［8，39-41］。在立體結(jié)構(gòu)方面，brGDGTs的甘油構(gòu)型只有一種反平行結(jié)構(gòu)［42］，這與Cren及Cren’存在平行和反平行2種構(gòu)型不同［43］，并且其烷基側(cè)鏈上的多個(gè)手性碳原子的立體構(gòu)型也是固定的［44］。目前，brGDGTs的生物來(lái)源還不十分明確，但其甲基支鏈結(jié)構(gòu)和甘油立體化學(xué)特征指示它們由細(xì)菌合成［8］，其穩(wěn)定碳、氫同位素表明其來(lái)自兼性異養(yǎng)細(xì)菌［21，45］。培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)也證實(shí)酸桿菌可以合成brGDGTs個(gè)別組分（如Ⅰa、Ⅰc）［46-47］。最新研究表明，除了酸桿菌外，變形菌、消化螺旋菌、擬桿菌、放線菌和疣菌也可能是brGDGTs的潛在母源［25-27，48］。

2 地質(zhì)環(huán)境樣品中GDGTs的提取方法與純化技術(shù)

2.1 GDGTs的提取方法

地質(zhì)環(huán)境樣品中GDGTs的提取方法主要包括Bligh-Dyer法（簡(jiǎn)稱BD法）［12，35，49-50］、超聲萃取法［14，32，51-52］、索氏抽提法［53-56］、加速溶劑萃取法（ASE）［31，57-59］和微波輔助提取法（MAE）［21，59-60］等（表1）。

BD法最早被應(yīng)用于提取真核生物和細(xì)菌中的細(xì)胞膜脂，以氯仿-甲醇（2∶1，V/V）為提取液，后經(jīng)不斷改良，如增加萃取液中甲醇的比例，加入少量的酸（如鹽酸、三氯乙酸、磷酸鹽緩沖液），使其對(duì)脂類物質(zhì)的提取率可達(dá)90%以上［3，59，61］。超聲波萃取法通常采用甲醇、甲醇-二氯甲烷（1∶1，V/V）、二氯甲烷等為提取液，超聲萃取2～3次以保證提取效率［52，59］。索氏抽提法通常采用二氯甲烷-甲醇混合溶劑為萃取液，加熱回流提取24～72h，其萃取效率較高，但溶劑消耗量大且耗時(shí)、費(fèi)力［53-56］。ASE法是目前CL-GDGTs的主流提取方法，通常以二氯甲烷-甲醇為提取溶劑，在溫度100～120℃、壓力1200～1500psi條件下，靜態(tài)萃取5～10min，循環(huán)萃取2～3次［57-59］。2020年Auderset等［62］提出一種ASE分步提取法，通過(guò)不同極性溶劑萃取，從土壤和沉積物中依次分離出正構(gòu)烷烴、長(zhǎng)鏈烯酮及GDGTs三種組分。MAE法是一種利用微波加熱技術(shù)對(duì)固體樣品提取的方法，通常以二氯甲烷-甲醇為提取溶劑，在一定溫度、壓力和微波輻射下，萃取10～20min，該法操作簡(jiǎn)單、快速高效、節(jié)省溶劑、選擇性好，但由于微波反應(yīng)器的普及程度不高，所以目前應(yīng)用還較少［28，59-60］。

不同方法對(duì)GDGTs的提取效率不盡相同［50-51，63-64］。Schouten等［51］比較了超聲萃取、索氏抽提和ASE萃取三種方法對(duì)isoGDGTs的提取效率，發(fā)現(xiàn)三種方法得到的古氣候指標(biāo)（TEX86）值在±1σ誤差范圍內(nèi)基本一致。Huguet等［59］比較了BD法、超聲法、索氏抽提法、ASE、MAE等多種提取方法，認(rèn)為索氏提取法對(duì)于IPL-GDGTs的提取效果最佳，優(yōu)于常用的BD法。隨后，Lengger等［63］比較了BD法、索氏抽提法和ASE法，發(fā)現(xiàn)三種提取方法對(duì)CL-GDGTs的提取效率基本一致且良好，但對(duì)IPL-GDGTs的提取效率則呈現(xiàn)：ASE法＜索氏抽提法＜BD法，其原因可能是較高的溫度（ASE法100℃，索氏抽提法65℃）導(dǎo)致部分IPL-GDGTs降解，而常溫下進(jìn)行的BD法更好地保護(hù)了IPL-GDGTs的極性頭基。王歡業(yè)等［50］對(duì)比了BD法和超聲萃取法的提取效率，指出BD法對(duì)于IPL-GDGTs的提取效果更好，而超聲萃取法對(duì)于CL-GDGTs的提取效率更高，但兩種方法得到的古氣候指標(biāo)（TEX86、MBT、CBT）數(shù)值一致，說(shuō)明不同提取方法并不影響古氣候指標(biāo)的計(jì)算。之后，Yang等［64］也證實(shí)對(duì)于含有極性頭基的OH-GDGTs，使用BD法比超聲萃取法的提取效率更高。綜上可知，CL-GDGTs的提取可以選擇多種方法，而對(duì)于極性較強(qiáng)、熱穩(wěn)定性較差的IPL-GDGTs，應(yīng)盡量選取BD法。

2.2 GDGTs的分離與純化方法

在得到總脂類提取物后，需要從中進(jìn)一步分離、純化GDGTs，這個(gè)過(guò)程通常采用柱層析法［51，59-61］，少數(shù)情況下采用制備液相色譜法［40，65-66］。前者適合常規(guī)的含量分析，后者或兩者聯(lián)用適合GDGTs的結(jié)構(gòu)鑒定和同位素分析。柱層析法通常采用硅膠、氧化鋁（Al2O3）等吸附劑作為固定相填料［51，59-61］。Al2O3作為固定相時(shí)，通常以正己烷-二氯甲烷、甲醇-二氯甲烷為淋洗液［31，51，57］。硅膠作為固定相時(shí)，通常以正己烷-乙酸乙酯、二氯甲烷-乙酸乙酯等為洗脫液［58，66］。收集到的洗脫液通常包括非極性和極性兩部分，其中GDGTs存在于極性組分，將其用氮?dú)獯蹈?，溶解于合適的溶劑，過(guò)濾后即可上機(jī)分析［3，40］。柱層析色譜法的操作性強(qiáng)、分離效果好，但操作繁瑣、溶劑消耗量大、容易產(chǎn)生誤差。Sanchi等［67］提出一種采用固相萃取裝置進(jìn)行自動(dòng)分離、凈化的方法，使操作更簡(jiǎn)單、誤差更小、重現(xiàn)性更高。

對(duì)于IPL-GDGTs，其含有的某些極性頭基在硅膠柱凈化、無(wú)水硫酸鈉干燥、受熱等過(guò)程中極易脫落［63］。為了避免IPL-GDGTs在分離、凈化過(guò)程中損失，Huguet等［59］提出一種間接測(cè)定IPL-GDGTs的方法：首先把總脂類提取物平均分為兩份，一份用Al2O3柱分離、凈化，得到CL-GDGTs的含量；另一份在酸性條件下水解，使IPL-GDGTs丟失極性頭基轉(zhuǎn)化為CL-GDGTs，由此得到的水解產(chǎn)物即是（IPL+CL）-GDGTs的總和。最后，用（IPL+CL）-GDGTs減去CL-GDGTs，差值即為IPL-GDGTs含量。但需注意這種“差減法”的誤差比直接測(cè)量法大，尤其當(dāng)IPL-GDGTs的濃度比CL-GDGTs低時(shí)應(yīng)謹(jǐn)慎使用［59］。

制備液相色譜法主要用于分離在柱層析法中不易分離或易損失的組分，如某些GDGTs單體、異構(gòu)體或帶有不穩(wěn)定頭基的IPL-GDGTs［22，39，66，68］。Weijers等［18］和Weber等［40］利用氨基制備色譜柱，通過(guò)制備液相色譜反復(fù)分離、純化，從brGDGTs混合物中分離出高純度、高濃度的Ib和IIIa5，6組分。Zhu等［66］采用兩根極性正交的半制備色譜柱（一根分離正相體系的二醇基柱，一根分離反相體系的C18柱），通過(guò)制備液相色譜，從總脂類提取物中成功分離出2種帶有糖苷頭基的IPL-GDGTs。

3 地質(zhì)環(huán)境樣品中GDGTs的分析技術(shù)

地質(zhì)環(huán)境中GDGTs的分析主要涉及含量分析、結(jié)構(gòu)鑒定、同位素分析三方面，相關(guān)分析主要借助于高效液相色譜-質(zhì)譜儀（HPLC-MS）［3，51-54］、氣相色譜-質(zhì)譜儀［3，63，69-70］、核磁共振波譜儀［18，41，71］和氣相色譜-同位素比值質(zhì)譜儀［40，65，72］。

3.1 GDGTs含量分析

CL-GDGTs的分析通常采用高效液相色譜-大氣壓化學(xué)電離源-質(zhì)譜法（HPLC-APCI-MS）。色譜柱一般選擇氨基柱、氰基柱、硅膠柱等正相色譜柱，流動(dòng)相一般選擇正己烷-異丙醇［51，73］或者正己烷-乙酸乙酯［55，74］。采用2根UPLC色譜柱或4根HPLC色譜柱串聯(lián)，可以使brGDGTs的同分異構(gòu)體（如Ⅲa5、Ⅲa5，6、Ⅲa6與Ⅲa7）達(dá)到較好的分離效果［8，39-41，73］。在正相液相色譜體系下，GDGTs各組分的出峰順序按照其質(zhì)荷比（m/z）從大到小依次排列（圖2）。isoGDGTs的[M+H]+范圍在m/z1286～1304之間，出峰順序通常為：GDGT-0＞GDGT-1＞ GDGT-2＞GDGT-3＞GDGT-4=Cren＞Cren’。brGDGTs的[M+H]+范圍在m/z1018～1050之間，3個(gè)系列的整體出峰順序?yàn)椋孩螅劲颍劲?，系列?nèi)的出峰順序?yàn)椋孩骯＞Ⅲb＞Ⅲc，IIa＞IIb＞IIc，Ia＞Ib＞Ic，但相鄰系列組分的出峰順序有時(shí)存在交叉的情況［8］。同分異構(gòu)體（如Ⅲa、Ⅲb）的出峰順序與其烷基側(cè)鏈上甲基的位置有關(guān)，通常為：C5＞C6＞C7（圖2）。

圖2 內(nèi)蒙古雙溝山天池湖泊沉積物中GDGTs的液相色譜總離子流圖和提取離子流圖Fig. 2 Total ion chromatogram (TIC) and extracted ion chromatogram (EIC) of GDGTs identified in lake sediment of Lake Shuanggoushan, Inner Mongolia. The chromatogram generated by HPLC-APCI-MS showing the elution order of brGDGTs and isoGDGTs with [M+H]+ ions.

IPLs-GDGTs帶有極性頭基，通常采用反相液相色譜（RP-HPLC）-電噴霧離子源-質(zhì)譜儀（ESI-MS）分析［59，66，75］。Zhu等［66］運(yùn)用反相超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜，建立了一種可同時(shí)分析IPL-GDGTs和CL-GDGTs的方法，該方法比傳統(tǒng)的正相方法（HPLC-APCI-MS）的靈敏度更高、色譜峰形更尖銳，并且能夠得到與之一致的古氣候指標(biāo)值。在該方法基礎(chǔ)上，Chen等［75］將RP-HPLC-ESI-MS與多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）技術(shù)結(jié)合，建立了一種更適合分析IPL-GDGTs的方法，其采用的MRM模式比常用的選擇離子掃描（SIM）模式具有更好的特異性和靈敏度，提高了方法的準(zhǔn)確度、穩(wěn)定性及重現(xiàn)性，并且檢出限更低。

在質(zhì)譜方面，單四極桿質(zhì)譜和三重四極桿質(zhì)譜是當(dāng)前GDGTs分析最常用的質(zhì)譜檢測(cè)器。定量分析通常在SIM模式下進(jìn)行，該模式通過(guò)采集GDGTs各組分的特征離子[M+H]+，使其靈敏度和重現(xiàn)性比全掃模式更好［51］。但由于四極桿質(zhì)譜的分辨率不高，SIM模式會(huì)導(dǎo)致isoGDGTs和brGDGTs產(chǎn)生不同程度（18%～36%）的離子損失，在一定程度上降低了定量結(jié)果及古氣候指標(biāo)的準(zhǔn)確性［76］。近年來(lái)，功能強(qiáng)大的高分辨率質(zhì)譜也開始應(yīng)用于GDGTs的分析，如靜電場(chǎng)軌道阱質(zhì)譜（Orbitrap-MS）［77-78］、傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜（FTICRMS）［55，79］。高分辨質(zhì)譜與HPLC聯(lián)用，可以實(shí)現(xiàn)樣品中GDGTs結(jié)構(gòu)和組成的全面表征，并有助于GDGTs未知組分的鑒定。在離子源方面，CLGDGTs極性較低，所以通常采用常壓化學(xué)電離子源（APCI）。與電噴霧源（ESI）相比，APCI源的離子產(chǎn)率更高、準(zhǔn)分子離子峰的強(qiáng)度更高［3，51］。近年來(lái)，也報(bào)道了采用大氣壓光致電離（APPI源）成果［77，79］。APPI源是一種新電離技術(shù)，其電離原理與APCI源相似，但其電離能量更低，對(duì)弱極性的CL-GDGTs的電離效果比APCI源更好，因此在未來(lái)分析中有很大潛力［77，79］。

目前，GDGTs定量分析主要采用內(nèi)標(biāo)法，通常以GTGT-C46作為內(nèi)標(biāo)［47］，根據(jù)內(nèi)標(biāo)與待測(cè)組分[M+H]+離子的峰面積及相對(duì)校正因子來(lái)計(jì)算GDGTs含量。但實(shí)際上，C46內(nèi)標(biāo)與GDGTs各組分的理化性質(zhì)、色譜行為、離子化效率、質(zhì)譜響應(yīng)等并不完全相同，因此根據(jù)其計(jì)算的GDGTs各組分含量并不十分準(zhǔn)確。今后，隨著GDGTs商用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及同位素內(nèi)標(biāo)的出現(xiàn)，將改善定量分析的準(zhǔn)確性。

不同化合物在不同儀器上或同一臺(tái)儀器在不同時(shí)間檢測(cè)時(shí)，會(huì)因?yàn)閮x器的設(shè)置參數(shù)或狀態(tài)的改變而導(dǎo)致響應(yīng)值發(fā)生改變，因此開展GDGTs分析方法驗(yàn)證十分必要。2009年，Schouten等［80］組織了全球15個(gè)實(shí)驗(yàn)室間的比對(duì)，采用HPLC-APCI-MS法對(duì)2個(gè)海洋沉積物樣品進(jìn)行分析，通過(guò)比較2種GDGTs古氣候指標(biāo)來(lái)評(píng)估分析方法的準(zhǔn)確性和可靠性。比對(duì)結(jié)果表明，TEX86指標(biāo)在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的重復(fù)性結(jié)果和實(shí)驗(yàn)室間的再現(xiàn)性結(jié)果均較好，對(duì)應(yīng)的溫度誤差分別在1～2℃之間和3～4℃之間；而BIT指標(biāo)在同一實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的重復(fù)性較好，但實(shí)驗(yàn)室間的再現(xiàn)性結(jié)果不理想，其原因可能是BIT指標(biāo)同時(shí)涉及brGDGTs和isoGDGTs，而兩者在不同質(zhì)譜儀上的響應(yīng)差異較大，導(dǎo)致BIT值有較大不同［80］。2013年，第二輪全球?qū)嶒?yàn)室間比對(duì)分析表明兩種指標(biāo)的結(jié)果均比第一次有所改善，TEX86指標(biāo)的再現(xiàn)性溫度誤差降低至1.3～3.0℃，與海洋其他古溫度指標(biāo)的誤差相近［81］。但BIT指標(biāo)實(shí)驗(yàn)室間的再現(xiàn)性結(jié)果依然不理想，這可能與儀器結(jié)構(gòu)、參數(shù)設(shè)置等有關(guān)。Escala等［60］和Schouten等［80-81］建議后續(xù)可采用已知BIT值的樣品先對(duì)質(zhì)譜進(jìn)行校正，再進(jìn)行BIT指標(biāo)的測(cè)定。

3.2 GDGTs結(jié)構(gòu)鑒定

GDGTs的結(jié)構(gòu)鑒定通常借助高分辨質(zhì)譜（HRMS）、氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）和核磁共振波譜（NMR）［18，42，63，70］。依據(jù)HRMS提供的質(zhì)子化分子離子峰的精確質(zhì)量數(shù)及其同位素峰的相對(duì)豐度，可以推測(cè)GDGTs的分子式［77，79］。再根據(jù)質(zhì)譜的一級(jí)、二級(jí)碎片離子，結(jié)合質(zhì)譜裂解規(guī)律，可以推測(cè)出GDGTs可能分子結(jié)構(gòu)［41-42］。但是，應(yīng)用HRMS不能揭示同分異構(gòu)體間的微小結(jié)構(gòu)差異（如Ⅲa5與Ⅲa6）［39］。

“醚鍵裂解法”是將結(jié)構(gòu)復(fù)雜的GDGTs轉(zhuǎn)化為分子量更小、結(jié)構(gòu)更簡(jiǎn)單的組分，以便進(jìn)行更精準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)解析。該法通過(guò)裂解GDGTs分子結(jié)構(gòu)中的醚鍵，將其轉(zhuǎn)化為鹵代烴和甘油兩部分，再將鹵代烴還原為支鏈烷烴，之后用GC-MS對(duì)烷烴進(jìn)行分析。根據(jù)特征碎片離子、保留時(shí)間、保留指數(shù)等信息，結(jié)合文獻(xiàn)和質(zhì)譜標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)，可以推斷出烷烴部分的結(jié)構(gòu)，再結(jié)合甘油的構(gòu)型，最終得到GDGTs完整的分子結(jié)構(gòu)［39-41，72，82-83］。在電子轟擊電離源下，烷烴的支鏈節(jié)點(diǎn)通常會(huì)優(yōu)先斷裂，形成強(qiáng)度較高的特征碎片離子，這一規(guī)律可以用來(lái)判斷烷烴側(cè)鏈上甲基支鏈的位置，從而實(shí)現(xiàn)5-甲基、6-甲基等brGDGTs位置異構(gòu)體的鑒別［39-41］。上述方法最初用于鑒定isoGDGTs的分子結(jié)構(gòu)［69-70］，近來(lái)也被用于brGDGTs和OHGDGTs等物質(zhì)的結(jié)構(gòu)解析［39-41，82］。

常規(guī)氣相色譜的工作溫度上限在300～350℃之間，難以將GDGTs汽化，而高溫氣相色譜（HT-GC）的工作溫度上限達(dá)到400～450℃，可以將GDGTs汽化而實(shí)現(xiàn)直接分析。Weijers等［18］和Pancost等［72］運(yùn)用配有火焰離子化檢測(cè)器的HT-GC，在140～420℃的程序升溫下實(shí)現(xiàn)CL-GDGTs的分析。Sutton等［83］利用HT-GC結(jié)合飛行時(shí)間質(zhì)譜儀，在20min內(nèi)實(shí)現(xiàn)isoGDGTs的快速分析。

核磁共振氫譜（1H-NMR）、碳譜（13C-NMR）及二維核磁共振技術(shù)（如HSQC、HMBC、COSY）也是解析GDGTs結(jié)構(gòu)時(shí)常用的分析手段，其提供的大量分子結(jié)構(gòu)信息可與HPLC-MS、GC-MS等結(jié)果相互驗(yàn)證［18，44，71，82］。但NMR的局限性在于其靈敏度較低且為非選擇性分析，故要求測(cè)試樣品的純度高（通常＞90%），并且待測(cè)組分的含量達(dá)到mg級(jí)才能保證信號(hào)強(qiáng)度。但是，將GDGT單體從結(jié)構(gòu)相似的同系物、異構(gòu)體中分離、富集并不容易，Liu等［82］從1kg干重的海洋沉積物中僅分離出0.6mg的GDGT單體。鑒于此，目前只有個(gè)別GDGTs組分（如Ⅰa、Ⅰb、Ⅱa）的結(jié)構(gòu)得到NMR驗(yàn)證［18，44，71］。今后，可以嘗試應(yīng)用天然產(chǎn)物、藥物代謝等領(lǐng)域常用的HPLC-NMR聯(lián)用技術(shù)，簡(jiǎn)化操作流程，實(shí)現(xiàn)更高效、便捷的GDGTs結(jié)構(gòu)解析［84］。

3.3 GDGTs同位素分析

GDGTs的同位素組成蘊(yùn)含著重要的生物和環(huán)境信息［65，85-90］。在缺氧環(huán)境中，可以通過(guò)測(cè)定沉積物中isoGDGTs的δ13C值，揭示是否存在甲烷厭氧氧化古菌［61］。湖泊沉積物和湖水懸浮顆粒物中brGDGTs的δ13C值，可以幫助判斷brGDGTs的來(lái)源及其母源細(xì)菌的代謝途徑［87-88］。海洋中isoGDGTs的δ13C值可以指示在古海洋生產(chǎn)力的演變歷史［89］。海洋沉積物中isoGDGTs的14C年齡可以揭示其母源微生物的來(lái)源［68］，還可以與海洋中其他生物標(biāo)志物（如浮游有孔蟲、長(zhǎng)鏈烯酮）的年齡對(duì)比驗(yàn)證［90-91］。

當(dāng)前，穩(wěn)定碳、氫同位素分析主要采用氣相色譜-同位素比值質(zhì)譜（GC-C/TC-IRMS）技術(shù)［40，61，65，87-89］。在分析前，GDGTs先要經(jīng)過(guò)“醚鍵裂解”轉(zhuǎn)化為分子量更小、揮發(fā)性更強(qiáng)的烷烴，然后再進(jìn)行GC-C/TCIRMS分析［61，69-70，85］。Pearson等［89］利用線軸微燃燒技術(shù)建立一種直接測(cè)定isoGDGTs碳同位素的方法，避免了“醚鍵裂解”過(guò)程可能引起的同位素分餾效應(yīng)，提高了方法的準(zhǔn)確度和精密度（在1σ范圍內(nèi)誤差僅為±0.25‰），但該法由于涉及儀器改裝因此并不普及。Lin等［86］提出一種測(cè)定IPL-GDGTs糖苷頭基δ13C的方法，該法將IPL-GDGTs水解得到的糖苷頭基衍生、凈化，再由GC-C-IRMS測(cè)定，結(jié)果表明糖苷頭基比其烷烴骨架更富集δ13C（偏移量可達(dá)15‰），這種分子內(nèi)穩(wěn)定同位素分測(cè)試技術(shù)為探索GDGTs頭基和骨架的代謝提供新的視角和方式。

GDGTs氫同位素組成可以指示氫的來(lái)源、重建降水、海拔等變化趨勢(shì)，但目前相關(guān)研究較少［22，70］。Huguet等［22］應(yīng)用穩(wěn)定同位素探針技術(shù)，將富含brGDGTs的天然泥炭樣品在重水和13C標(biāo)記的碳酸氫鈉中培養(yǎng)，然后利用IR-GCMS測(cè)定培養(yǎng)后樣品brGDGTs的δD和δ13C值，首次量化了泥炭中brGDGTs的生產(chǎn)率。Kaneko等［70］提出了一種運(yùn)用GCIRMS測(cè)定isoGDGTs烷基側(cè)鏈δD值的方法，該法通過(guò)“醚鍵裂解法”將isoGDGTs轉(zhuǎn)化為鹵代烴，利用H2/PtO2將鹵代烴還原為飽和烴，再通過(guò)GCIRMS分析獲得氫同位素組成。結(jié)果表明，醚鍵裂解過(guò)程不存在δD分餾效應(yīng)，而H2/PtO2氫化過(guò)程存在一定程度的δD分餾，但通過(guò)質(zhì)量平衡校正，可以獲得較準(zhǔn)確的δD值［70］。2021年，Lengger等［92］利用HT-GC結(jié)合IRMS開發(fā)了一種可直接測(cè)定GDGTs中δD值的方法，該法不需要“醚鍵裂解”等過(guò)程，操作簡(jiǎn)單、分析誤差小，但由于HT-GC尚未普及，因此其應(yīng)用仍然有限。

近年來(lái)，放射性碳同位素技術(shù)在GDGTs高精度定年、古環(huán)境示蹤、海洋碳循環(huán)等研究中逐漸興起［68，90-91］。放射性碳同位素的分析主要借助加速器質(zhì)譜儀，測(cè)試樣品的最低含碳量約為100μg C［93］。為滿足測(cè)試要求，一般需要從大量環(huán)境樣品中提取、分離、純化，才能獲取足夠量、純度高的GDGTs單體［18，90］，如Haghipour等［94］從3kg土壤樣品中僅提取出15μg C。2021年，Gies等［90］提出一種無(wú)需分離GDGTs單體，僅按brGDGTs和isoGDGTs分類即可測(cè)定14C的方法，將初始的取樣量降低至500g，大幅簡(jiǎn)化了前處理操作，并且對(duì)于年齡小于1800y的樣品，只需20μg C的上樣量就可以獲得準(zhǔn)確、精密的14C年齡結(jié)果。

4 結(jié)語(yǔ)與展望

近二十年來(lái)，GDGTs的分析技術(shù)和方法取得長(zhǎng)足進(jìn)步，這為古氣候重建、全球氣候變化等研究提供了極大助力。目前，地質(zhì)環(huán)境中GDGTs的樣品前處理方法已相對(duì)成熟，以HPLC-MS、GC-MS、NMR、GC-IRMS為主的技術(shù)手段也成為分析GDGTs的重要工具，但現(xiàn)有方法在分離、純化、準(zhǔn)確定量等方面仍然存在一些問(wèn)題亟待解決：①標(biāo)準(zhǔn)化問(wèn)題。當(dāng)前已有多種GDGTs分析方法，但尚缺乏測(cè)定GDGTs的標(biāo)準(zhǔn)化方法和程序，不同實(shí)驗(yàn)室和實(shí)驗(yàn)人員使用的前處理方法、儀器方法和數(shù)據(jù)處理方法的差異，均會(huì)影響結(jié)果的比較和重復(fù)性的驗(yàn)證。②方法效率問(wèn)題?，F(xiàn)有提取、分離和純化方法較為復(fù)雜，操作難度較高；HPLC-MS定量分析用時(shí)較長(zhǎng)，分析效率較低。③GDGTs未知組分問(wèn)題。環(huán)境中仍然存在一些結(jié)構(gòu)未知的GDGTs新組分。樣品中這些未知組分的存在，不僅可能影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，還可能給古氣候指標(biāo)帶來(lái)誤差。

因此，建議今后分析方法的發(fā)展應(yīng)重點(diǎn)考慮以下方面：①建立GDGTs標(biāo)準(zhǔn)分析方法。亟需開展GDGTs分析方法標(biāo)準(zhǔn)化研究，并建立相應(yīng)的質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)體系，從而提高分析結(jié)果的可靠性及可比性。②開發(fā)便捷、高效的GDGTs分析方法。包括：開發(fā)分離性能更好的色譜柱，以簡(jiǎn)化現(xiàn)有串連2～4根色譜柱的HPLC方法；開發(fā)操作更簡(jiǎn)單、自動(dòng)化程度更高的提取、分離及凈化方法；運(yùn)用高精度的HRMS，開發(fā)更加靈敏、準(zhǔn)確的定性及定量方法。③開展環(huán)境中GDGTs未知組分的識(shí)別與結(jié)構(gòu)解析研究。綜合運(yùn)用HPLC-HRMS、GC-MS、NMR等技術(shù)手段，進(jìn)一步識(shí)別環(huán)境中GDGTs未知組分，從而更好地表征環(huán)境中GDGTs的分布及組成。④加強(qiáng)GDGTs同位素技術(shù)方法研究。亟待開發(fā)進(jìn)樣量更小、操作更簡(jiǎn)便的同位素技術(shù)及方法，并拓展其應(yīng)用。

BRIEF REPORT

Glycerol dialkyl glycerol tetraethers (GDGTs) are lipid biomarkers that are widely distributed in geological environments, including oceans[4-6], lakes[7-10], river estuaries[11], hot springs[12], soil[14-17], and peats[18-22]. They are sensitive to environmental changes and can effectively record paleoclimate information over a range of geological time scales. GDGT-based proxies are widely used in the reconstruction of terrestrial and marine paleoenvironments[23-28]. However, the accurate analysis of GDGTs is challenging due to their diverse nature and difficulties in their separation, purification, and quantification.

GDGTs in the environment exist in two forms: intact polar lipids (IPL-GDGTs) or as core lipids (CLGDGTs)(Fig.1). CL-GDGTs can be further classified into two types based on their structural differences:isoprenoid GDGTs (isoGDGTs) and branched GDGTs (brGDGTs). IsoGDGTs are primarily composed of GDGT-0 to GDGT-8,Crenarchaeol, and its stereoisomer. IsoGDGTs are produced by archaea[36-37], while the biological origin of brGDGTs is still uncertain, although there is evidence to indicate that their potential producers are heterotrophic bacteria, includingAcidobacteria,Proteobacteria,Nitrospira,Bacteroidetes,Actinobacteria, andVerrucomicrobia[25-27,48]. BrGDGTs consist of three series (Ⅰ, Ⅱ, and Ⅲ), each of which differs by a methylene group. The alkyl side chains of brGDGTs in series Ⅱ and Ⅲ may possess various methyl groups at the C5, C6,and C7positions, leading to the formation of positional isomers, such as 5-methyl, 6-methyl, and 7-methyl brGDGTs[8,39-41].

Extraction methods for GDGTs from environmental samples mainly involve the Bligh-Dyer method[12, 35, 49-50], ultrasonic extraction[14, 32, 51-52], Soxhlet extraction[53-56], accelerated solvent extraction(ASE)[31, 57-59] and microwave-assisted extraction (MAE)[27, 59-60]. The Bligh-Dyer method was originally used to extract cell membrane lipids from eukaryotes and bacteria, but modifications have been made to increase extraction rates[3,59,61]. Ultrasonic extraction usually uses methanol, methanol-dichloromethane, and dichloromethane as the extraction solution[52,59]. Soxhlet extraction is highly efficient but demands a large amount of solvents and is timeconsuming[53-56]. ASE is the most commonly used method for extracting CL-GDGTs, using dichloromethanemethanol as the extraction solvent[57-59]. MAE is a simple, fast, efficient, and selective method for solid samples, but its application is limited by the lack of widespread microwave reactor availability[28,59-60].

Different GDGTs extraction methods have been compared in several studies[50-51,63-64]. Schouten et al.[51]compared the efficiency of three extraction methods: ultrasonic extraction, Soxhlet extraction, and ASE extraction for isoGDGTs. They found that the TEX86values obtained by the three methods were almost identical within ±1σerror. Wang et al[50]also compared the efficiency of Bligh-Dyer and ultrasonic extraction. They found that the Bligh-Dyer method was more effective in extracting IPL-GDGTs, whereas the ultrasonic extraction method was more efficient in extracting CL-GDGTs. However, the values of palaeoclimatic indicators (TEX86, MBT, and CBT)obtained by both methods were identical, indicating that the different extraction methods did not affect the value of palaeoclimatic proxies[50]. Yang et al.[64]later confirmed that the Bligh-Dyer method was more efficient than the ultrasonic extraction in extracting OH-GDGTs that contain polar head groups. In summary, the Bligh-Dyer method is preferable for IPL-GDGTs due to their greater polarity and lower thermal stability, while various extraction methods can be used for CL-GDGTs.

To isolate and purify GDGTs from environmental samples, column chromatography[51,59-61]is commonly used along with preparative liquid chromatography (Prep HPLC) in some cases[40,65-66]. Prep HPLC is mainly used to separate components that are hard to fractionate or prone to loss in column chromatography, such as certain GDGT monomers, isomers, or IPL-GDGTs with unstable head groups[22,39,66,68]. The Ib and IIIa5,6components were successfully isolated from mixtures of brGDGTs through Prep HPLC along with repeated separation and purification[18,40]. Silica and alumina (Al2O3) are commonly used as stationary phases. The elution process yields nonpolar and polar fractions. GDGTs are usually found in the polar fraction and can be further analysed for structural identification and isotopic analysis using Prep HPLC or a combination of both methods. During the process of separating and purifying GDGTs, some IPL-GDGTs may lose their polar head groups due to poor stability. To address this issue, Huguet et al.[59]proposed an indirect method for determining IPL-GDGTs. The total lipid extract was divided into two equal parts. The first part was purified through an Al2O3column to obtain the content of CL-GDGTs. The second part underwent acid-hydrolysis, which converted IPL-GDGTs into CL-GDGTs by losing their polar head groups. The hydrolysis product was the sum of (IPL+CL)-GDGTs. The quantity of IPLGDGTs was determined by subtracting CL-GDGTs from (IPL+CL)-GDGTs. However, the error of this “ subtraction method” is greater than that of the direct measurement. Therefore, this method should be used with caution,especially when the concentration of IPL-GDGTs is lower than that of CL-GDGTs[59].

The analysis of GDGTs in the geological environment mainly involves content determination, structural identification, and isotopic analysis.This is commonly done using high-performance liquid chromatography-mass spectrometry (HPLC-MS)[3,51-54], gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS)[3,63,69-70], nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR)[18,41,71], and gas chromatography-isotope ratio mass spectrometry (GC-IRMS)[40,65,72].CL-GDGTs are usually analyzed by HPLC-APCI-MS, while IPLs-GDGTs with polar head groups are usually analyzed by RP-HPLC-ESI-MS. Good separation of 5-, 6-, and 7-methyl isomers of brGDGTs can be achieved by using four HPLC columns or two UPLC columns in tandem[8,39-41,73]. In a normal-phase HPLC system, the peaks of GDGTs are sorted by their mass-to-charge ratios (m/z) from the largest to the smallest, as shown in Fig. 2.

Single and triple quadrupole mass spectrometry are commonly used for the GDGTs analysis through HPLCMS. SIM mode is preferred for quantification due to its higher sensitivity and reproducibility than the full-scan mode, which captures the characteristic ions [M+H]+of each GDGT component[51]. However, low resolution can cause ion loss for isoGDGTs and brGDGTs, which affects the accuracy of quantitative results[76]. Recently, highresolution mass spectrometry, such as Orbitrap-MS[77-78]and FTICR-MS[55,79], has been applied to the GDGTs analysis. HPLC-HRMS provides a comprehensive characterization of the structure and composition of GDGTs in environmental samples, offering great potential for future analyses.

Structure identification of GDGTs involves various techniques such as HRMS, GC-MS, and NMR techniques[18,42,63,70]. The molecular formulae of GDGTs can be determined by HRMS through precise mass measurement of the protonated molecular ion peaks and isotopic peaks evaluation[77,79]. Conventional GC has a temperature limit of 300-350°C, which makes it impossible to vaporize GDGTs directly. However, HT-GC has a higher limit of 400-450°C, allowing for direct analysis of GDGTs. HT-GC equipped with a flame ionization detector can be used to analyse CL-GDGTs[18,72]. The possible molecular structures of GDGTs can be deduced from analyzing the primary and secondary fragment ions of the mass spectra, along with their fragmentation pathways[41-42].NMR techniques provide molecular structural information of GDGTs, which can be verified by other methods such as HPLC-MS and GC-MS[18,41,71,82]. Nevertheless, NMR has certain limitations and requires high sample purity and content to ensure adequate signal intensity. NMR analysis usually requires high sample purity and milligram injection quantities, which means it is not easy to separate and enrich GDGT monomers from their homologues and isomers, so only a few GDGT components (e.g., Ia, Ib, and IIa) have been verified by NMR[18,44,71]. In the future,HPLC-NMR technology may simplify the process and achieve more efficient and convenient structural analysis of GDGTs[84].

The isotopic composition of GDGTs provides vital biological and environmental information[65,85-90]. GCIRMS is the primary method used for stable carbon and hydrogen isotope analysis of GDGTs[40,61,65,87-89]. Prior to GC-IRMS analysis, GDGTs are converted into smaller and more volatile alkanes through “ether bond cleavage”[61,69-70,85]. Accelerator mass spectrometry is used to analyze radiocarbon isotopes for GDGTs, but it requires a carbon content of the sample greater than 100μg C[93]. To meet this testing requirements, a large amount of environmental samples must be extracted, separated, and purified to obtain an adequate amount of high-purity individual GDGT component[18,90].

Significant progress has been achieved in the analytical techniques and methods for GDGTs during the last two decades. However, existing approaches still face issues regarding standardization, method efficiency, and novel GDGT components. Future studies should focus on the following aspects: (1) Establishing standard methods and quality control systems for GDGTs. Developing standard analytical procedures for GDGTs and establishing a quality control and evaluation system is crucial to improve the reliability and comparability of the analytical results.(2) Developing convenient and efficient analytical methods. It is necessary to establish simpler and more automated techniques for GDGT extraction, separation, and purification. In addition, developing qualitative and quantitative methods with better sensitivity and accuracy is also important. (3) Identification of unknown components of GDGTs. Using various techniques such as HPLC-HRMS, GC-MS, and NMR to identify the unknown GDGT components, enhancing the understanding of their composition and distribution in the environment. (4) Developing new isotopic techniques and methods for GDGTs with fewer samples and easier procedures, and helping to expand the use of isotopic methods in the future.