泉州市某區(qū)食品中致瀉性大腸埃希菌的檢測情況

王萍霞 鐘煌培 周芳芳

大腸埃希菌是腸桿菌科中埃希菌屬一個種類，也是人類以及動物腸道中正常菌群主要成員，單克糞便當中含有大腸桿菌大約109個[1]。大腸埃希菌廣泛分布在自然界的水、食品、土壤以及牛乳等中；因此，大腸埃希菌常作為衛(wèi)生監(jiān)督重要指示菌之一[2]。結(jié)合大腸埃希菌對于腸道的作用而言，能將其劃分成致病性、非致病性2 類。其血清分群采取O∶K∶H的方式表示，其中O抗原至今已經(jīng)有171種，屬于血清分型群重要基礎；K 抗原總共有99 種，H 抗原總共有60 種[3]。部分血清型對于腸道生理發(fā)揮著關鍵性作用，是不可或缺的腸道內(nèi)部微生物，但另外一些血清型也能導致不同的特征性腹瀉以及腸道外感染，影響機體健康，需及時前往醫(yī)院就診，在必要情況下需合理采取抗菌治療[4]。微生物檢驗屬于檢驗大腸埃希菌的一項主要實驗方法，有著較高準確度，便于后續(xù)針對檢驗結(jié)果用藥，防止抗生素濫用引起的治療無效等情況出現(xiàn)[5]。本研究現(xiàn)對2021年1—12月從泉州市鯉城區(qū)超市以及集貿(mào)攤點采集的100 份食品樣本進行檢驗，分析大腸埃希菌微生物檢驗方式以及意義，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2021年1—12月從泉州市鯉城區(qū)超市以及集貿(mào)攤點采集的100 份食品樣本作為研究對象。納入標準：（1）檢驗的食品樣本均來源于超市以及集貿(mào)攤點。（2）嚴格按照采集前預備、現(xiàn)場采集、樣品送檢、無法滿足檢驗要求樣品的處理、采集工作結(jié)束各步驟進行標本采集。排除標準：（1）采集標本期間出現(xiàn)污染者。（2）采集的標本量不足者。食品標本種類主要包含蔬菜類、海產(chǎn)類、鹵水、沙拉、燒烤等涼拌類、禽肉類、畜肉類共5 類，其中牲畜肉類18 份，生禽肉類20 份，涼拌類20 份，海產(chǎn)類20 份，蔬菜類22 份。

1.2 方法

1.2.1 儀器及試劑

北京陸橋技術有限公司提供的改良大腸桿菌檢驗（Escherichia colibroth，EC）肉湯、麥康凱培養(yǎng)基；法國科瑪嘉公司提供的O157 ∶H7 鑒定平板；廣州環(huán)凱公司提供的MH 平板；挪威Dynal 公司提供的免疫磁珠以及磁珠收集器；法國梅里埃公司提供的API-20E+鑒定卡；成都生物制品廠提供的大腸埃希菌鑒定血清；泰國S＆A 公司提供的O157 和H7 血清。

1.2.2 檢測方法

1.2.2.1 大腸埃希菌檢測 對采集的所有樣本開展大腸埃希菌檢測工作，無菌操作采集樣品25 g，在EC 改良肉湯內(nèi)加入225 mL 樣品，培養(yǎng)18 ～24 h（37 ℃），在麥康凱改良平板內(nèi)接種，在37 ℃環(huán)境下進行18 ～24 h 培養(yǎng)。挑選出可疑的菌落嚴格按照中華人民共和國國家標準《食品衛(wèi)生微生物學檢驗》[6]中方法開展相應的檢測工作。另外免疫磁珠捕獲法根據(jù)食源性污染物監(jiān)測網(wǎng)絡工作制度完成大腸埃希菌中O157 ∶H7，同時予以鑒定血清學、生化實驗學檢查。檢測的致瀉性大腸埃希菌株類型包含腸致病性大腸埃希菌（entero pathogenicEscherichia coli，EPEC）、產(chǎn)腸毒性大腸埃希菌（entero toxigenicEscherichia coli，ETEC）、腸出血性大腸埃希菌（entero hemorrhagicEscherichia coli，EHEC）、腸集聚性大腸桿菌（enteroaggregativeEscherichia coli，EAEC）、 腸侵襲性大腸埃希菌（entero invasiveEscherichia coli，EIEC）。

1.2.2.2 O157 ∶H7 毒力基因檢測 中國疾控中心傳染病防治研究所提供的O157、H7、eaeA、hly、SLT、SLT2序列引物。聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）試劑購自寶日醫(yī)生物技術（北京）有限公司。通過對H7/O157 抗原基因予以PCR 監(jiān)測，得到二者陽性菌株，后監(jiān)測毒力基因測定，包括SLT2、SLT、hly、eaeA。整個實驗期間采取的質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25923、銅綠假單胞菌ATCC27853 以及金葡菌ATCC25923，均為泉州市鯉城區(qū)疾病預防控制中心菌種庫負責保存。

1.3 觀察指標

統(tǒng)計所有食品樣本中的致瀉性大腸埃希菌檢測結(jié)果以及致瀉性大腸埃希菌的毒力基因。比較不同食品樣本的大腸埃希菌檢出率差異。

1.4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 23.0 統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析。計數(shù)資料以n（%）表示，采用χ2檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 100 份檢測樣本的檢測結(jié)果

100 份檢測樣本中，總共20 份檢出致瀉性大腸埃希菌，檢出率為20.00%（20/100）；其中包含ETEC 共6 株，占比為30.00%（6/20）；EPEC 共5 株，占比為25.00%（5/20）；EHEC 共5 株，占比為25.00%（5/20）；EIEC 共4 株，占比為20.00%（4/20）。牲畜肉類、生禽肉類、涼拌類、海產(chǎn)類以及蔬菜類食品的致瀉性大腸埃希菌檢出率依次為38.89%、45.00%、5.00%、10.00%、4.55%，其中牲畜肉類、生禽肉類的致瀉性大腸埃希菌檢出率高于涼拌類、海產(chǎn)類、蔬菜類等其他食品類型（P＜0.05）。見表1。

表1 不同食品樣本的大腸埃希菌檢出結(jié)果

2.2 毒力基因檢測結(jié)果

分離的20 株致瀉性大腸埃希菌中，共有5 株EHEC的O157 ∶H7 鑒定血清凝集，其中在羊肉內(nèi)分離得到1 株O157 ∶H7 菌帶有eaeA、hly、SLT2毒力基因（見圖1），余下4 株O157 ∶H7 菌4 種毒力基因的eaeA、hly、SLT、SLT2均是陰性。

圖1 PCR 檢測的毒力基因電泳圖顯示帶有eaeA、hly、SLT2 毒力基因的O157 ∶H7 菌1 株

3 討論

大腸埃希菌是機體內(nèi)重要的單細胞生物，其周身存在鞭毛或者菌毛，能夠運動，且無芽[7]。大腸埃希菌不僅分布在機體與動物腸道中，也廣泛分布在水源、牛乳、土壤和各種食物中，屬于水、食品大腸菌群重要的組成部分，結(jié)合大腸埃希菌數(shù)量能對糞便污染度給出重要判斷[8]。大腸埃希菌作為一類機會致病菌，盡管大多數(shù)的大腸埃希菌是無害的，但是有些也能致病，如致瀉性大腸桿菌能引起腹瀉和多個部位感染，且不同致瀉性大腸桿菌引起的感染癥狀各不相同，常見癥狀包括水樣便、腹痛、惡心、發(fā)熱、糞便中有少量黏液和血等，嬰幼兒多表現(xiàn)為2 周以上的持續(xù)性腹瀉同時耐藥性較強，已經(jīng)得到社會各界高度關注[9]。致瀉性大腸埃希菌在世界各地均為常見的食源性疾病暴發(fā)元兇，最近一次國際流行是發(fā)生在德國“黃瓜污染事件”（最終證實是芽菜污染），由大腸埃希氏菌O104 ∶H4 引起，波及9 個國家，約2 200 人生病，數(shù)10 人死亡[10]。

大腸埃希菌致病因素由于其外部的菌毛能附著黏膜表面細菌，這種作用能協(xié)助其定植，同時本菌抗原結(jié)構(gòu)復雜，菌體內(nèi)有O 抗原、H 抗原和K 抗原等，其中K 抗原存在抗吞噬能力，并能對補體和抗體起到抵抗作用[11]。大腸埃希菌是革蘭陰性短桿菌，其性質(zhì)與其他種類的革蘭陰性菌引起肉毒素完全相同，同時和其生理以及病理作用類似，這些能使機體出現(xiàn)高熱、休克和彌散血管內(nèi)部凝血等癥狀[12]。除此之外，能生成以下2 類外毒素：其中1 類是耐熱性不佳的熱腸毒素，該類毒素于65 ℃環(huán)境下存在30 min 就能被破壞；第2 類是耐藥性較強熱腸毒素，該類毒素于100 ℃下維持20 min 不會被破壞。以上2 類毒素能使腸道分泌較多腸液，進而引起腹瀉等疾病[13]。常見的致瀉性大腸埃希菌主要涉及EPEC、ETEC、EHEC、EAEC以及EIEC。本研究的100 份中，總共20 份檢出致瀉性大腸埃希菌，占比為20.00%；其中ETEC 占比為30.00%，EPEC 占比為25.00%；EHEC 占比為25.00%，EIEC 占比為20.00%。牲畜肉類、生禽肉類、涼拌類、海產(chǎn)類以及蔬菜類食品的致瀉性大腸埃希菌檢出率依次為38.89%、45.00%、5.00%、10.00%、4.55%，其中牲畜肉類、生禽肉類的致瀉性大腸埃希菌檢出率高于其他食品類型（P＜0.05）。說明需要食物衛(wèi)生監(jiān)督部門加大審查力度，指導其對家禽家畜類食物正確滅菌處理，對于肉類烹飪火候需要加大，防止食入生冷致病性食物。分離的20 株致瀉性大腸埃希菌中，共有5 株EHEC 的O157 ∶H7鑒定血清凝集，其中在羊肉內(nèi)分離得到1 株O157 ∶H7菌帶有eaeA、hly、SLT2毒力基因，該毒力菌株存在高致病性特征，這與有關報道中的大腸埃希菌有關毒力圖譜一致[14]；余下4 株O157 ∶H7 菌4 種毒力基因的eaeA、hly、SLT、SLT2均是陰性。上述結(jié)果說明，通過微生物檢驗方法能有檢測到食品內(nèi)的大腸埃希菌及致瀉性大腸埃希菌有關毒力基因，需要高度重視食品安全衛(wèi)生問題，積極采取有效食品安全監(jiān)督管理措施，為人民群眾食品安全提供保障。筆者認為，對于食品中的大腸埃希菌防控，需要從以下幾方面進行：（1）對致病菌予以徹底高溫消毒是避免食物中毒的關鍵性手段。高溫（75 ℃）消殺肉類2 ～3 min，全部食物加溫高壓至75 ℃，可對大腸桿菌予以徹底消殺；熟食類長期放置后需要再次高溫再入口；蒸煮禽蛋類食物需要達到8 ～10 min，蒸煮100 ℃。（2）對食物中繁殖致病菌予以有效阻斷，包括對儲存時間的縮短、低溫處理、分開熟食、生食、食品的低溫置存等。（3）避免食物被致病菌污染，增強衛(wèi)生監(jiān)督管理禽肉類生產(chǎn)企業(yè)，衛(wèi)生檢驗屠宰前后的致病菌，加強置存食物的環(huán)境衛(wèi)生管理，防止在銷售、烹飪、加工、運輸、儲存等各個環(huán)節(jié)中發(fā)生帶菌。

綜上所述，嚴格按照有關標準開展微生物檢驗能有效檢出食品中的大腸埃希菌和致瀉性大腸埃希菌毒力基因，需要加強衛(wèi)生監(jiān)督力度，確保食品安全，防范聚集性病例出現(xiàn)。此外，本研究中還有不足之處，如納入的樣本總數(shù)不多，未對微生物檢驗的準確度、特異度和敏感度等指標進行分析，得到的結(jié)果還有局限性，這些均需在日后加以完善，更進一步論證以上結(jié)果。