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    基于UPLC-Q-TOF-MS/MS聯(lián)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接研究五味清濁顆粒治療腹瀉藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制

    2024-03-14 03:48:44李偉孫佳李思雨余秋香王添敏宋慧鵬張慧遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院遼寧大連116600
    中南藥學(xué) 2024年2期
    關(guān)鍵詞:類化合物靶點質(zhì)譜

    李偉,孫佳,李思雨,余秋香,王添敏,宋慧鵬,張慧(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,遼寧 大連 116600)

    五味清濁顆粒又名當(dāng)瑪-5、通拉嘎-5,為蒙古族驗方,始載于《后序醫(yī)典》,1985年版《中國藥典》首次將其載入[1],由石榴、紅花、肉桂、蓽茇、豆蔻五味藥材組成,具有開郁消食、暖胃的功效[2]。方中石榴為君藥,以溫胃增火,清肝熱為主;紅花為臣藥,以清熱、增強體質(zhì)為輔;蓽茇、肉桂、豆蔻均為佐使藥,蓽茇溫中散寒、止瀉化腐;肉桂散寒止痛,益胃火;豆蔻溫胃腎[3]。臨床上常用于治療腹瀉[4-6]且效果較好,寒證、熱證均可使用,但迄今為止,處方藥效物質(zhì)潛在的有效成分及作用機(jī)制尚不明確。

    網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)是目前預(yù)測復(fù)方有效成分的有效手段,但目前多以文獻(xiàn)報道或TCMSP數(shù)據(jù)庫中收錄的化學(xué)成分為對象,對五味清濁顆粒進(jìn)行活性成分的預(yù)測,目標(biāo)性不強,導(dǎo)致預(yù)測的活性成分在中藥中檢測不到,預(yù)測的結(jié)果沒有意義,為此需要在五味清濁顆粒成分確定存在的基礎(chǔ)上,進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接的預(yù)測。

    本論文采用質(zhì)譜分析技術(shù),對五味清濁顆粒進(jìn)行分析,以檢測到的成分為對象,進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接分析,篩選活性成分,揭示作用機(jī)制,為五味清濁顆粒研究奠定基礎(chǔ),指導(dǎo)臨床用藥。

    1 材料

    1.1 儀器

    Agilent 1290型UPLC儀、Agilent 6550型三重四極桿高分辨質(zhì)譜儀(配置Dual AJS ESI 離子源)[安捷倫科技(中國)有限公司]、KQ250DB型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)、十萬分之一天平(梅特勒 ME55C137550880,精度:0.01 mg)。

    1.2 試藥

    五味清濁顆粒(批號:20211010,規(guī)格:3 g/袋,祈蒙股份有限公司),對照品沒食子酸(純度≥98.0%,批號:B20851)、胡椒堿(純度≥98.0%,批號:B20516)、羥基紅花黃色素A(純度≥98.0%,批號:B20968)、木犀草素(純度≥98.0%,批號:B20888)、山柰酚(純度≥98.0%,批號:B21126)、肉桂醛(純度≥98.0%,批號:B21081)(上海源葉生物科技有限公司);鞣花酸(純度≥98.0%,批號:BP0529,成都普瑞法科技開發(fā)有限公司)。乙腈、甲酸、甲醇均為分析純。

    2 方法與結(jié)果

    2.1 色譜和質(zhì)譜條件

    2.1.1 色譜條件 采用Eclipsepius C18色譜柱(2.1 mm×50 mm,1.8 μm),以0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)為流動相,梯度洗脫:0~13.3 min,7%~22%B;13.3~14.6 min,22%~31%B;14.6~22 min,31%~40%B;22~29 min,40%~60%B;29~35 min,60%~80%B;35~39 min,80%~90%B。檢測波長為310 nm;進(jìn)樣體積為3 μL;柱溫為30℃;流速為0.4 mL·min-1;分析時間為39 min;柱色譜洗脫液不經(jīng)分流直接導(dǎo)入質(zhì)譜系統(tǒng)檢測。

    2.1.2 質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子源(ESI),在正、負(fù)離子模式下檢測,二級質(zhì)譜采集采用Auto MS/MS模式;干燥氣體溫度為250℃,干燥氣體流速為14 L·min-1;毛細(xì)管電壓為3500 V,碎裂電壓為3500 V,霧化器壓力為35 psi,二級質(zhì)譜碰撞電壓為20 eV;質(zhì)譜采集范圍為(m/z)50~2000。

    2.2 供試品溶液的制備

    取五味清濁顆粒0.75 g置10 mL的量瓶中,加70%甲醇定容,超聲(頻率40 kHz,功率100 W)30 min,冷卻后用70%甲醇補足體積,用0.22 μm微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液即得。

    2.3 對照品溶液的制備

    分別稱取沒食子酸、胡椒堿、羥基紅花黃色素A、木犀草素、山柰酚、肉桂醛、鞣花酸適量,加甲醇制成各對照品質(zhì)量濃度均為50 μg·mL-1的混合對照品溶液,即得。

    2.4 結(jié)果

    2.4.1 化學(xué)成分的鑒定 采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù),按“2.1”項下方法對五味清濁顆粒進(jìn)行正、負(fù)離子全掃描,獲得總離子流圖,見圖1。結(jié)合化學(xué)對照品,共鑒定和推測出86個化學(xué)成分,見表1[7-14]。

    圖1 五味清濁顆粒的HPLC-Q-TOF-MS/MS負(fù)離子模式(A)和正離子模式(B)總離子流圖Fig 1 Total ion chromatograms of HPLC-Q-TOF-MS/MS by negative ion mode(A)and positive ion mode(B)for Wuwei Qingzhuo granules

    續(xù)表1

    2.4.2 生物堿類化合物 生物堿類化合物主要來源于蓽茇,如胡椒堿、蓽茇寧、蓽茇酰胺等,質(zhì)譜裂解規(guī)律為胺部分容易失去一個中性哌啶或甲?;哙?,末端結(jié)構(gòu)易產(chǎn)生丙烯基亞甲二氧基苯和甲基亞甲二氧基苯[12]。在五味清濁顆粒中鑒別出生物堿類化合物共25個,分別是4、24、58、60、62~65、68~81、84~86。

    以65為例,闡述酰胺類生物堿的裂解規(guī)律和結(jié)構(gòu)鑒定的解析過程。在正離子模式下,其保留時間為19.416 min,準(zhǔn)分子離子峰m/z286.1448[M+H]+,根據(jù)元素組成綜合分析預(yù)測可能的分子式為C17H19NO3。母離子在質(zhì)譜高能碰撞下,丟失C5H11N形成m/z201.0550的碎片離子,再丟失CO形成m/z173.0594的離子碎片,脂肪酸末端產(chǎn)生m/z161.0593[C10H8O2+H]+的丙烯基亞甲二氧基苯和m/z135.0441[C8H6O2+H]+的甲基亞甲二氧基苯。結(jié)合化合物的分子式、裂解規(guī)律、碎片信息及與文獻(xiàn)對照[12],確認(rèn)該化合物為胡椒堿??赡艿牧呀馔緩揭妶D2。

    圖2 胡椒堿的質(zhì)譜圖(A)及裂解規(guī)律(B)Fig 2 Mass spectrum(A)and fragmentation pathway(B)of piperine

    2.4.3 黃酮類化合物 黃酮類化合物主要來源于紅花,如山柰酚、槲皮素、羥基紅花黃色素A等。質(zhì)譜裂解規(guī)律為逆狄爾斯-阿德爾(RDA)裂解和丟失中性碎片,在ESI多級質(zhì)譜中,CO、CO2、C2H2O等中性碎片的丟失首先發(fā)生在C環(huán),然后發(fā)生在A環(huán)上,B環(huán)上沒有中性碎片的丟失[13]。在五味清濁顆粒中鑒別出黃酮類化合物共23個,分別是15、16、20、22、23、26、28、31、34~36、39~45、47、48、52、53、59。

    以53為例,闡述黃酮類化合物的裂解規(guī)律和結(jié)構(gòu)鑒定的解析過程。在負(fù)離子模式下,保留時間為12.418 min,準(zhǔn)分子離子峰m/z285.0405 [MH]-,根據(jù)元素組成綜合分析預(yù)測可能的分子式為C15H10O6,母離子在質(zhì)譜高能碰撞下丟失CO形成m/z257.0446的離子碎片,再丟失CO形成m/z229.0500的離子碎片。RDA裂解產(chǎn)生m/z153.0181的離子碎片。結(jié)合化合物的分子式、裂解規(guī)律、碎片信息及與文獻(xiàn)對照[13],確認(rèn)該化合物為山柰酚??赡艿牧呀馔緩揭妶D3。

    2.4.4 有機(jī)酸類化合物 有機(jī)酸類化合物來源于石榴、紅花,如綠原酸、沒食子酸、蘋果酸等。質(zhì)譜裂解規(guī)律為一般丟失CO2和H2O的特征碎片[13],在五味清濁顆粒中鑒別出有機(jī)酸類化合物共12個,分別是1、2、5、8、9、19、32、49、57、67、82、83。

    以19為例,闡述有機(jī)酸類化合物的裂解規(guī)律和結(jié)構(gòu)鑒定的解析過程。在負(fù)離子模式下,保留時間為1.889 min,準(zhǔn)分子離子峰m/z353.0882[MH]-,根據(jù)元素組成綜合分析預(yù)測可能的分子式為C16H18O9,母離子在質(zhì)譜高能碰撞下丟失C7H11O5-H2O、C7H11O5-CO2,形成m/z161.0244、m/z135.0453的離子碎片。結(jié)合化合物的分子式、裂解規(guī)律、碎片信息及與文獻(xiàn)對照[13],確認(rèn)該化合物為綠原酸??赡艿牧呀馔緩揭妶D4。

    圖4 綠原酸的質(zhì)譜圖(A)及裂解規(guī)律(B)Fig 4 Mass spectrum(A)and fragmentation pathway(B)of chlorogenic acid

    2.4.5 鞣質(zhì)類化合物 鞣質(zhì)類化合物主要來源于石榴,如原花青素B、安石榴林、石榴皮亭B等。質(zhì)譜裂解規(guī)律為通常發(fā)生RDA裂解、失去H2O而產(chǎn)生碎片離子峰[9],在五味清濁顆粒中鑒別出鞣質(zhì)類化合物共16個,分別是6、7、10~14、18、21、25、27、29、30、33、37、55。

    以21為例,闡述縮合鞣質(zhì)類化合物的裂解規(guī)律和結(jié)構(gòu)鑒定的解析過程。在負(fù)離子模式下,保留時間為2.662 min,準(zhǔn)分子離子峰m/z577.1364[MH]-,根據(jù)元素組成綜合分析預(yù)測可能的分子式為C30H26O12,母離子在質(zhì)譜高能碰撞下脫去C8H8O3,發(fā)生RDA裂解重排得到m/z425.0861離子碎片,接著脫去一個H2O,得到m/z407.0773離子碎片,兩個兒茶素斷裂,形成m/z289.0719離子碎片,再脫去C9H8O3,經(jīng)重排裂解得到m/z125.0248離子碎片。結(jié)合化合物的分子式、裂解規(guī)律、碎片信息及與文獻(xiàn)對照[9],確認(rèn)該化合物為原花青素B??赡艿牧呀馔緩揭妶D5。

    2.4.6 苯丙素類化合物 苯丙素類化合物主要來源于肉桂,如桂皮醛、香豆素。質(zhì)譜裂解規(guī)律為內(nèi)酯環(huán)容易丟失CO、CO2產(chǎn)生質(zhì)量損失28和44的碎片離子[16]。在五味清濁顆粒中鑒別出苯丙素類化合物共2個,分別是38、51。

    以38為例,闡述苯丙素類化合物的裂解規(guī)律和結(jié)構(gòu)鑒定的解析過程。在正離子模式下,保留時間為6.581 min,準(zhǔn)分子離子峰m/z147.0437[M+H]+,根據(jù)元素組成綜合分析預(yù)測可能的分子式為C9H6O2,母離子在質(zhì)譜高能碰撞下失去1分子CO,產(chǎn)生m/z119.0486的離子碎片,再失去1分子CO,得到m/z91.0547的離子碎片。結(jié)合化合物的分子式、裂解規(guī)律、碎片信息及與文獻(xiàn)對照[16],確認(rèn)該化合物為香豆素??赡艿牧呀馔緩揭妶D6。

    圖6 香豆素的質(zhì)譜圖(A)及裂解規(guī)律(B)Fig 6 Mass spectrum(A)and fragmentation pathway(B)of coumarin

    2.5 治療腹瀉的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

    2.5.1 活性成分和疾病的靶點篩選 將UPLC-QTOF-MS/MS鑒別獲得的86個化學(xué)成分代入TCMSP中,根據(jù)藥代動力學(xué)特征(ADME)篩選得到活性成分。利用TCMSP 和 Swiss Target Prediction得到候選靶點1014個。以“Diarrhea”為關(guān)鍵詞,在GeneCards、OMIM等數(shù)據(jù)庫篩選得到腹瀉相關(guān)靶點320個。最終篩選出五味清濁顆粒治療腹瀉疾病潛在靶點57個。利用Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建“活性成分-作用靶點”網(wǎng)絡(luò),將活性成分按度值(Degree)排序,篩選排名靠前的6個成分,分別為槲皮素、木犀草素、鞣花酸、胡椒堿、山柰酚、蓽茇寧。

    2.5.2 蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)(PPI)構(gòu)建與分析 將“活性成分-疾病”交集靶點導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫,繪制PPI。利用Cytoscape 3.7.1軟件進(jìn)行可視化,見圖7。利用Network Analyzer工具進(jìn)行拓?fù)浞治?,以Degree為基準(zhǔn)排序,最終篩選排名靠前的6個靶點,分別為IL-6、TNF、EGFR、IFNG、IL-10、IL-8。

    圖7 五味清濁顆粒治療腹瀉疾病PPI網(wǎng)絡(luò)Fig 7 PPI network of Wuwei Qingzhuo granules in treating diarrhea

    2.5.3 GO功能及KEGG通路富集分析 應(yīng)用Metascape數(shù)據(jù)庫,對GO功能排名前10的條目及KEGG排名前20的通路進(jìn)行可視化。GO分析得到生物過程(BP)條目3251個,細(xì)胞組分(CC)條目287個,分子功能(MF)條目478個。KEGG通路富集分析得到107條通路,富集的主要信號通路包括PI3K-Akt、JAK-STAT、HIF-1等信號通路,見圖8。

    圖8 五味清濁顆粒治療腹瀉疾病靶點基因的GO及KEGG富集分析Fig 8 GO and KEGG enrichment analysis of target genes of Wuwei Qingzhuo granules in treating diarrhea

    2.5.4 “核心成分-作用靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 利用Cytoscape 3.7.1 軟件構(gòu)建五味清濁顆粒核心成分-作用靶點-通路相互作用網(wǎng)絡(luò)圖,見圖9。由圖9可知,五味清濁顆?;钚猿煞滞ㄟ^作用于多個靶點、多條通路發(fā)揮作用,且成分、靶點、通路間存在錯綜復(fù)雜的關(guān)系。

    圖9 五味清濁顆粒治療腹瀉疾病 “核心成分-作用靶點-通路”圖Fig 9 “Core ingredient-target-pathway” diagram of Wuwei Qingzhuo granules in treating diarrhea

    2.5.5 分子對接驗證 利用AutoDock Vina進(jìn)行分子對接驗證,見表2。對接結(jié)合能均小于-20 kJ·mol-1,表明核心成分與核心靶點結(jié)合穩(wěn)定,部分對接構(gòu)象見圖10。

    表2 五味清濁顆粒核心成分和核心靶點的結(jié)合能Tab 2 Binding energy of core components and core targets of Wuwei Qingzhuo granules

    4 討論

    腹瀉是一種臨床常見的消化道疾病,主要表現(xiàn)為排便次數(shù)增加和大便流動性增加[17]。腹瀉會導(dǎo)致機(jī)體丟失大量體液,引起脫水和電解質(zhì)平衡紊亂,引起腹瀉的病因較多,發(fā)病機(jī)制較復(fù)雜,可能是由于腸道吸收減少、滲透性活性電解質(zhì)分泌增加、胃腸道快速轉(zhuǎn)運引起的[18-19]。五味清濁顆粒是蒙醫(yī)臨床治療腹瀉的經(jīng)驗方,本文以其作為研究對象,采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)聯(lián)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接探討治療腹瀉的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制。

    通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選出6個核心成分,分別為槲皮素、木犀草素、鞣花酸、胡椒堿、山柰酚、蓽茇寧。相關(guān)藥理研究表明,槲皮素、山柰酚可抑制腸道運動,降低腹腔毛細(xì)血管的通透性、抑制腸內(nèi)水分和電解質(zhì)的分泌以及修復(fù)上皮黏膜治療腹瀉[20-21],鞣花酸對腸道上皮細(xì)胞具有顯著的保護(hù)作用,能夠促進(jìn)腸道內(nèi)容物中營養(yǎng)物質(zhì)的吸收,防止腸道中的致病菌在腸道上皮細(xì)胞中定植[22]。木犀草素具有抗炎作用,在調(diào)節(jié)腸道免疫系統(tǒng)和治療慢性炎癥性腸病中發(fā)揮重要作用,可以減少小腸內(nèi)容物的體積和重量,從而發(fā)揮止瀉作用[23]。胡椒堿、蓽茇寧具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、抑菌等多重藥理功效,在止瀉和調(diào)節(jié)腸道免疫系統(tǒng)起著重要作用[22-23]。

    五味清濁顆粒治療腹瀉共51個相關(guān)靶點,根據(jù)PPI網(wǎng)絡(luò)預(yù)測結(jié)果最終篩選出6個核心靶點,主要包括IL-6、TNF、EGFR、IFNG、IL-10、IL-8等,體現(xiàn)中藥治療疾病的多靶點特點。其中IL-6作為關(guān)鍵促炎因子[24],通過刺激趨化因子的產(chǎn)生并激活腸道黏膜局部免疫反應(yīng),導(dǎo)致腸道動力改變以及腸道敏感度增高,炎癥細(xì)胞也隨之增多,激活腸道免疫系統(tǒng),導(dǎo)致腸道通透性的增高,進(jìn)而引起腹痛、腹瀉[19]。動物實驗表明,TNF-α抗體或基因的缺失可有效減輕炎癥性腸病[25]。EGFR通過與其受體結(jié)合激活多個信號通路來刺激上皮細(xì)胞的生長、增殖和分化,在調(diào)節(jié)腸黏膜屏障功能方面發(fā)揮重要作用[21]。IFNG在免疫反應(yīng)中起重要的調(diào)節(jié)作用,T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞以及單核巨噬細(xì)胞能產(chǎn)生大量的IFNG,其能誘導(dǎo)NF-κB等炎癥因子釋放[26]。KEGG通路富集分析結(jié)果顯示,51個交集靶點顯著富集于PI3KAkt、JAK-STAT、HIF-1信號通路等關(guān)鍵信號通路。JAK-STAT信號通路參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡,可通過調(diào)控其來抑制炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生,減輕腸黏膜損傷。HIF-1為腸道炎癥的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,腹瀉會導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)并會造成機(jī)體局部缺氧,使得HIF-1信號通路激活[19],可通過抑制其激活,減輕腸道炎癥反應(yīng)。PI3K-Akt信號通路與腹瀉的發(fā)生最為密切,可通過抑制其活化,促進(jìn)細(xì)胞自噬與細(xì)胞凋亡,降低促炎癥因子 IL-6釋放,減輕腸道炎癥反應(yīng),達(dá)到保護(hù)腸道黏膜的作用[22,27]。分子對接結(jié)果顯示,核心成分與核心靶點間均具有良好的結(jié)合性能。

    綜上,本研究基于UPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)聯(lián)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)充分表明五味清濁顆??赏ㄟ^多成分、多靶點、多途徑協(xié)同發(fā)揮治療腹瀉作用,可為后期五味清濁顆粒的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供參考依據(jù)。

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