微生物來源的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的研究進(jìn)展

陳金玲，楊 杰，魏 真,3,

（1.江蘇海洋大學(xué)，江蘇省海洋生物資源與環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇連云港 222005；2.江蘇省海洋生物產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇連云港 222005；3.江蘇省海洋資源開發(fā)研究院（連云港），江蘇連云港 222005）

α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶（alpha-L-arabinofuranosidase，α-L-AFase）歸屬于糖苷水解酶（glycoside hydrolases，GH）家族，主要催化阿拉伯糖聚合物中以α-（1,2）、α-（1,3）或α-（1,5）連接的阿拉伯呋喃糖基的水解，在阿拉伯木聚糖的生物降解及開發(fā)應(yīng)用中極具研究價(jià)值[1-2]。此外，α-L-AFase 在食品加工、飼料研制和醫(yī)療保健等領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用，例如用于改善果汁澄清度和葡萄酒風(fēng)味、制備動物飼料和生物活性物質(zhì)等[3]。目前已報(bào)道多種微生物菌株能夠產(chǎn)生α-L-AFase，且越來越多的α-L-AFase 的基因被挖掘和鑒定。不同α-L-AFase 分布于多個(gè)糖苷水解酶家族，不同的結(jié)構(gòu)和催化機(jī)制致使該水解酶表現(xiàn)出不同的底物特異性[4]。至今為止研究者在α-L-AFase 的基因挖掘、表達(dá)純化、酶學(xué)性質(zhì)等方面已做了相關(guān)研究，并對其分子結(jié)構(gòu)和催化機(jī)制等作出分析，但是阿拉伯木聚糖的復(fù)雜結(jié)構(gòu)仍然限制了α-L-AFase 的應(yīng)用范圍，不同來源和不同作用模式的α-L-AFase 需要協(xié)同其他水解酶共同降解復(fù)雜的阿拉伯木聚糖。因此，充分認(rèn)識不同類型的α-L-AFase 對于該酶后續(xù)的性質(zhì)、分子改造及應(yīng)用等研究具有重要意義。本文總結(jié)和分析了近年來α-L-AFase 的微生物來源、酶學(xué)特性與性質(zhì)改良、分子結(jié)構(gòu)與催化機(jī)制、與其他水解酶的協(xié)同作用以及該酶應(yīng)用于食品、飼料、醫(yī)療保健等領(lǐng)域的研究進(jìn)展，為推動后續(xù)α-LAFase 的基礎(chǔ)研究及應(yīng)用提供參考。

1 α-L-AFase 的微生物來源

α-L-AFase 廣泛分布于細(xì)菌、真菌等微生物中，隨著對α-L-AFase 及其水解產(chǎn)物的需求不斷增大，對該酶的開發(fā)也隨之增多。多種細(xì)菌已被報(bào)道能夠產(chǎn)生α-L-AFase，例如Bacillus velezensis[5]、Anoxybacillus kestanbolensisAC26Sari[6]、Paenibacillussp.DG-22[7]、Streptomycessp.S9[8]、Clostridium thermocellum[9]、Pseudopedobacter saltans[10]、Geobacillus vulcaniGS90 等[11]，這些α-L-AFase 普遍分布于GH43或GH51 等糖苷水解酶家族中。最近研究者在常溫菌Bifidobacterium longum和嗜熱菌Caldicellulosiruptorsp.兩種細(xì)菌中鑒定到了α-L-AFase 的存在，同時(shí)這也是該酶分別在GH146 和GH159 家族中被發(fā)現(xiàn)[12-13]。這些新發(fā)現(xiàn)的α-L-AFase 不僅豐富了該酶的物種來源，而且擴(kuò)展了糖苷水解酶家族的功能譜，對后續(xù)α-L-AFase 的研究提供了新的理論支持。與細(xì)菌來源的α-L-AFase 相比，多數(shù)真菌的α-L-AFase 產(chǎn)量較低，對真菌α-L-AFase 的研究也相對較少。目前發(fā)現(xiàn)的能夠產(chǎn)α-L-AFase 的真菌涵蓋子囊菌門和擔(dān)子菌門，例如Meripilus giganteus[14]、Aspergillussp.[15]、Penicillium subrubescens[16]、Penicillium chrysogenum[17]、Saccharomycopsis fibuligeraKJJ81 等[18]。此外，研究者在一些耐熱微生物中也發(fā)現(xiàn)了α-L-AFase 的存在，例如極端嗜熱細(xì)菌Caldicellulosiruptor saccharolyticus、Thermotoga petrophila和中溫真菌Eupenicillium parvum等[19-21]，這些微生物來源的酶具有良好的耐熱性質(zhì)，有利于研究者篩選和開發(fā)熱穩(wěn)定的α-L-AFase。

2 α-L-AFase 的酶學(xué)特性及性質(zhì)改良

2.1 α-L-AFase 的酶學(xué)特性

不同來源的α-L-AFase 的酶學(xué)性質(zhì)在分子量、最適反應(yīng)條件及穩(wěn)定性等方面也表現(xiàn)出較大差異見表1。不同來源的α-L-AFase 的分子量差別較大，其最大差值達(dá)到約70 kDa。例如來自細(xì)菌Acremoniumsp.WCQ-6A 的α-L-AFase 分子量僅為42 kDa[22]，而來自真菌Aspergillus japonicus的α-LAFase 呈現(xiàn)出較大的分子量，約為113 kDa[23]；不同微生物來源的α-L-AFase 的最適pH 和溫度不同，細(xì)菌來源的α-L-AFase 的最適pH 多集中在5.5～6.0之間，而真菌來源的α-L-AFase 最適pH 范圍普遍較低，約為4.5～5.5；與真菌相比，來自細(xì)菌的α-LAFase 通常有著更高的最適作用溫度，特別是少數(shù)來源于極端細(xì)菌的α-L-AFase 的最適溫度可達(dá)到80～85 ℃；一些來源于極端微生物的α-L-AFase 表現(xiàn)出較高的穩(wěn)定性，在理論研究和工業(yè)化生產(chǎn)中均有重要價(jià)值。例如，Carvalho 等[11]發(fā)現(xiàn)一種雙功能β-木糖苷酶/α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶具有鹽穩(wěn)定性，它能夠在2.5 mol/L 氯化鈉中保留高達(dá)63%的活性，具備在高鹽或海水環(huán)境下降解木質(zhì)纖維素底物的潛力。一些具有良好熱穩(wěn)定性的α-L-AFase 也逐漸被分離出來，例如Surmeli 等[24]在G.vulcaniGS90 中分離出的α-L-AFase 的最適溫度達(dá)到70 ℃，且該酶在30～90 ℃溫度范圍內(nèi)均具有活性，而Saleh 等[19]在C.saccharolyticus中分離的α-L-AFase（CAX43）在70 ℃時(shí)的半衰期高達(dá)120 h，這些耐熱酶在需要高溫條件下進(jìn)行的反應(yīng)過程中尤為重要。隨著工業(yè)化生產(chǎn)對酶穩(wěn)定性的要求不斷提高，尋找具有生產(chǎn)潛力的優(yōu)質(zhì)α-L-AFase 逐漸成為研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)，這些性質(zhì)穩(wěn)定的α-L-AFase 在工業(yè)化應(yīng)用中將會有良好的發(fā)展前景。

表1 不同微生物來源的α-L-AFase 的酶學(xué)性質(zhì)Table 1 Properties of α-L-AFases from different microbial sources

2.2 α-L-AFase 的性質(zhì)改良

α-L-AFase 在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用日趨廣泛，但多數(shù)天然α-L-AFase 在酶活力和穩(wěn)定性等方面還與實(shí)際需求存在著較大的差距。為了獲得更多具有優(yōu)良性質(zhì)的α-L-AFase，通常使用異源表達(dá)方法對活性酶進(jìn)行重組表達(dá)和制備，并結(jié)合分子生物學(xué)和生物信息學(xué)等技術(shù)手段對野生酶進(jìn)行分子結(jié)構(gòu)改造，以實(shí)現(xiàn)α-L-AFase 的性質(zhì)優(yōu)化。一般將編碼α-L-AFase 的基因連接到具有強(qiáng)啟動子的其他宿主的表達(dá)載體上進(jìn)行異源表達(dá)，以獲得高產(chǎn)的α-L-AFase。用于表達(dá)外來基因的宿主通常為大腸桿菌、芽孢桿菌或釀酒酵母等。酵母菌，特別是畢赤酵母，通常被選為真核阿拉伯呋喃糖苷酶基因的宿主生物，而大腸桿菌常被用作表達(dá)原核阿拉伯呋喃糖苷酶基因的宿主生物。與真菌相比，細(xì)菌具有更快的生長速度，因而它們更容易被進(jìn)行基因操作以用于改造α-L-AFase。

表2 為目前已被構(gòu)建的部分α-L-AFase 的基因工程菌特性。在酶活性優(yōu)化方面，通過構(gòu)建以大腸桿菌或畢赤酵母為宿主的基因工程菌成功提高了重組α-L-AFase 的酶活性：如Motta 等[35]將來自Trichoderma harzianum的具有Mg2+依賴性的α-L-AFase（ThABF）在大腸桿菌中表達(dá)，重組ThABF 的相對活性達(dá)到97%，且對對硝基苯-α-D-半乳糖苷（pNPG）的降解活性也有極大程度的提高。Huy 等[36]將源于Phanerochaete chrysosporium的具有木糖苷酶和α-L-AFase 活性的雙功能酶PcXyl 在畢赤酵母中進(jìn)行表達(dá)，該酶的比活性達(dá)到1797 U/mg。在酶穩(wěn)定性提升方面，來自Pseudopedobactor saltans的α-LAFase（PsGH43_12）在大腸桿菌中表達(dá)后的性質(zhì)更為穩(wěn)定，重組的PsGH43_12 比野生酶在更為寬泛的pH 范圍（5～9）和溫度范圍（35～55 ℃）中均表現(xiàn)出活性[37]。另外，表達(dá)質(zhì)粒和宿主的選擇、表達(dá)的環(huán)境條件等因素也會影響酶的表達(dá)效果，在α-L-AFase 的基因工程菌構(gòu)建中可以進(jìn)一步對以上因素進(jìn)行優(yōu)化，以更好地提高酶的表達(dá)水平，實(shí)現(xiàn)酶學(xué)性質(zhì)的最佳改良效果。除了常規(guī)重組表達(dá)，近年來通過酶的定向進(jìn)化也能夠改善酶的性質(zhì)，例如Surmeli 等[25]通過定向進(jìn)化對源于G.vulcaniGS90 的α-L-AFase（GvAbf）進(jìn)行分子改造，得到了活性高于野生酶的突變體GvAbf51和L307S，以及熱穩(wěn)定性高于野生酶的突變體GvAbf52，實(shí)現(xiàn)了α-L-AFase 的雙重酶學(xué)性質(zhì)改良。隨著生物信息學(xué)和計(jì)算生物學(xué)技術(shù)的不斷提高，利用定向突變和進(jìn)化等輔助手段可以更高效的對天然α-L-AFase 作出設(shè)計(jì)和改造，實(shí)現(xiàn)α-LAFase 的性質(zhì)優(yōu)化也更加具有針對性。

表2 不同來源的α-L-AFase 的基因工程菌特性Table 2 Characteristics of α-L-AFases from different sources of genetic engineering bacteria

以上多種實(shí)驗(yàn)表明，一些天然α-L-AFase 經(jīng)異源重組表達(dá)后，其活性有了不同程度的提高，酶學(xué)性質(zhì)也更加穩(wěn)定，這為后續(xù)優(yōu)質(zhì)α-L-AFase 的大規(guī)模生產(chǎn)及應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)的研究基礎(chǔ)。

3 α-L-AFase 的結(jié)構(gòu)與催化機(jī)制

結(jié)構(gòu)生物學(xué)的迅速發(fā)展使得越來越多α-LAFase 的空間結(jié)構(gòu)得以解析。深入探究α-L-AFase的結(jié)構(gòu)對理解該酶的反應(yīng)機(jī)制具有重要意義，同時(shí)也便于后續(xù)提高對該酶功能預(yù)測的準(zhǔn)確性，提高分子改造效率。

查閱碳水化合物活性酶數(shù)據(jù)庫（Carbohydrate-Active Enzymes Database，CAZy；www.cazy.org）得知，α-L-AFase 被劃分為GH2、GH3、GH43、GH51、GH54、GH62、GH146 和GH159 等多個(gè)糖苷水解酶家族，其中絕大多數(shù)家族酶的催化機(jī)制為保留型。此外，在GH5、GH10、GH93、GH127 等家族中也鑒定到了α-L-AFase 的存在，但它們的酶學(xué)性質(zhì)和結(jié)構(gòu)等信息還未被充分挖掘。GH2 家族的α-L-AFase 屬于糖苷水解酶家族的GH-A 家族，該家族成員的催化結(jié)構(gòu)域具有（β/α）8的三維結(jié)構(gòu)，通過保留機(jī)制切割α-L-阿拉伯呋喃糖苷鍵，且將谷氨酸作為其親核試劑和質(zhì)子供體[29]。GH3 家族與GH2 家族具有類似的催化機(jī)制，但是GH3 家族中的天冬氨酸為催化的親核試劑，谷氨酸為水解酶的催化質(zhì)子供體，組氨酸為磷酸化酶的催化質(zhì)子供體[4]。GH43 家族的α-L-AFase 主要催化阿拉伯木聚糖中阿拉伯糖側(cè)鏈的水解，其催化結(jié)構(gòu)域?yàn)槲迦~片的β-螺旋槳褶皺結(jié)構(gòu)，且分別以天冬氨酸和谷氨酸作為催化親核試劑和催化質(zhì)子供體采用反轉(zhuǎn)機(jī)制切割糖苷鍵[44]。此外，部分GH43 家族的α-L-AFase 還同時(shí)具有α-木糖苷酶和α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性[45]。對來源于GH51家族α-L-AFase 的圓二色譜圖分析顯示它們的催化結(jié)構(gòu)域具有（β/α）8桶狀結(jié)構(gòu)，其質(zhì)子供體和親核谷氨酸分別在β-4 和β-7 鏈上，通過雙置換機(jī)制水解糖苷鍵，同時(shí)保留異位構(gòu)型[25,46]。GH51 家族的極少數(shù)酶同時(shí)也具有內(nèi)切木聚糖酶活性[47]。根據(jù)圓二色譜圖，GH54 家族的α-L-AFase 與β-三明治折疊的B 族糖苷水解酶相似，其催化結(jié)構(gòu)域分別以谷氨酸和天冬氨酸作為親核殘基和質(zhì)子供體，采用保留機(jī)制進(jìn)行催化作用[3]。首次被解析的GH62 家族的α-L-Afase 來源于真菌，也呈現(xiàn)出一個(gè)五葉片的β-螺旋槳褶皺的三維結(jié)構(gòu)類型，對阿拉伯糖具有絕對特異性[48]。屬于GH-F 家族的α-L-AFase 是GH62 家族的唯一一組酶，這些酶在釋放阿拉伯糖的同時(shí)，水解阿拉伯木聚糖中存在的單取代木糖殘基，作用于糖苷鍵的O-2 和O-3 位點(diǎn)[4,49]。近年來首次發(fā)現(xiàn)了來源于GH159家族的嗜熱α-L-AFase，該酶展示了較小的五葉片β-螺旋槳式的三維結(jié)構(gòu)，成為GH159 家族中首次被解析的具有阿拉伯呋喃糖苷水解酶活性的α-L-AFase[13]。

由此可以看出，α-L-AFase 的主要功能為切割α-L-阿拉伯呋喃糖苷鍵并去除α-L-阿拉伯糖取代基，但不同糖苷水解酶家族的α-L-AFase 的分子結(jié)構(gòu)和催化機(jī)制差異較大，顯示出不同α-L-AFase 在空間結(jié)構(gòu)與催化機(jī)制中的多樣性。隨著越來越多微生物來源的α-L-AFase 基因被挖掘和鑒定，對該酶結(jié)構(gòu)的認(rèn)識也進(jìn)入了飛速發(fā)展期。盡管到目前為止，眾多α-L-AFase 的結(jié)構(gòu)已被解析，但部分家族α-LAFase 的結(jié)構(gòu)特征尚未明確，未來α-L-AFase 是否存在更加多樣的催化機(jī)理仍有待探討。

4 α-L-AFase 與其他半纖維素水解酶的協(xié)同作用

前述對α-L-AFase 的性質(zhì)和催化機(jī)制的分析表明，α-L-AFase 的核心功能是去除阿拉伯木聚糖中的α-L-阿拉伯糖取代基，因而α-L-AFase 在半纖維素的生物降解及木質(zhì)纖維素的生物轉(zhuǎn)化中起到非常關(guān)鍵的作用。然而，阿拉伯木聚糖的結(jié)構(gòu)極為復(fù)雜，其高效酶解是由α-L-AFase、β-木聚糖酶、β-木糖苷酶等多種木聚糖降解酶共同作用的結(jié)果[2]。研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)雜底物的高效降解離不開多種水解酶的協(xié)同作用，α-L-AFase 也具有與其他半纖維素水解酶協(xié)同降解阿拉伯木聚糖的性質(zhì)[26,50]。

α-L-AFase 這一獨(dú)特性質(zhì)使得研究者們越來越關(guān)注該酶與哪些水解酶類能夠起到協(xié)同作用，以及如何提高該酶與其他水解酶類的協(xié)同催化效率。已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)α-L-AFase 與阿拉伯糖苷酶、木聚糖酶、木糖苷酶等多種水解酶均能協(xié)同降解特定底物，并且使底物轉(zhuǎn)化率明顯提高：如Leschonski 等[51]對分別來源于Humicola insolens和Talaromyces pinophilus的阿拉伯呋喃糖苷酶HiABF43_36a 和TpABF43_36b 的協(xié)同作用進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)當(dāng)以阿拉伯木聚糖為底物時(shí)，HiABF43_36a 與GH51 家族阿拉伯糖苷酶MgABF51 和GH62 家族阿拉伯糖苷酶PoABF62 共同作用產(chǎn)生了更多的單取代木糖基殘基，并多釋放了54%的阿拉伯糖，TpABF43_36b 與MgABF51、PoABF62 的協(xié)同作用導(dǎo)致底物多釋放了56%的阿拉伯糖。Puangpen 等[45]將來源于Paenibacillus curdlanolyticusB-6 中具有α-L-AFase 功能的蛋白PcAxy43B、PcAxy43A 與木聚糖酶Xyn10C 共同進(jìn)行降解，發(fā)現(xiàn)三種酶對阿拉伯木聚糖的降解產(chǎn)物幾乎全部為阿拉伯糖和木糖，底物轉(zhuǎn)化率達(dá)到95.33%；同樣，將來源于E.parvum的α-L-AFase（EpABF62A）與一種GH10 家族木聚糖酶、GH43 家族β-D-木糖苷酶和GH67 家族α-葡萄糖醛酸酶共同作用于添加了纖維素酶的玉米芯糖化過程中，葡萄糖、木糖和阿拉伯糖的轉(zhuǎn)化率分別達(dá)到94.0%、91.8%和82.6%[21]。多種研究結(jié)果表明，與單一使用α-L-AFase 降解阿拉伯木聚糖相比，聯(lián)合使用多種半纖維素降解酶系能夠顯著提高底物的水解效率和底物轉(zhuǎn)化率。這種多種酶參與降解底物的模式不僅能夠降低底物的水解成本，而且有助于推動復(fù)雜底物的高值化利用。因此，構(gòu)建更加穩(wěn)定的α-L-AFase 協(xié)同降解酶系統(tǒng)成為當(dāng)前推動和實(shí)現(xiàn)復(fù)雜底物降解的研究熱點(diǎn)。

5 α-L-AFase 的應(yīng)用

半纖維素的完全生物轉(zhuǎn)化離不開α-L-AFase 的關(guān)鍵作用，因而α-L-AFase 逐漸成為農(nóng)業(yè)和工業(yè)等領(lǐng)域中富有潛力的工具酶之一。隨著基因工程和酶工程技術(shù)的發(fā)展，越來越多的酶制劑生產(chǎn)實(shí)現(xiàn)了純度高、生產(chǎn)成本降低和生產(chǎn)周期縮短等優(yōu)點(diǎn)，實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中對α-L-AFase 的需求也日益增加。α-L-AFase廣泛應(yīng)用于提高面食制作質(zhì)量、果汁澄清、改善葡萄酒風(fēng)味、提高飼料利用率和特殊藥物成分研制等領(lǐng)域，在食品加工、飼料和醫(yī)療保健等行業(yè)起到了舉足輕重的作用。

5.1 在發(fā)酵面食制作中的應(yīng)用

小麥等農(nóng)作物的種子富含大量的阿拉伯木聚糖等半纖維素成分，同時(shí)也是面食類食品的主要來源。α-L-AFase 能夠與內(nèi)源小麥粉酶等水解酶共同將添加至小麥粉中的戊聚糖分解為游離態(tài)戊糖，從而提高酵母菌對糖類的利用率，在一定程度上促進(jìn)面團(tuán)發(fā)酵，同時(shí)改善發(fā)酵面食的質(zhì)地和口感[52-54]。Xue 等[54]將經(jīng)過來自Thermotoga marotima的木聚糖酶和α-L-AFase 處理后的麥麩添加至饅頭中，發(fā)現(xiàn)經(jīng)兩種酶處理后饅頭的抗延展性、軟化性、吸水性、延展性、穩(wěn)定時(shí)間、孔隙率和感官特性等均得到有效改善。Zhou 等[55]將T.marotima中 的α-L-AFase 與 來 自C.thermocellum的木聚糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域（CtXBD6）融合，發(fā)現(xiàn)融合酶能夠提高對不溶性阿拉伯木聚糖底物的催化性能，并增加以小麥粉為原料的面包的比體積、粘結(jié)性和彈性。越來越多的α-L-AFase 將應(yīng)用到發(fā)酵類面食的工業(yè)化制作之中，探究其合適配方、提高α-L-AFase 與其他水解酶的協(xié)同作用效率及健全食品的安全性評價(jià)制度將是未來值得思考的問題。

5.2 在果汁澄清中的應(yīng)用

水果中富含大量的碳水化合物多糖，其中也不乏半纖維素的存在。多糖、蛋白質(zhì)等物質(zhì)在果汁儲存過程中容易形成沉淀，而α-L-AFase 與果膠酶能夠聯(lián)合用于果汁的澄清，其中α-L-AFase 用于水解半纖維素的阿拉伯糖側(cè)鏈，而果膠酶可以消化果膠材料[56-57]。鼠李半乳糖醛酸聚糖I 果膠是植物初代細(xì)胞壁的主要成分，在商業(yè)雞尾酒制作尤其是其中的果汁澄清工藝中難以消化，向其中添加Aspergillus aculeatinusO822 來源的α-L-AFase 可將果汁粘度降低70%，而且果汁的過濾流速和產(chǎn)量均得到一定提升[58]。彭程等[59]發(fā)現(xiàn)向葡萄柚汁中添加15 U/mL的來自Aspergillus niger的α-L-AFase 可將果汁澄清度提高15.18%，表明α-L-AFase 也可以對柑橘類果汁有明顯的澄清作用。因此，α-L-AFase 在提高果汁溶解度和澄清度、優(yōu)化果汁制作工藝等方面發(fā)揮著獨(dú)特的優(yōu)勢。

5.3 在釀酒工業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用

除了在發(fā)酵面食制作及果汁澄清中具有重要作用，α-L-AFase 還可以應(yīng)用到葡萄酒、啤酒等釀酒工業(yè)中，用以改善釀造工藝。研究表明，葡萄酒最重要的品質(zhì)是其特有的香氣，在釀酒過程中添加α-LAFase 能夠增加葡萄酒的風(fēng)味，改善葡萄酒的品質(zhì)[60]。葡萄酒中絕大多數(shù)風(fēng)味物質(zhì)是游離形式的單萜類化合物，然而葡萄酒中的大多數(shù)單萜烯與糖類結(jié)合后不具有香氣[61-63]，α-L-AFase 和β-D-吡喃葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶等水解酶的協(xié)同作用可以高效分解與單萜烯結(jié)合的糖類物質(zhì)，并釋放單萜烯以促進(jìn)葡萄酒香味的形成[62,64]。例如Ravanal 等[65]從Penicillium purpurogenum中分離純化了一種α-LAFase（ABF3），并對同樣來源于該菌株的β-葡萄糖苷酶聯(lián)合應(yīng)用于葡萄酒的風(fēng)味增加進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)兩種酶的共同作用比商業(yè)酶制劑釋放更多的萜烯類物質(zhì)并生成更高的香氣指數(shù)。此外，α-L-AFase 也能夠降解啤酒生產(chǎn)中用到的大麥麥芽的阿拉伯糖側(cè)鏈，同時(shí)促進(jìn)其他水解酶對麥芽的分解，有效提高大麥麥芽汁的過濾速度，縮短啤酒的生產(chǎn)周期[66-67]。

5.4 在飼料領(lǐng)域的應(yīng)用

作為能夠分解阿拉伯木聚糖的水解酶，α-LAFase 在動物飼料加工領(lǐng)域也頗有優(yōu)勢。阿拉伯木聚糖屬于半纖維素，能夠?yàn)閯游锾峁┲匾臓I養(yǎng)物質(zhì)并促進(jìn)腸道蠕動，是多數(shù)食草類動物飼料的主要成分之一，然而很多食草動物由于自身不分泌分解半纖維素的酶而對飼料的吸收能力降低[68-70]。α-L-AFase能去除阿拉伯木聚糖中阿拉伯糖殘基的側(cè)鏈，因此在飼料生產(chǎn)過程中添加α-L-AFase 有助于提高半纖維素的利用率[71-72]。對肉雞飼料和一些雜糧混合飼料的研究表明，添加含有α-L-AFase 的飼料酶可以裂解飼料中阿拉伯木聚糖等一些聚合物之間的化學(xué)鍵，降低纖維類物質(zhì)在腸道中的粘度和有害作用，最終減少非淀粉多糖的營養(yǎng)抑制作用，提高動物對飼料營養(yǎng)成分的總消化率[73-74]。

5.5 在醫(yī)藥保健領(lǐng)域的應(yīng)用

α-L-AFase 在醫(yī)藥保健領(lǐng)域的主要應(yīng)用是參與制備生物活性物質(zhì)人參皂苷Rd 及功能性益生元。人參皂苷Rd 來源于人參，具有抗炎、保護(hù)神經(jīng)、抗氧化等多種特殊生物學(xué)活性，而人參皂苷Rc 為Rd 與α-L-阿拉伯呋喃糖苷鍵結(jié)合形成的糖苷[75-76]，因而可用α-L-AFase 水解人參皂苷Rc 上的α-L-阿拉伯呋喃糖苷殘基來制備獲得人參皂苷Rd[77-78]。據(jù)報(bào)道，多種微生物來源的α-L-AFase 都可以用于制備人參皂苷Rd，例如Bacillus subtilis、Thermotoga thermarum、C.saccharolyticus等[79-81]，其中多數(shù)α-L-AFase 表現(xiàn)出了良好的水解性能。此外，α-L-AFase還能夠高效地與木聚糖酶等水解酶協(xié)同降解玉米皮等農(nóng)副產(chǎn)物，產(chǎn)生具有益生元功能的木聚糖和阿拉伯低聚糖，為開發(fā)功能性保健食品提供了重要元素[82]。因此，α-L-AFase 在醫(yī)藥保健領(lǐng)域顯示出獨(dú)特的應(yīng)用潛力和優(yōu)勢，為人類的健康與發(fā)展提供了一定幫助。

6 結(jié)論與展望

α-L-AFase 因其具有水解半纖維素中α-L-阿拉伯呋喃糖苷基的特性，在改良發(fā)酵面食、果汁、釀酒等食品加工工藝、提高動物飼料利用率、制備功能性保健品等領(lǐng)域都具有重要的應(yīng)用前景。目前，研究者已對多種微生物來源的α-L-AFase 的酶學(xué)特性、結(jié)構(gòu)與催化機(jī)制、協(xié)同作用和應(yīng)用等方面開展多樣化的研究，并在該酶的重組菌株構(gòu)建和表達(dá)等方面取得了重大突破，使酶的活性、耐熱性和穩(wěn)定性得到提高。在此背景下，如何獲得應(yīng)用范圍廣泛、能高效發(fā)酵制備、靶向轉(zhuǎn)化和結(jié)構(gòu)修飾的新型α-L-AFase 將是未來的研究方向。然而，由于天然阿拉伯木聚糖底物的復(fù)雜性與多樣性，α-L-AFase 對不同類型底物的催化方式仍需進(jìn)一步探索，研究如何提高α-LAFase 與其他水解酶之間的協(xié)同作用效率仍具有突破和創(chuàng)新的空間。此外，酶研究的一個(gè)重要基礎(chǔ)是闡明酶的結(jié)構(gòu)和功能，以探索其催化機(jī)制和分子修飾。面對天然阿拉伯木聚糖底物的多樣性，研究不同家族α-L-AFase 對于不同底物的位點(diǎn)識別和降解機(jī)制，探索基于α-L-AFase 的多酶復(fù)合催化系統(tǒng)，也成為實(shí)現(xiàn)α-L-AFase 高效應(yīng)用的發(fā)展趨勢。