澤漆醇提取物抗氧化活性及對油酸誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞脂肪堆積的影響

甘露珍，姜 瓊，饒志威，張聰子，杜 光，章登政

（咸寧市中心醫(yī)院/湖北科技學(xué)院附屬第一醫(yī)院藥學(xué)部，湖北咸寧 437199）

澤漆（Euphorbia helioscopiaL.）是大戟科一年生草本植物，廣泛分布在中國各地，其作為一種藥用植物，幾十年來被廣泛用于治療水腫、痰咳、瘧疾、結(jié)痂和骨髓炎等多種疾病[8-9]，也被報道用作保健食品原料[10]。眾所周知，澤漆具有廣泛的生物活性，包括抗增殖、抗炎、驅(qū)蟲、抗菌、抗真菌、降脂和促傷口愈合等活性[11-13]。研究表明，澤漆的不同提取液及多種活性小分子成分在抑制腫瘤細(xì)胞生長與增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞遷移與侵襲等方面展現(xiàn)了抗腫瘤的作用[14-17]。有研究報道，澤漆提取物具有清除自由基的活性[18-19]；另有報道，澤漆提取物的抗氧化活性與抗糖尿病之間可能存在聯(lián)系[20-21]。然而，關(guān)于澤漆不同提取物抗氧化活性的對比研究較少，尤其是其對細(xì)胞脂肪堆積的研究鮮有報道。

本研究擬采用不同的溶劑提取澤漆有效成分，比較其抗氧化能力大小，并進(jìn)一步探討澤漆提取物對油酸誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞脂肪堆積的影響，為其抗氧化性與治療NAFLD 提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

澤漆干燥全草 為實驗室自制，經(jīng)粉碎、過40 目篩，備用；HepG2 細(xì)胞 美國典型生物庫（ATCC）；胎牛血清、DMEM 培養(yǎng)基 美國HyClone 公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2,2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）美國Alorich 公司；Foline-phehol 分析純，上海Biosharp公司；丁基羥基茴香醚（BHA）、二丁基羥基甲苯（BHT）、蘆丁（Rutin）、維生素C（VC）、乙二胺四乙酸（EDTA）等其它的分析試劑 上海晶純生物科技股份有限公司；MTT、油紅O 染料 美國Sigma 公司；甘油三脂（A110-1-1）、谷胱甘肽（A006-2-1）、超氧化物歧化酶（A001-3-2）活性、總抗氧化能力（A015-2-1）試劑盒 南京建成生物工程研究所。

HH-4 型水浴鍋 常州市華普達(dá)教學(xué)儀器有限公司；SB-5200 型超聲波清洗器 寧波新芝生物科技股份有限公司；Cary 60 型紫外可見分光光度計 美國安捷倫科技有限公司；Bio Tek Synergy 2 型多功能酶標(biāo)儀 美國伯騰儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 澤漆提取物的制備 參照文獻(xiàn)[22]進(jìn)行優(yōu)化，等量稱取6 份5.0 g 澤漆粉末放入錐形瓶中，分別用100 mL 的25%甲醇、25%乙醇、50%甲醇、50%乙醇、75%甲醇、75%乙醇預(yù)浸泡30 min，后30 ℃超聲30 min，超聲功率300 W，過濾，恒溫80 ℃水浴干燥，獲得提取物，依次命名為25%甲醇、25%乙醇、50%甲醇、50%乙醇、75%甲醇和75%乙醇。

1.2.2 DPPH 自由基的清除率測定 參照文獻(xiàn)[23]，采用DPPH 氧化法，將提取物用60%乙醇配成0.015～0.500 mg/mL 樣液，分別取20 μL 樣液加入200 μL 的0.004% DPPH 乙醇溶液中，立即混勻，室溫靜置30 min，以VC、Rutin、BHA、BHT 作陽性對照。用酶標(biāo)儀于517 nm 處測吸光度。樣品DPPH自由基的清除率計算公式見式（1）：

式中，A1為待測樣品與DPPH 作用后的吸光度值；A0為與樣液等體積的60%乙醇溶液與DPPH 作用后的吸光度值。

完成年度公益性水利工程維修養(yǎng)護(hù)資金合規(guī)性審核。對24個中西部地區(qū)、貧困地區(qū)省份的縣級國有管理單位及其所屬單位申報的2013年度中央財政補(bǔ)助資金項目，從項目范圍、項目類別、維修養(yǎng)護(hù)內(nèi)容、維修養(yǎng)護(hù)經(jīng)費等方面進(jìn)行合規(guī)性審核，涉及承擔(dān)防洪、排澇、抗旱、灌溉等公益性任務(wù)的水庫、水閘、堤防、控導(dǎo)工程、泵站、淤地壩等6類工程6 000多個項目。

1.2.3 ABTS+自由基的清除率測定 參照文獻(xiàn)[24]，將7 mmol/L ABTS+溶液與2.45 mmol/L 過硫酸鉀溶液混合，室溫避光16 h。用甲醇稀釋上述混合液，使混合液在734 nm 處吸光度為0.70±0.02。將提取物用60%乙醇配成一系列濃度樣液，分別取50 μL樣液加入100 μL 的混合液中，立即混勻，室溫靜置30 min，以VC、Rutin、BHA、BHT 作陽性對照。于734 nm 處測吸光度值。ABTS+自由基清除率計算公式見式（2）：

式中，A1為待測樣品與混合液反應(yīng)后的吸光度值，A0為等體積60%乙醇溶液與混合液作用后的吸光度值。

1.2.4 還原Fe3+能力測定 參照文獻(xiàn)[25]，在100 μL樣品溶液中加入100 μL 去離子水及25 μL 0.5 mmol/L FeCl2，立即于562 nm 處測吸光度值A(chǔ)1。加入25 μL 2.5 mmol/L 菲啰嗪，混勻后室溫避光反應(yīng)20 min，再測吸光度值A(chǔ)2。以EDTA 為陽性對照。Fe3+還原能力的計算公式見式（3）：

1.2.5 總酚含量測定 參照文獻(xiàn)[26]，取40 μL 樣品溶液（或沒食子酸溶液），加入360 μL 蒸餾水后再加入40 μL 福林酚試劑，混勻，5 min 后加入400 μL 7%碳酸鈉溶液，立即用蒸餾水稀釋至1 mL，充分混合，室溫孵育90 min，750 nm 測吸光度。以沒食子酸作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程y=0.112x-0.0544，R2=0.9993。樣品中的總酚以沒食子酸的含量表示，單位為1 mg 沒食子酸當(dāng)量/每克樣品。

1.2.6 總黃酮含量測定 參照文獻(xiàn)[27]，準(zhǔn)確稱取8 mg 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，用60%乙醇溶解后轉(zhuǎn)移到50 mL容量瓶并定容，然后配制成母液濃度為0.16 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液。分別移取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液0、0.2、1.0、1.8、2.6、3.4、4.2、5 mL 于25 mL 容量瓶中，加入1%的AlCl3乙醇溶液5 mL，pH5.5 的醋酸鈉緩沖鹽4 mL，再用60%乙醇液定容到25 mL。在200～400 nm 波長段進(jìn)行紫外掃描，于最大吸收波長275 nm 處測定吸光度，以對照品溶度C（μg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光值A(chǔ) 為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，回歸方程為y=0.0347x-0.0068，R2=0.9996。

1.2.7 細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)HepG2 細(xì)胞，并置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱，備用。

1.2.8 MTT 實驗 將澤漆50%乙醇提取物粉末采用DMSO 溶解配制成濃度為10 mg/mL 的澤漆50%乙醇提取物溶液。取生長狀態(tài)良好的HepG2細(xì)胞以每孔5×103個接種于96 孔板中，待細(xì)胞生長至70%融合度時，采用0、25、50、100、200、400、800、1600 μg/mL 澤漆50%乙醇提取物處理HepG2細(xì)胞24 h。每孔加入20 μL MTT 后，放置培養(yǎng)箱中孵育4 h 后，棄掉液體，每孔再加150 μL DMSO，振蕩10 min 充分溶解，酶標(biāo)儀在490 nm 處測定A 值（A490），并以空白孔調(diào)零，以A490值代表增殖活性。

1.2.9 油酸誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞脂肪堆積模型的建立及分組 取生長狀態(tài)良好的HepG2 細(xì)胞以每孔2×105個接種于6 孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞生長至70%融合度時，采用0.2 mmol/L 油酸（OA）刺激HepG2 細(xì)胞24 h 構(gòu)建脂肪堆積模型[21]。根據(jù)實驗?zāi)康脑O(shè)置對照組、油酸組（OA 組）、油酸+澤漆50%乙醇提取物低、中、高劑量組（20.0、40.0、60.0 μg/mL），油酸和澤漆50%乙醇提取物干預(yù)同時進(jìn)行，干預(yù)時間為24 h。其中對照組加100 μL DMEM 培養(yǎng)基，OA 組加50 μL 油酸溶液和50 μL DMEM 培養(yǎng)基，油酸+澤漆醇提取物組加50 μL 油酸溶液和50 μL 含澤漆醇提取物的DMEM 培養(yǎng)基。

1.2.10 油紅O 染色 取生長狀態(tài)良好的HepG2 細(xì)胞以每孔2×105個接種于6 孔培養(yǎng)板，按1.2.9 分組處理。棄去上清，PBS 洗3 次，10%福爾馬林固定40 min，PBS 洗3 次，用油紅O 染色液室溫染色20 min，PBS 洗2 次，置于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)脂滴染色情況。

1.2.11 TG、GSH、T-AOC 含量和SOD 活性測定取生長狀態(tài)良好的HepG2 細(xì)胞以每孔2×105個接種于6 孔培養(yǎng)板，按1.2.9 分組處理。棄去上清，PBS洗3 次。收集細(xì)胞，冰上裂解30 min，按照試劑盒說明書的操作步驟測定TG、GSH、T-AOC 含量和SOD活性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本研究數(shù)據(jù)均采用SPSS22.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，并以均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 澤漆不同醇提取物對DPPH 自由基的清除作用

如圖1 所示，25%甲醇、25%乙醇、50%甲醇、50%乙醇、75%甲醇和75%乙醇各組澤漆醇提取物在濃度0.015～0.500 mg/mL 的范圍內(nèi)，隨著濃度的增加，對DPPH 自由基的清除活性逐漸增強(qiáng)，其中在0.030～0.500 mg/mL 的范圍內(nèi)，50%乙醇組活性最強(qiáng)（P＜0.05）。

2.2 澤漆不同醇提取物對ABTS+自由基的清除作用

如圖2 所示，25%甲醇、25%乙醇、50%甲醇、50%乙醇、75%甲醇和75%乙醇各組澤漆醇提取物在濃度0.010～0.080 mg/mL 的范圍內(nèi)，隨著濃度的增加，對ABTS+自由基的清除活性逐漸增強(qiáng)，其中在0.010～0.040 mg/mL 的范圍內(nèi)50%乙醇組清除活性最強(qiáng)（P＜0.01），并在濃度為0.080 mg/mL 時，達(dá)到最高值。

圖2 澤漆不同醇提取物對ABTS+自由基的清除活性Fig.2 ABTS+ radical scavenging activity of different alcohol extracts of Euphorbia helioscopia

2.3 澤漆不同醇提取物對Fe3+的還原力

如圖3 所示，25%甲醇、25%乙醇、50%甲醇、50%乙醇、75%甲醇和75%乙醇各組澤漆醇提取物在濃度0.125～2.000 mg/mL 的范圍內(nèi)，隨著濃度的增加，對Fe3+的還原力逐漸增強(qiáng)。在0.063～2.000 mg/mL 的范圍內(nèi)，50%乙醇組和50%甲醇組還原能力明顯比75%甲醇和75%乙醇組強(qiáng)（P＜0.001）；在濃度為0.063、0.125 mg/mL 時，50%乙醇組和50%甲醇組還原能力明顯比25%甲醇和25%乙醇組強(qiáng)（P＜0.001），隨著濃度升高，四組還原能力有所波動，并在2 mg/mL 時螯合率接近100%。綜上所述，在各組澤漆醇提取物中，50%乙醇提取物還原能力較高。有研究報道，澤漆甲醇和乙醇提取物具有抗氧化活性，其純甲醇提取物對DPPH 和ABTS+的清除能力比純乙醇提取物更強(qiáng)，分析原因可能是純甲醇提取物中總酚和總黃酮含量比純乙醇提取物中高[15]。因此，本研究接下來檢測比較各組總酚和總黃酮含量。

圖3 澤漆不同醇提取物對Fe3+的還原力Fig.3 Fe3+ reducing power of different alcohol extracts of Euphorbia helioscopia

2.4 澤漆不同醇提取物中的總酚和總黃酮含量

多種酚類和黃酮類化合物具有抗氧化活性[28]，本研究通過化學(xué)方法檢測各組總酚和總黃酮含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，50%乙醇提取物總酚和總黃酮含量均較高，與其更高的抗氧化活性相符。如圖4 所示，測得25%甲醇、25%乙醇、50%甲醇、50%乙醇、75%甲醇和75%乙醇各組澤漆醇提取物中總酚和總黃酮含量，其中50%乙醇組的總酚含量明顯高于25%甲醇組、50%甲醇組和25%乙醇組（P＜0.05），而與75%甲醇組和75%乙醇組相比，無顯著性差異（P=0.905 和0.314）。50%乙醇組的總黃酮含量明顯高于25%甲醇組、50%甲醇組和25%乙醇組（P＜0.05），而與75%甲醇組和75%乙醇組相比，無顯著性差異（P=0.171 和0.155）。

圖4 澤漆不同醇提取物中的總酚和總黃酮含量Fig.4 Contents of total phenol and total flavone in different alcohol extracts of Euphorbia helioscopia

相對于其它組澤漆醇提取物，澤漆50%乙醇提取物的DPPH 自由基和ABTS+自由基的清除作用更強(qiáng)，對Fe3+的還原力也較高，并且其提取物中總酚和總黃酮含量也較高，與其高抗氧化活性相符。故選取澤漆50%乙醇提取物進(jìn)行下一步研究。

2.5 澤漆50%乙醇提取物對HepG2 細(xì)胞脂肪堆積的影響

MTT 檢測HepG2 細(xì)胞增殖活性（圖5），與空白組相比，100～1600 μg/mL 澤漆50%乙醇提取物各干預(yù)組HepG2 細(xì)胞增殖活性明顯降低，具有濃度依賴性（P＜0.001），IC50值為237.486 μg/mL。選取細(xì)胞抑制率在15%范圍內(nèi)的最大澤漆50%乙醇提取物濃度60.0 μg/mL 作為后續(xù)實驗的高劑量組，按照等比例設(shè)置中、低濃度組，即40、20 μg/mL 澤漆50%乙醇提取物作為后續(xù)實驗處理HepG2 細(xì)胞的中、低劑量。

圖5 不同濃度澤漆50%乙醇提取物對HepG2 細(xì)胞增殖活性的影響Fig.5 Effects of different concentrations of 50% ethanol extract of Euphorbia helioscopia on the proliferation activity of HepG2 cells

油酸誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞脂肪堆積模型常用來評價藥物對肝細(xì)胞脂肪堆積的干預(yù)[21]。油紅O 染色觀察各組細(xì)胞內(nèi)脂滴形成情況（橘紅色油滴，用紅色箭頭標(biāo)記），與對照組相比，OA 組細(xì)胞內(nèi)大量油滴堆積，說明脂肪堆積模型建立成功；與OA 組相比，隨著澤漆50%乙醇提取物濃度的增加，HepG2 細(xì)胞內(nèi)油滴堆積量逐漸減少，具有一定的濃度依賴性（圖6），說明澤漆乙醇提取物可以抑制HepG2 細(xì)胞內(nèi)脂肪堆積。GPO-PAP 法測定結(jié)果顯示，對照組、OA 組及50%乙醇提取物低、中、高劑量組HepG2 細(xì)胞中TG 含量分別為（0.111±0.015）、（0.286±0.010）、（0.238±0.004）、（0.207±0.005）和（0.176±0.010）mmol/g，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=142.125，P＜0.001）。與對照組比較，OA 組HepG2 細(xì)胞中TG 含量顯著上升（P＜0.001）；與OA 組比較，50%乙醇提取物低、中、高劑量組HepG2 細(xì)胞中TG 含量均顯著降低（P＜0.001），具有濃度依賴性。結(jié)果說明，澤漆乙醇提取物可以增強(qiáng)HepG2 細(xì)胞內(nèi)源性抗氧化能力，并且具有濃度依賴性。

圖6 HepG2 細(xì)胞油紅O 染色（400×）Fig.6 Oil red O staining of HepG2 cells (400×)

2.6 澤漆50%乙醇提取物對HepG2 細(xì)胞內(nèi)源性抗氧化能力的影響

如表1 所示，與對照組比較，OA 組HepG2 細(xì)胞中GSH 和T-AOC 含量及SOD 活性顯著降低（P＜0.001）；與OA 組比較，50%乙醇提取物低、中、高劑量組HepG2 細(xì)胞中GSH 含量（P＜0.05）和T-AOC含量（P＜0.001）明顯上升，SOD 活性也顯著上升（P＜0.001），具有濃度依賴性。

表1 澤漆50%乙醇提取物對HepG2 細(xì)胞中GSH、T-AOC含量和SOD 活性的影響（n=3，±s）Table 1 Effects of Euphorbia helioscopia 50% ethanol extract on GSH,T-AOC content and SOD activity in HepG2 cells (n=3,±s)

表1 澤漆50%乙醇提取物對HepG2 細(xì)胞中GSH、T-AOC含量和SOD 活性的影響（n=3，±s）Table 1 Effects of Euphorbia helioscopia 50% ethanol extract on GSH,T-AOC content and SOD activity in HepG2 cells (n=3,±s)

注：與對照組比較，***P＜0.001；與OA組比較，#P＜0.05，###P＜0.001。

3 討論與結(jié)論

本研究分別用25%、50%、75%的甲醇或乙醇作為溶劑對澤漆進(jìn)行提取，通過體外抗氧化活性檢測方法比較其抗氧化能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這六種澤漆提取物均具有抗氧化活性，且具有濃度依賴性，相對于其它組澤漆醇提取物，澤漆50%乙醇提取物的DPPH自由基和ABTS+自由基的清除作用更強(qiáng)，對Fe3+的還原力也較高，總體上50%乙醇提取物抗氧化效果更佳。多種酚類和黃酮類化合物具有抗氧化活性，本研究通過化學(xué)方法檢測各組總酚和總黃酮含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，50%乙醇提取物總酚和總黃酮含量均較高，與其高抗氧化活性呈正相關(guān)。有研究報道，澤漆提取物具有抗氧化和抗糖尿病活性，而且甲醇提取物中總酚和總黃酮含量比乙醇提取物中高，并且甲醇提取物對DPPH 和ABTS+的清除能力更強(qiáng)[21]。分析原因，可能是兩者的提取方法不同，導(dǎo)致提取物中總酚和總黃酮含量不同，此外本研究中相同濃度的甲醇和乙醇提取澤漆也有75%甲醇提取物中總黃酮比75%乙醇提取物含量高的情況。

本研究用油酸誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞建立脂肪堆積模型，并進(jìn)一步探討澤漆50%乙醇提取物對油酸誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞脂肪堆積的影響。與空白組相比，100～1600 μg/mL 各組細(xì)胞增殖活性明顯降低，具有濃度依賴性。根據(jù)其IC15值，選取無毒副作用的劑量作為后續(xù)實驗的干預(yù)劑量。結(jié)果顯示，OA 組細(xì)胞內(nèi)大量油滴堆積，脂肪堆積模型建立成功；而澤漆50%乙醇提取物可以減少細(xì)胞內(nèi)油滴堆積，降低TG 含量，存在濃度依賴性，說明澤漆乙醇提取物可以抑制HepG2 細(xì)胞內(nèi)脂肪堆積。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，澤漆50%乙醇提取物可以促進(jìn)HepG2 細(xì)胞內(nèi)GSH和T-AOC 含量上升和SOD 活性上升，具有濃度依賴性。結(jié)果說明，澤漆乙醇提取物可以增強(qiáng)HepG2細(xì)胞內(nèi)源性抗氧化能力。這可以為將澤漆醇提取物用于NAFLD 治療提供新的理論依據(jù)。然而，有研究報道，澤漆乙酸乙酯提取物可能誘導(dǎo)MDA-MB-231 細(xì)胞中ROS 過量生成，通過線粒體損傷途徑促進(jìn)凋亡，從而抑制細(xì)胞生長[29]。澤漆提取物在細(xì)胞發(fā)揮的作用是否跟提取方式和細(xì)胞類型有關(guān)，有待于進(jìn)一步研究。當(dāng)然，本研究未對澤漆提取物做進(jìn)一步提純質(zhì)譜分析，探討某種或某類化合物的抗氧化作用，對此課題組后期將進(jìn)行更加深入細(xì)致的研究。

綜上所述，澤漆甲醇和乙醇提取物均具有抗氧化活性，其中以50%乙醇提取物抗氧化效果最佳，且其可以抑制油酸誘導(dǎo)的HepG2 細(xì)胞脂肪堆積，并增強(qiáng)HepG2 細(xì)胞內(nèi)源性抗氧化能力。