QuEChERS-超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法測定動物源性食品中30 種抗寄生蟲類藥物殘留

馮麗鳳，黃 芊，葉夢薇，黃永輝，黃 燕，林浩學，梁 敏，許 暉

（福建省產(chǎn)品質量檢驗研究院 國家加工食品質量監(jiān)督檢驗中心，福建福州 350002）

動物在生長過程中由于食物和環(huán)境原因常會感染寄生蟲病。寄生蟲病是動物的主要疾病之一，導致動物生產(chǎn)性能下降甚至死亡，影響畜牧養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展和經(jīng)濟效益，甚至威脅人類的健康[1]。為了預防和治療動物寄生蟲病，大量抗寄生蟲藥物被應用于養(yǎng)殖過程。目前使用傳統(tǒng)化學合成類藥物居多，也有一些中草藥被補充使用[2]。常規(guī)抗蟲藥作用時間有限，需要反復用藥，也造成了其在動物體內的蓄積。食用抗寄生蟲藥物殘留較多的畜禽產(chǎn)品會對機體健康產(chǎn)生危害，如引起人體的過敏反應或急性中毒，甚至可能致畸或致癌[3-4]。我國以及歐盟、美國、日本等國家都已將多種抗寄生蟲類藥物列入限制使用的獸藥藥物中，并制訂出各種抗寄生蟲類藥物（包括其某些代謝物）在不同動物體內（包括肌肉、組織、奶等）的最高殘留限量（maximum residue limit，MRL）[5]。中國于2019 年9 月6 日發(fā)布了GB 31650-2019《食品安全國家標準食品中獸藥最大殘留限量》，其中對動物性食品有最大殘留量規(guī)定的獸藥共104 種，而抗寄生蟲藥物達55 種[6]。

目前檢測分析抗寄生蟲藥物的方法主要包括高效液相色譜法[7-8]、液相色譜-串聯(lián)質譜法[9-22]、酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）[23-24]、免疫層析試紙法[25]、毛細管電泳法[26]等，其中液相色譜-串聯(lián)質譜法相對于其他方法，具有準確性和靈敏度高，選擇性和抗干擾性較強，可實現(xiàn)多目標組分同時分析等優(yōu)勢，被廣泛應用于動物源性食品中獸藥殘留的分析測定。陳瑞等[9]采用超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法測定牛奶和奶粉中五種苯并咪唑類藥物；溫海濱等[10]和Xu等[11]采用超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法測定水產(chǎn)品中苯并咪唑類藥物；張紹偉等[12]采用超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法測定牛奶中的三聚氰胺、環(huán)丙氨嗪、地昔尼爾；Zhao 等[13]、奚照壽等[14]和Wang 等[15]分別采用超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法測定牛肉、雞肉、雞蛋中的抗球蟲藥物；吳映璇等[17]采用高效液相色譜-串聯(lián)質譜法測定乳制品中的莫奈太爾及其代謝物；張敏等[18]采用超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法測定牛乳中硝碘酚腈等6 種獸藥殘留?？梢娊陙韲鴥韧鈱辜纳x類藥物殘留的研究大多是針對單個抗寄生蟲藥物、單一類別或者作用機制相似的幾種藥物進行分析，且適用的樣品基質也比較單一。目前針對抗寄生蟲藥物殘留的檢測缺少一種可同時檢測多種抗寄生蟲藥物且適用于多種樣品基質的檢測方法，難以滿足現(xiàn)代分析技術快速、高效的要求。

本方法通過對儀器和前處理方法的優(yōu)化，采用超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法，實現(xiàn)了動物源性食品（畜禽肉、水產(chǎn)品、牛奶、雞蛋）中共計30 種抗寄生蟲類藥物殘留的檢測。該方法具有高效、快速、檢測成本低、靈敏度高的特點，是一種高通量的篩查方法，可為相關監(jiān)管部門監(jiān)控動物源性食品中的抗寄生蟲藥物殘留提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

動物源性食品 畜禽肉、水產(chǎn)品、牛奶、雞蛋均購自本地市場；氨丙啉、地昔尼爾、羅硝唑、雙咪苯脲、左旋咪唑、噻苯達唑、奧芬達唑、常山酮、乙氧酰胺苯甲酯、奧苯達唑、甲苯咪唑、氟苯達唑、阿苯達唑、吡喹酮、氯苯胍、芬苯達唑、非班太爾、三氯苯達唑、癸氧喹酯、莫西克丁、米爾貝肟、莫能霉素、拉沙洛西、鹽霉素、馬杜霉素、甲基鹽霉素、硝碘酚腈、硝唑尼特、莫奈太爾、氯氰碘柳胺 德國Dr.Ehrenstorfer 公司；甲酸、乙腈、甲醇、甲酸銨、二甲亞砜 色譜純，德國Merck 公司；氨水、乙酸乙酯、無水硫酸鈉、無水硫酸鎂 分析純，西隴科學股份有限公司；乙二胺-N-丙基甲硅烷（PSA，粒度4 μm）、十八烷基鍵合硅膠吸附劑（ODS-C18，粒度4 μm）日本GL Sciences 公司；Milli-Q 超純水（電導率＞18.2 mΩ）美國Millipore 公司；0.22 μm 聚四氟乙烯（PTFE）濾膜 美國ASC 公司。

LC-30AD 超高效液相色譜儀、Shimadzu 8050三重四極桿-串聯(lián)質譜儀 日本島津公司；ACQUITY UPLCTMBEH C18色譜柱（2.1×100 mm，1.7 μm）美國Waters 公司；BT 224 S 電子分析天平 德國Sartorius 公司；Aanti J-E 高速冷凍離心機 美國Beckman Coulter 公司；Milli-Q 超純水純化系統(tǒng) 美國Millipore 公司；DS-8510 DTH 超聲波振蕩器 上海分析超聲儀器有限公司；MS 3 basic 旋渦混均器美國IKA 公司；AUTO EVA-80 自動氮吹儀 中國?？乒尽?/p>

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液的配制 標準儲備液：分別稱取適量固體標準品，用合適的溶劑溶解并定容至10 mL 容量瓶中，配制成約100 mg/L 的儲備液，-18 ℃避光密閉保存。（雙咪苯脲、三氯苯達唑、氟苯達唑、甲苯咪唑、噻苯達唑、阿苯達唑、芬苯達唑、奧芬達唑、奧苯達唑、非班太爾用適量二甲亞砜溶解并用甲醇定容；其它藥物標準品用甲醇溶解并定容）

混合標準中間液：分別移取一定量的各個標準儲備液用乙腈定容至刻度線，配制成混合標準物質中間液（表1），4 ℃避光密閉保存。

表1 30 種抗寄生蟲類藥物濃度、線性方程、決定系數(shù)（r2）檢出限及定量限Table 1 Concentration,regression equations,coefficient of determination (r2),LODs,LOQs of the 30 antiparasitic drugs

基質匹配系列標準溶液：取適量體積的混合標準物質中間液，用空白基質提取液稀釋成標準系列工作曲線溶液（表1），上機測試。

1.2.2 樣品前處理 準確稱取均質后的試樣2 g（精確至 0.0001 g）于 50 mL 離心管中，加入5 g 無水硫酸鈉，加入5 mL 乙腈，渦旋30 s，超聲提取20 min，以4000 r/min 離心5 min，上清液轉移至另一50 mL離心管中，殘渣中加入5 mL1%氨水乙酸乙酯重復提取一次，離心，合并2 次上清液，待凈化。將提取液加入到含有200 mg 無水硫酸鎂、100 mg C18和100 mg PSA 的離心管中，渦旋2 min，離心，取5 mL凈化后的上清液，于40 ℃氮氣吹至近干，用1.00 mL 50%乙腈-水溶液復溶，過PTFE 濾膜，上機測試。

1.2.3 液相色譜-串聯(lián)質譜條件 液相色譜條件：色譜柱：ACQUITY UPLCTMBEH C18（2.1×100 mm，1.7 μm）；流動相：A 為10 mmol/L 甲酸銨（含0.1%甲酸）水溶液，B 為乙腈:甲醇（50:50）；流速：0.30 mL/min；柱溫：40 ℃；進樣量：2 μL；洗脫梯度：0～1.00 min，10% B；1.00～9.00 min，10%～95% B；9.00～12.00 min，95% B；12.01～14.00 min，10 % B。

質譜條件：電噴霧離子源正負離子切換模式；多反應監(jiān)測模式；加熱塊溫度：400 ℃；加熱氣流速：10.0 L/min；接口電壓（ESI+：+4000 V，ESI-：-3000 V）；霧化氣流速：2.5 L/min；干燥氣流速：10.0 L/min；脫溶劑溫度：600 ℃；定性離子、定量離子及其他質譜參數(shù)見表2。

表2 目標化合物的質譜參數(shù)Table 2 Mass parameters of analytes mass parameters of analytes

1.2.4 定性及定量處理 定性處理：在同樣測試條件下，試樣溶液中各目標物的保留時間與基質匹配標準溶液中相應目標物的保留時間，偏差在±2.5%以內，且檢測到的相對離子豐度，應當與濃度相當?shù)幕|匹配標準溶液相對離子豐度一致。（相對離子豐度允許偏差應符合以下要求：當相對離子豐度＞50%時，允許的最大偏差為±20%；當相對離子豐度介于20%～50%時，允許的最大偏差為±25%；當相對離子豐度介于10%～20%時，允許的最大偏差為±30%；當相對離子豐度≤10%時，允許的最大偏差為±50%。）

定量處理：按照1.2.3 設定儀器條件，以基質匹配標準溶液濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標，繪制標準工作曲線作多點校準，按外標法計算試樣中藥物的殘留量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

UPLC-MS/MS 配有 LabSolutions 數(shù)據(jù)處理軟件建立標準曲線、計算結果，采用 Microsoft Excel 處理數(shù)據(jù)及繪制圖表。譜圖為 Origin 2018 做圖軟件繪制。

2 結果與分析

2.1 質譜條件的優(yōu)化

分別取適量儲備液以50% 乙腈稀釋成濃度約為1.0 mg/L 的單個標準使用液進入質譜，分別選擇正、負離子模式進行一級全掃描，確定各目標化合物的母離子。本研究涉及的大多數(shù)目標藥物在正離子模式下離子強度更高，如阿咪唑類、聚醚類、化學合成抗球蟲藥等更易形成帶正電荷的離子，如[M+H]+、[M+Na]+；小部分目標藥物在負離子模式下離子響應更好，如硝碘酚腈、氯氰碘柳胺、硝唑尼特、莫奈太爾更易失去質子生成帶負電荷的離子[M-H]-。將得到的母離子施加一定的碰撞能量進行 Product Ion（MS2）掃描，獲得各自的二級碎片離子，選擇 2 個信號較強且干擾小的碎片離子與其母離子組成監(jiān)測離子對。再將得到的母離子和碎片離子，采用多反應監(jiān)測模式進行儀器自動優(yōu)化各化合物的四級桿1 電壓、碰撞電壓和四級桿3 電壓，定量和定性離子見表2。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

2.2.1 色譜柱的選擇 本研究涉及的藥物多為中等極性或弱極性的化合物，現(xiàn)有研究多采用C18 及T3 色譜柱進行檢測。本研究考察了ACQUITY UPLCTMBEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）、ACQUITY UPLCTMHSS T3（2.1 mm×150 mm，1.8 μm）的分離效果。結果表明，在相同液相條件下大多數(shù)化合物在T3 柱及C18柱上的的峰形并無太大差異，但雙咪苯脲、米爾貝肟、拉沙洛西在BEH C18柱上的峰形及響應優(yōu)于T3 柱。且T3 柱對大多數(shù)化合物的保留比C18柱強，但部分弱極性物質保留過強，洗脫耗時更長。最終根據(jù)分離效果、峰型及保留時間的穩(wěn)定性，本研究選擇ACQUITY UPLCTMBEH C18色譜柱作為分析柱。

2.2.2 流動相的選擇 本研究比較了采用乙腈-水和甲醇-水作為流動時的分離效果與保留情況，結果表明乙腈洗脫能力更強，藥物出峰時間更早也更密集，且洗脫時會產(chǎn)生較多雜峰。而使用甲醇為有機相時雜峰較少，但有部分極性較弱的聚醚類藥物如拉沙洛西、馬杜梅素、鹽霉素等無法洗脫下來。故選擇采用甲醇和乙睛的混合溶劑作為有機相。當甲醇和乙睛的比例為50:50 時，各藥物的分離度與保留時間較為合適。本研究的大部分目標藥物采用ESI+模式進行檢測，加入甲酸可以有效改善峰形，提高質子化能力，增強響應。但部分目標化合物如米爾貝肟、三氯苯達唑、莫西克丁、莫奈太爾、癸氧喹酯、鹽霉素、甲基鹽霉素等仍然出現(xiàn)不同程度的拖尾現(xiàn)象。加入甲酸銨，甲酸銨溶液中的NH4+可競爭性地與色譜柱中的硅羥基結合，從而減少色譜峰的拖尾現(xiàn)象[27]。經(jīng)實驗比對，最終采用10 mmol/L 甲酸銨（含0.1%甲酸）水溶液-乙腈:甲醇（50:50）作為流動相，能夠最大程度地兼顧全部目標化合物的峰形與響應。優(yōu)化后得到的30 種抗寄生蟲類藥物的總離子流色譜圖見圖1。

圖1 30 種抗寄生蟲藥物總離子流色譜圖（10 μg/L）Fig.1 TIC chromatogram of the 30 antiparasitic drugs(10 μg/L)

2.3 提取溶劑的選擇

由于本研究涉及的藥物種類較多，且各類藥物性質差異較大。本研究選擇了研究對象中具有代表性的4 種動物源性食品基質：豬肉、魚肉、雞蛋、牛奶，采用空白添加試驗比較了乙腈、甲醇、乙酸乙酯、1%氨水乙酸乙酯的提取效果，添加水平為10 μg/kg。結果表明乙睛對大部分藥物的回收率較好，尤其是對于極性較強的氨丙啉、常山酮、地昔尼爾、羅硝唑等化合物的提取效率明顯優(yōu)于其他提取溶劑，且乙腈沉淀蛋白效果較好，提取液比較清亮，雜質含量少。而1%氨水乙酸乙酯對聚醚類等極性較弱藥物的回收率明顯優(yōu)于乙腈、甲醇。對氨丙啉、雙咪苯脲、氯氰碘柳胺和部分聚醚類抗生素，乙腈和1%氨水乙酸乙酯表現(xiàn)出了互補的優(yōu)勢，圖2 為豬肉空白樣品添加實驗結果。為避免氨水對其他藥物提取效率的影響，最終選擇先用乙腈提取，再用1%氨水乙酸乙酯提取的方式進行復合提取。

圖2 提取溶劑的選擇（n=3）Fig.2 Selection of extraction solvents (n=3)

2.4 凈化方式的優(yōu)化

本研究采用 QuEChERS 凈化方式，常用的QuEChERS 凈化劑有N-丙基乙二胺（PSA）、十八烷基鍵合硅膠（C18）、石墨碳化黑（GCB）、無水硫酸鎂等。C18 能夠去除脂肪、蛋白質、礦物質等化合物，石墨化碳黑（GCB）的作用是去除色素和甾醇類干擾，PSA 可以去除有機酸、色素、金屬離子和酚類化合物，無水硫酸鎂則主要利用其鹽析和除水作用[28]。本研究對 C18、PSA、GCB 以及無水硫酸鎂的凈化效果進行了考察。分別僅添加其中一種凈化劑50 mg 于5 mL 空白（豬肉、魚肉、雞蛋、牛奶）添加提取液中進行凈化。實驗結果表明GCB 對大多數(shù)強極性及中等極性化合物有較強的吸附作用，大部分化合物回收率低于30%；C18、PSA 未發(fā)現(xiàn)明顯的吸附現(xiàn)象。因此本研究選用C18、PSA 以及無水硫酸鎂作為凈化劑。并對凈化劑的用量進行考察，當無水硫酸鎂為 200 mg，C18 為 100 mg，PSA 為 100 mg時，各目標物在豬肉、魚肉、雞蛋、牛奶基質中回收率和凈化效果均為最優(yōu)。

2.5 濾頭和復溶液的選擇

將不同乙腈比例的水溶液配制的標準品溶液分別過尼龍濾膜和PTFE 濾膜后進行測定，當乙腈比例低于40%時，尼龍濾膜和PTFE 濾膜都對多種弱極性化合物如聚醚類化合物有明顯的吸附現(xiàn)象。而當乙腈比例大于40%，PTFE 濾膜不再吸附任何目標化合物，但尼龍濾膜對奧芬達唑、常山酮、乙氧酰胺苯甲酯、芬苯達唑、拉沙洛西、硝唑尼特、氯氰碘柳胺仍存在不同程度的吸附，因此選擇采用PTFE 濾膜。測定不同比例乙腈水配制的標準溶液，結果表明當乙腈比例介于20%～60%時，各化合物的響應最優(yōu)，當乙腈比例＞70%后多數(shù)化合物響應有所下降。因此選擇 50%乙腈水溶液作為樣品復溶液，采用PTFE濾膜。

2.6 基質效應的評價

基質效應（matrix effect，ME）是由于待測液中的雜質和目標化合物在離子源端競爭離子化導致目標化合物的響應增強或者抑制的效應[10]。計算公式為ME（%）=（基質匹配標準溶液曲線斜率/溶劑標準溶液曲線斜率-1）×100%。當ME 為正值時表示基質增強，反之則為基質抑制，絕對值越大則表示基質效應越強。本研究對豬肉、草魚、雞蛋和牛奶進行了基質效應評估，具體結果見表3、4。結果顯示，豬肉基質效應介于-24.3%～19.0%；魚肉基質效應介于-22.7%～4.39%；雞蛋基質效介于-17.3%～15.0%；牛奶基質效介于-22.4%～18.2%，每種基質均出現(xiàn)部分化合物基質效應大于10%。因此本研究采用基質匹配曲線外標法定量。

表3 豬肉和草魚在不同加標水平下30 種抗寄生蟲類藥物的加標回收率與精密度（n=6）Table 3 Recovery and precision of 30 antiparasitic drugs in pork and grass carp at different labeling levels (n=6)

表4 雞蛋和牛奶在不同加標水平下30 種抗寄生蟲類藥物的加標回收率與精密度（n=6）Table 4 Recovery and precision of 30 antiparasitic drugs in egg and milk at different labeling levels (n=6)

2.7 方法學驗證

2.7.1 線性范圍、檢出限 選取不含目標化合物的空白豬肉樣品，用 1.2.2 的前處理方法，得到空白基質提取液，制備基質標準系列溶液，上機測定。以定量離子對的峰面積作為Y 軸，質量濃度（μg/L）作為X 軸繪制標準曲線。中間液濃度、線性范圍濃度、線性回歸方程、檢出限、定量限見表1。從表1 可以看出，在各自的線性范圍內30 種抗寄生蟲類藥物線性關系較好，相關系數(shù)（r2）＞0.99。此外，分別以空白豬豬肉、草魚、雞蛋和牛奶為基質，進行加標回收試驗，以3 倍信噪比和10 倍信噪比確定檢出限和定量限。30 種化合物在不同基質中的檢出限在0.001～0.3 μg/kg 之間，定量限在0.004～1 μg/kg 之間（表1），均低于文獻檢出限[10,13,19,28-30]。

2.7.2 準確度與精密度 在優(yōu)化后的實驗條件下，分別在不含目標物的豬肉、草魚、雞蛋、牛奶樣品中做3 個添加水平的加標回收試驗，每個水平做6 個平行，回收率和精密度結果見表3、4。在3 個不同添加水平下，30 種抗寄生蟲藥物的加標回收率為70.1%～111%，相對標準偏差（RSD）為0.10%～9.1%，表明方法的準確度和精密度均較好，適用于動物源性食品中抗寄生蟲藥物殘留的定性定量分析。

2.8 實際樣品測定

本研究采用新建立的方法對市場上購買的豬肉、雞鴨肉、牛羊肉、魚肉、雞蛋、牛奶共計150 批次樣品進行檢測分析。檢出了噻苯達唑、阿苯達唑、癸氧喹酯、莫能霉素、馬杜霉素、甲基鹽霉素等，共計29 批次。8 批次檢出阿苯達唑，含量達到0.345～10.1 μg/kg；7 批次檢出癸氧喹酯，含量達到0.893～164 μg/kg；7 批次檢出馬杜霉素，含量達到0.500～52.0 μg/kg；4 批次檢出莫能霉素，含量達到0.410～1.63 μg/kg；1 批次檢出噻苯達唑，含量為1.72 μg/kg；2 批次檢出甲基鹽霉素，含量為0.545 μg/kg 和0.638 μg/kg；其中包含16 批次雞肉，2 批次豬肉，1 批次鴨肉，6 批次雞蛋，整體檢出率為16.7%，說明動物源食品中中確實有存在抗寄生蟲類藥物獸藥殘留的現(xiàn)象。

3 結論

本文通過對質譜、色譜條件和前處理方法的優(yōu)化，建立了QuEChERS-超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法測定動物源性食品中30 種抗寄生蟲類藥物殘留的方法。應用該方法檢測了150 批次市售樣品，整體檢出率為16.7%，表明目前市場上確實存在抗寄生蟲類藥物獸藥殘留的現(xiàn)象。本方法具有操作簡單，試劑用量少、分析時間短、測定結果穩(wěn)定、高通量等優(yōu)點，可為畜禽肉、水產(chǎn)品、雞蛋、牛奶中抗寄生蟲藥物殘留快速篩查和定性定量分析提供技術支撐，有助于動物源性食品中抗寄生蟲藥物殘留的市場監(jiān)管。