基于HS-SPME-GC-MS 和化學(xué)計(jì)量學(xué)對(duì)不同產(chǎn)地紅棗香氣成分的分析

胡航偉，張仁堂，張楠楠，梁 辰，游新俠，孔欣欣，朱 玲，閆信想，劉云國(guó),

（1.鄭州科技學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，河南鄭州 450064；2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東泰安 271018；3.臨沂大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東臨沂 276000）

棗（Ziziphus jujubaMill.），鼠李科棗屬，是我國(guó)重要經(jīng)濟(jì)果樹(shù)，栽培歷史悠久，在全球范圍內(nèi)分布于熱帶、亞熱帶和暖溫帶地區(qū)[1-4]。我國(guó)棗的產(chǎn)區(qū)主要集中于北方，包括河南、河北、山東、陜西、山西、新疆、寧夏等地。其中，新疆棗樹(shù)種植面積約44.5 萬(wàn)公頃，已成為我國(guó)最大的棗果產(chǎn)區(qū)[5-6]。棗果因其含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，包括糖類(lèi)、脂肪酸、氨基酸、礦物質(zhì)、維生素、類(lèi)黃酮及其糖苷類(lèi)等，在日常消費(fèi)中需求量很大，被視為是一種功能性食品[7-8]。據(jù)報(bào)道，棗中的多糖物質(zhì)具有保肝活性和免疫調(diào)節(jié)作用；此外，棗果實(shí)還具有一定的抗氧化能力[9-10]，食用方便，深受消費(fèi)者的喜愛(ài)。但由于種植區(qū)域、氣候條件、土壤環(huán)境等影響，導(dǎo)致棗果的品質(zhì)出現(xiàn)明顯的不同。

香氣是評(píng)價(jià)紅棗品質(zhì)的重要指標(biāo)之一。目前，已經(jīng)在紅棗中發(fā)現(xiàn)了50 多種芳香化合物。其中，乙酸、己酸、辛酸、己醛、（E）-2-己烯醛、（Z）-2-庚烯醛和苯甲醛是紅棗中常見(jiàn)的香氣化合物[11-13]。當(dāng)前，關(guān)于紅棗品質(zhì)評(píng)價(jià)的研究，多圍繞著干制方式、包裝材料、烘烤溫度、加工過(guò)程變化等方面。Wojdy?o等[14]研究對(duì)流干燥、真空微波干燥、對(duì)流-真空微波干燥、冷凍干燥4 種方式對(duì)不同品種棗果品質(zhì)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，冷凍干燥、真空微波干燥處理后棗果的生物活性物質(zhì)含量和感官評(píng)價(jià)得分更高。Fu 等[15]分析不同干制成熟期棗果組成成分的變化。其中，不同時(shí)期棗果的糖分、脂肪酸、有機(jī)酸和氨基酸含量差異顯著。主成分分析的結(jié)果也能對(duì)不同成熟期棗果進(jìn)行很好地區(qū)分。解云等[16]采用電子鼻和電子舌技術(shù)測(cè)定紅棗中香氣和滋味成分。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，電子鼻技術(shù)能夠?qū)悠凤L(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行很好區(qū)分。馬林界[17]以駿棗為實(shí)驗(yàn)原料，比較4 種包裝方式在4 ℃和常溫貯藏條件下其香氣變化的規(guī)律。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鋁箔包裝的紅棗貯藏品質(zhì)更好，4 ℃貯藏有利于棗果揮發(fā)性物質(zhì)的保留。劉宇星[18]研究不同烘制方式對(duì)駿棗香氣成分的影響，發(fā)現(xiàn)溫度過(guò)高會(huì)引起脂肪酸過(guò)度降解，形成不良風(fēng)味。值得注意的是，在60 ℃下烘制對(duì)駿棗果實(shí)品質(zhì)的影響較小。由此可見(jiàn)，針對(duì)不同產(chǎn)地紅棗香氣成分差異的報(bào)道較少。頂空固相微萃取技術(shù)是一種廣泛應(yīng)用于食品風(fēng)味分析的非溶劑選擇性萃取方法，氣相色譜-質(zhì)譜由于其通用性和較強(qiáng)的定性和定量評(píng)價(jià)能力，集化合物的分離、鑒定于一體，已成功應(yīng)用在食品風(fēng)味鑒定和香氣檢測(cè)[19]?；诖?，將該技術(shù)應(yīng)用到不同產(chǎn)地紅棗香氣成分評(píng)價(jià)是可行的。

本研究以河南新鄭、河南靈寶、陜西榆林、新疆和田、山東德州5 個(gè)產(chǎn)地的紅棗為實(shí)驗(yàn)原料，采用頂空固相微萃取-氣相色譜質(zhì)譜技術(shù)（headspace solid phase micro-extraction gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）解析其揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的組成。應(yīng)用化學(xué)計(jì)量學(xué)方法，如主成分分析（principal component analysis，PCA）、正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares discrimination analysis，OPLS-DA），來(lái)深入了解風(fēng)味特征的變化，篩選出區(qū)別紅棗地理來(lái)源的特征揮發(fā)物，從而實(shí)現(xiàn)紅棗樣品的區(qū)分。旨在為市售紅棗的品質(zhì)鑒別和產(chǎn)地溯源提供一定的研究支撐，進(jìn)一步推動(dòng)棗果產(chǎn)業(yè)高質(zhì)量發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅棗 5 個(gè)產(chǎn)地分別是河南新鄭大棗、河南靈寶大棗、陜西榆林大棗、新疆和田大棗、山東德州大棗，由當(dāng)?shù)劁N(xiāo)售商提供；2-辛醇、氯化鈉 純度均＞99.5%，上海源葉生物科技有限公司。

65 μm PDMS/DVB 頂空固相微萃取頭 美國(guó)Supelco 公司；TSQ 8000 三重四級(jí)桿氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀 賽默飛世爾科技公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 頂空固相微萃取 棗果揮發(fā)性化合物的提取，使用手動(dòng)頂空固相微萃取裝置進(jìn)行，參考Liu 等[20]的方法，稍作修改。切分、去核后的棗果，經(jīng)高速破碎機(jī)處理，準(zhǔn)確稱(chēng)取2 g 粉碎后的棗果樣品置于20 mL頂空瓶，加入2 mL 飽和氯化鈉溶液、2 μL 2-辛醇（1 mg/mL，內(nèi)標(biāo)物）后密封。在50 ℃恒溫水浴條件下平衡40 min，隨后，插入65 μm PDMS/DVB 萃取纖維頭富集30 min。萃取后，將進(jìn)樣針插入氣相色譜質(zhì)譜儀的進(jìn)樣口，并于250 ℃下解吸5 min。

1.2.2 氣相色譜-質(zhì)譜條件 以氦氣（純度＞99.99%）作為載氣，流速1 mL/min，采用不分流模式。待分析物通過(guò)DB-5MS 毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）實(shí)現(xiàn)揮發(fā)性化合物的分離。程序升溫條件為：GC 色譜初始柱溫40 ℃，保持3 min；接著，以4 ℃/min 線性升高到120 ℃，再以6 ℃/min 線性升高到240 ℃，并保持5 min。

質(zhì)譜數(shù)據(jù)在EI 電離源、電子能量70 eV 的模式下獲得，掃描范圍35～550 m/z。離子源和四極桿溫度分別230、250 ℃。

1.2.3 化合物的定性與定量 揮發(fā)性化合物的鑒定是基于與NIST 2014 文庫(kù)中純標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)譜和保留時(shí)間的比較來(lái)確定的。本研究選取香氣成分的相似度≥80%進(jìn)行分析，以2-辛醇作為內(nèi)標(biāo)物（濃度為1 mg/mL），棗果中揮發(fā)性香氣物質(zhì)的含量計(jì)算公式如下：

1.3 數(shù)據(jù)處理

樣品的每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)測(cè)試3 次，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)表示。通過(guò)SPSS 24 進(jìn)行單因素方差分析，并通過(guò)鄧肯多重檢驗(yàn)來(lái)表示組間顯著性差異（P＜0.05）。結(jié)合PCA、OPLS-DA，對(duì)不同產(chǎn)地紅棗的香氣物質(zhì)進(jìn)行差異性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同產(chǎn)地紅棗揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析

由表1 可知，5 個(gè)產(chǎn)地紅棗樣品中共鑒定出51 種化合物，包括8 種醇類(lèi)、12 種酯類(lèi)、14 種醛類(lèi)、3 種酸類(lèi)、5 種酮類(lèi)、6 種烷烴類(lèi)、1 種烯烴類(lèi)和2 種其他類(lèi)。其中，醛類(lèi)、酯類(lèi)和醇類(lèi)化合物在紅棗中更為豐富。不同產(chǎn)地紅棗樣品中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的組成和含量存在明顯差異，其中，陜西榆林大棗、河南新鄭大棗、河南靈寶大棗、山東德州大棗、新疆和田大棗分別鑒定出24 種、19 種、17 種、25 種、34 種揮發(fā)物。

表1 不同產(chǎn)地紅棗揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)Table 1 Volatile flavor substances of jujube from different origins

酯類(lèi)，與水果味特性有關(guān)，多是通過(guò)醇類(lèi)和有機(jī)酸的非酶酯化形成的[21-22]。它們中多數(shù)以甲酯的形式存在，在不同產(chǎn)地紅棗樣品中公有的酯類(lèi)化合物有2 種，分別是己酸甲酯（62.43～220.07 μg/kg）、庚酸甲酯（15.09～125.14 μg/kg）。另外，癸酸甲酯被報(bào)道對(duì)灰棗的香氣有重要貢獻(xiàn)[23]。醇類(lèi)多是由葡萄糖代謝、氨基酸脫羧或多不飽和脂肪酸氧化降解形成的[24]，通常呈現(xiàn)果香味和花香味。在陜西榆林大棗、河南新鄭大棗、河南靈寶大棗、山東德州大棗、新疆和田大棗中分別含有5 種、3 種、2 種、3 種、4 種。其中，1-辛烯-3-醇賦予棗果脂肪味、花香味和蘑菇味，且在河南新鄭大棗中含量最高（124.66 μg/kg），它可能是由于脂肪酸氧化產(chǎn)生的[25]。值得注意的是，反式-2-癸烯醇、十六醇是新疆和田大棗中特有的醇類(lèi)，而2-乙基-1-癸醇、2-乙基己醇和2-甲氧基乙醇是陜西榆林大棗中所特有的醇類(lèi)。醛類(lèi)被認(rèn)為可能是由于芳香前體的氧化降解產(chǎn)生，如脂肪酸水解、糖苷水解和美拉德反應(yīng)[26]。在陜西榆林大棗、河南新鄭大棗、河南靈寶大棗、山東德州大棗、新疆和田大棗中分別含有10 種、6 種、7 種、8 種、11 種。其中，苯甲醛呈現(xiàn)出苦杏仁味、焦糖味、麥芽味的香氣特征；（E）-2-辛烯醛呈現(xiàn)堅(jiān)果味、脂肪味。這些揮發(fā)性化合物在紅棗的香氣呈現(xiàn)中起著重要作用。有研究表明，（E）-2-己烯醛和苯甲醛被認(rèn)為是紅棗中的主要香氣活性物質(zhì)，盡管苯甲醛的含量較低，但是發(fā)揮了香氣疊加或協(xié)同作用，使紅棗的整體香氣更容易被感知[27]。通常來(lái)說(shuō)，酮類(lèi)化合物多是由還原糖和氨基酸降解或不飽和脂肪酸氧化產(chǎn)生的[28]。特別是，新疆和田大棗中酮類(lèi)的含量最高。從紅棗樣品中，共檢測(cè)到酸類(lèi)化合物3 種，其中，乙酸的含量最為豐富。低分子質(zhì)量的羧酸有助于棗果的酸味及刺激性氣味[29]，尤其是乙酸，對(duì)于紅棗的香氣貢獻(xiàn)較大，這與張富縣等[30]報(bào)道的結(jié)果是相似的。

2.2 不同產(chǎn)地紅棗化學(xué)計(jì)量學(xué)分析及差異揮發(fā)性化合物的確定

PCA 是一種簡(jiǎn)化數(shù)據(jù)分析的方法，通過(guò)正交變換將多個(gè)變量轉(zhuǎn)化為少數(shù)綜合變量，以代表原始變量的信息，該方法可以有效地識(shí)別數(shù)據(jù)中“占主導(dǎo)地位”的元素和結(jié)構(gòu)，消除噪聲和冗余，降低原始復(fù)雜數(shù)據(jù)的維數(shù)，從而更好地揭示復(fù)雜數(shù)據(jù)背后的簡(jiǎn)單結(jié)構(gòu)[31-34]。如圖1 所示，可以直觀地顯示不同產(chǎn)地紅棗風(fēng)味物質(zhì)的差異，當(dāng)樣本之間的距離越近時(shí)，差異性越小，而距離越遠(yuǎn)，則差異性越大。根據(jù)PCA 得分圖上樣品各點(diǎn)的離散度和聚集分布，可以看出新疆和田大棗（HT）、陜西榆林大棗（YL）分別位于PC1和PC2 正向、PC1 和PC2 反向，表明其揮發(fā)性物質(zhì)的整體差異較大。同時(shí)，前兩個(gè)PC 的累積貢獻(xiàn)率達(dá)70.5%（PC1 的貢獻(xiàn)率44.9%，PC2 的貢獻(xiàn)率25.6%），證明該結(jié)果是可靠的。為進(jìn)一步驗(yàn)證結(jié)論的準(zhǔn)確性，本研究以鑒定出的51 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)為自變量（X），以不同產(chǎn)地為因變量（Y）進(jìn)行OPLS-DA 模型分析。得到模型的自變量擬合指數(shù)R2X（cum）值為0.988，因變量擬合指數(shù)R2Y（cum）值為0.983，模型預(yù)測(cè)指標(biāo)Q2（cum）為0.963，表明該模型的結(jié)果是可靠的。從圖2 可以看出，不同產(chǎn)地的紅棗樣品被成功地區(qū)分開(kāi)，該模型結(jié)果與PCA 分析基本一致。其中，河南靈寶大棗（LB）位于t[1]反向和t[2]正向區(qū)域，新疆和田大棗（HT）位于t[1]和t[2]反向區(qū)域，陜西榆林大棗（YL）位于t[1]正向和t[2]反向區(qū)域，山東德州大棗（DZ）位于t[1]和t[2]正向區(qū)域。而河南新鄭大棗（XZ）的3 次平行樣品之間分散程度明顯，并距離陜西榆林大棗（YL）樣品較近，說(shuō)明兩樣品之間的香氣成分較為相似。

圖1 不同產(chǎn)地紅棗揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)主成分分析Fig.1 Principal component analysis of volatile flavor substances in jujube from different origins

圖2 不同產(chǎn)地紅棗揮發(fā)性物質(zhì)正交偏最小二乘判別分析Fig.2 Orthogonal partial least squares discriminant analysis of volatile substances in jujube from different origins

在同時(shí)滿(mǎn)足預(yù)測(cè)變量重要性投影（variable importance for the projection，VIP）＞1.0，P＜0.05 的條件下，從不同產(chǎn)地鑒定的揮發(fā)性有機(jī)物中，共篩選出13 種差異揮發(fā)物（見(jiàn)表2），包括己酸甲酯、庚醛、庚酸甲酯等，這些化合物賦予紅棗獨(dú)特的脂肪味、柑橘味、甜味等。根據(jù)篩選出的差異揮發(fā)性物質(zhì)，繪制出不同產(chǎn)地紅棗的PCA 載荷圖（見(jiàn)圖3）。前兩個(gè)PC 的累積貢獻(xiàn)率為71.1%，其中，4-氨基-1-戊醇、己醛、苯甲醛位于PC1 正向和PC2 反向區(qū)域，與河南靈寶大棗（LB）的相關(guān)性較高；1-辛烯-3-醇、己酸甲酯、癸酸甲酯位于PC1 反向和PC2 正向區(qū)域，與山東德州大棗（DZ）、河南新鄭大棗（XZ）的相關(guān)性較高；2-甲氧基乙醇、乙酸位于PC1 和PC2 反向區(qū)域，與陜西榆林大棗（YL）的相關(guān)性較高；壬醛、庚醛、庚酸甲酯、反式-2-己烯醛、反式-2-辛烯醛位于PC1 和PC2 正向區(qū)域，與新疆和田大棗（HT）的相關(guān)性較高。綜上，1-辛烯-3-醇、己酸甲酯、癸酸甲酯可作為山東德州大棗（DZ）、河南新鄭大棗（XZ）的特征標(biāo)記物，賦予棗果獨(dú)特的蘑菇味、水果味、甜味；4-氨基-1-戊醇、己醛、苯甲醛可作為河南靈寶大棗（LB）的特征標(biāo)記物，賦予棗果獨(dú)特的杏仁味、焦糖味和青草味。

圖3 不同產(chǎn)地紅棗差異揮發(fā)性物質(zhì)的載荷圖Fig.3 Load diagram of differential volatiles of jujube from different origins

表2 紅棗中差異揮發(fā)性化合物及香氣特征描述Table 2 Description of differential volatile compounds and aroma characteristics in red jujube

3 結(jié)論

本研究采用HS-SPME-GC-MS 結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法，對(duì)5 個(gè)不同產(chǎn)地紅棗揮發(fā)性香氣成分進(jìn)行了全面分析。在紅棗樣品中共鑒定出51 種化合物，其中醛類(lèi)、酯類(lèi)和醇類(lèi)是主要的揮發(fā)物。同時(shí)，在不同產(chǎn)地的紅棗樣品中也存在著各自特有的香氣成分，如反式-2-癸烯醛僅在陜西榆林大棗中檢測(cè)到，而戊酸甲酯僅在新疆和田大棗中檢測(cè)到。通過(guò)化學(xué)計(jì)量學(xué)分析，篩選出13 種差異風(fēng)味物質(zhì)（VIP＞1，P＜0.05），賦予紅棗濃郁的柑橘味、甜味、水果味等香氣特征。其中，4-氨基-1-戊醇、己醛、苯甲醛可作為河南靈寶大棗的特征標(biāo)記物，而乙酸、2-甲氧基乙醇可作為陜西榆林大棗的特征標(biāo)記物。這些結(jié)果揭示了5 個(gè)不同產(chǎn)地紅棗的揮發(fā)物組成和香氣特征，為紅棗的產(chǎn)地溯源和鑒定提供了有力的依據(jù)。