高通量測(cè)序解析契達(dá)奶酪在加工過(guò)程中菌群結(jié)構(gòu)多樣性變化

孫 蒙，劉 璐,3，譚 心，王 眾，王永順，李曉東, ，張秀秀,

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030；2.乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱 150030；3.國(guó)家乳業(yè)技術(shù)創(chuàng)新中心，內(nèi)蒙古呼和浩特 010000）

奶酪是一種含有豐富蛋白質(zhì)、脂肪及全部必需氨基酸、多種維生素和礦物質(zhì)的高營(yíng)養(yǎng)乳制品。國(guó)際上將其劃分為天然奶酪、再制奶酪和奶酪食品三大類。其中契達(dá)奶酪口味是最為溫和清淡的一種天然奶酪品種，備受我國(guó)消費(fèi)者喜愛，也是我國(guó)進(jìn)口數(shù)量最多的奶酪品種[1]。

契達(dá)奶酪的加工過(guò)程主要包括原料乳巴氏殺菌、發(fā)酵、凝乳、排乳清、契達(dá)化和加鹽等。此外，契達(dá)奶酪是一種成熟型奶酪，需要在一定溫度和濕度條件下進(jìn)行較長(zhǎng)時(shí)間的成熟才能形成成品。其成熟過(guò)程涉及到一系列的化學(xué)反應(yīng)，包括糖酵解、脂解分解和蛋白質(zhì)水解等一系列的生物化學(xué)和微生物學(xué)反應(yīng)，所以對(duì)奶酪加工和成熟過(guò)程中菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行測(cè)定是必要的。Zhang 等[2]綜合代謝組學(xué)和高通量測(cè)序?qū)?nèi)蒙古傳統(tǒng)奶酪加工過(guò)程中微生物群落演替與風(fēng)味代謝物之間的動(dòng)態(tài)相關(guān)性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其加工過(guò)程中微生物群落結(jié)構(gòu)復(fù)雜影響著其風(fēng)味物質(zhì)的形成。Penland 等[3]對(duì)P′elardon 奶酪成熟過(guò)程中不同時(shí)期的樣品微生物多樣性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）、糞腸球菌（Enterococcus faecalis）和青霉菌（Penicillium）等微生物為優(yōu)勢(shì)菌群。Hao 等[4]發(fā)現(xiàn)在契達(dá)奶酪成熟過(guò)程中添加益生菌更有可能促進(jìn)更多生物活性肽產(chǎn)生，比如：血管緊張酶抑制劑（Angiotensin-converting enzyme inhibitory）。Tamang 等[5]對(duì)奶酪等發(fā)酵乳制品中的微生物的功能特性進(jìn)行總結(jié)綜述，闡明了其對(duì)人體健康的積極作用。由此可見，在奶酪的加工和成熟過(guò)程中，體系中微生物參與多種生化代謝反應(yīng)，產(chǎn)生多樣化的代謝產(chǎn)物，影響奶酪的最終品質(zhì)與營(yíng)養(yǎng)[6]。

傳統(tǒng)的奶酪微生物研究通常采用分離培養(yǎng)等方法，如變性梯度凝膠電泳[7]（Polymerase Chain Reaction-Denaturing Gradient Gel Electrophoresis，PCR-DGGE）和時(shí)相溫度梯度凝膠電泳[8]（Polymerase Chain Reaction-Temporal Temperature Gradient Electrophoresis，PCR-TTGE）等，對(duì)于傳統(tǒng)發(fā)酵食品多菌種的復(fù)雜體系，難以快速、全面地分析微生物群落的真實(shí)結(jié)構(gòu)。Hermet 等[9]采用SSCP 分析了36 種奶酪表面微生物，發(fā)現(xiàn)了傳統(tǒng)的分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)奶酪整體微生物群落分析鑒定的局限。高通量測(cè)序技術(shù)（High-throughput sequencing）即下一代測(cè)序技術(shù)，可一次性對(duì)樣品中的幾十萬(wàn)到幾百萬(wàn)條DNA 分子進(jìn)行序列測(cè)定[10]。它解決了PCR-TTGE、和PCR-DGGE 等傳統(tǒng)方法的局限[11]，可快速確定樣品中微生物的種類和豐度，具有分析全面、靈敏、快速等特點(diǎn)，能夠更客觀地反映樣品中微生物群落結(jié)構(gòu)的真實(shí)情況[12-13]。近年來(lái)，高通量測(cè)序技術(shù)已廣泛應(yīng)用于傳統(tǒng)發(fā)酵食品的微生物群落的宏基因組研究中[14]，Silvetti 等[15]利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)Silter 干酪成熟過(guò)程中的菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行測(cè)定。Camargo 等[16]利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)“Entre Serras”手工奶酪成熟過(guò)程中的微生物變化進(jìn)行監(jiān)測(cè)。高通量測(cè)序技術(shù)在探索微生物群落方面的廣泛應(yīng)用大大增加了人們對(duì)奶酪等傳統(tǒng)發(fā)酵食品的認(rèn)知[17]，目前主要的研究方向集中在外源添加益生菌對(duì)奶酪菌群結(jié)構(gòu)的影響，例如，Hanlon 等[18]研究了在契達(dá)干酪制作過(guò)程中添加益生元，對(duì)其體系內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)以及理化性質(zhì)的影響。Vinderola 等[19]將不同益生菌株加入乳制品中，對(duì)乳酸菌和益生菌之間的相互作用進(jìn)行了探究，但目前利用高通量測(cè)序?qū)o(wú)外源物質(zhì)添加的天然奶酪在加工和成熟過(guò)程中的研究較少。

本文采用高通量測(cè)序技術(shù)監(jiān)控契達(dá)奶酪加工過(guò)程中巴氏殺菌后、凝乳以及成熟三個(gè)階段中微生物菌群結(jié)構(gòu)的變化及其演替規(guī)律，其中成熟階段周期較長(zhǎng)，故在成熟期內(nèi)分別選取成熟0、30、60、90 d 共4 組樣本進(jìn)行微生物復(fù)雜度分析，并從不同分類水平下分析加工過(guò)程中三個(gè)階段契達(dá)奶酪的優(yōu)勢(shì)菌群，以期為功能性奶酪的開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

生牛乳 黑龍江龍丹乳業(yè)科技股份有限公司；氯化鈣 食品級(jí)，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；凝乳酶 山東悠樂(lè)滋生物科技有限公司；商業(yè)發(fā)酵劑乳酸乳球菌乳酸亞種（Lactococcus lactissubsp.lactis）、乳酸乳球菌乳脂亞種（Lactococcus lactissubsp.cremoris）美國(guó)科漢森公司；Power Soil DNA 分離試劑盒 美國(guó)AXYGEN 公司。

SYQ-DSX-280B 手提式高壓滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；CH-35 干酪槽 黑龍江赫益乳業(yè)科技有限公司；HYCV-6 小型干酪壓榨器 黑龍江赫益乳業(yè)科技有限公司；14890 真空包裝機(jī) 得力集團(tuán)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 契達(dá)奶酪的加工 契達(dá)干酪的加工參照Hannon 等[20]的方法并部分修改，具體加工過(guò)程如圖1 所示。添加0.01%（w/w）乳酸乳球菌乳酸亞種（Lactococcus lactissubsp.lactis）和乳酸乳球菌乳脂亞種（Lactococcus lactissubsp.cremoris）。選用巴氏殺菌后（F_milk）、凝乳階段（Curd）、成熟階段（Ch_0、Ch_30、Ch_60、Ch_90 分別代表成熟0、30、60、90 d）的契達(dá)干酪樣本，編號(hào)A、B、C、D、E、F 共6 組，每組樣本取五份，共計(jì)30 份樣本。

圖1 契達(dá)奶酪的加工流程Fig.1 Processing procedure of Cheddar cheese

1.2.2 DNA 的提取 對(duì)上述六組契達(dá)奶酪進(jìn)行DNA 的提取，使用Power Soil DNA 分離試劑盒，按照說(shuō)明書提取。用1%瓊脂糖凝膠電泳和分光光度法進(jìn)行DNA 質(zhì)量和濃度檢測(cè)。質(zhì)檢合格的樣本儲(chǔ)存在-20 ℃以備后續(xù)試驗(yàn)使用。

1.2.3 PCR 擴(kuò)增和測(cè)序 首先將契達(dá)奶酪的DNA用特異引物對(duì)16S rDNA 的V3-V4[21]進(jìn)行擴(kuò)增。引物序列為：338F（ACTCCTACGGGAGGCAGCAG）和806R（GGACTACHVGGGTWTCTAAT）。在上游和下游引物的5’末端各添加8 bp 條形碼序列，以區(qū)分不同的樣本。PCR 的擴(kuò)增體系為25 μL：5 μL DNA（加入的DNA 總量為30 ng）、1 μL Forward Primer（5 μmol/L）、1 μL Reverse Primer（5 μmol/L）、3 μL BSA 試劑、12.5 μL 2×Taq Plus Master Mix（DNA聚合酶、2 ng/μL），加無(wú)菌雙蒸水定容到25 μL。

在PCR 儀上于94 ℃預(yù)變性5 min，使模板DNA 充分變性，然后進(jìn)入擴(kuò)增循環(huán)。在每一個(gè)循環(huán)中，先于94 ℃保持30 s 使模板變性，然后將溫度降到50 ℃，保持30 s，使引物與模板充分退火；在72 ℃保持1 min，使引物在模板上延伸，合成DNA，完成一個(gè)循環(huán)。重復(fù)循環(huán)30 次，使擴(kuò)增的DNA 片段大量累積。最后，在72 ℃保持7 min，使產(chǎn)物延伸完整，4 ℃保存。

對(duì)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化、回收及定量處理。然后接測(cè)序接頭，構(gòu)建Miseq 文庫(kù)，最后上機(jī)測(cè)序。本試驗(yàn)委托北京奧維森基因科技有限公司進(jìn)行高通量測(cè)序及原始數(shù)據(jù)的初級(jí)處理。PCR 產(chǎn)物用于構(gòu)建微生物多樣性測(cè)序文庫(kù)，用Illumina Miseq PE300 高通量測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序原始序列上傳至NCBI 數(shù)據(jù)中心建立的SRA（Sequence Read Archive，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/sra）數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

高通量測(cè)序完成后，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和序列優(yōu)化[22]。下機(jī)數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)QIIME1（v1.8.0）軟件[23]，根據(jù)Barcode 序列拆分樣本，使用Pear（v0.9.6）軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾、拼接。去除打分低值于20，含有模糊堿基，引物錯(cuò)配序列。拼接后使用Vsearch（v2.7.1）軟件去除長(zhǎng)度小于230 bp 的序列，并根據(jù)Gold Database 數(shù)據(jù)庫(kù)用uchime 方法比對(duì)去除嵌合體序列。為了確保所有樣本的覆蓋率都相當(dāng)高，把所有樣本的數(shù)據(jù)量均一化至XXXX 條序列。利用Qiime 和Vsearch（v2.7.1），將OTU（97%相似水平下）進(jìn)行生物信息統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 契達(dá)奶酪微生物群落Alpha 多樣性分析

Alpha 反映單個(gè)奶酪樣品內(nèi)部物種的多樣性，如表1 所示，本實(shí)驗(yàn)中所有奶酪樣品的Coverage ≥0.986，表明本實(shí)驗(yàn)的測(cè)序數(shù)據(jù)能夠覆蓋樣品中的微生物種類，可以較為真實(shí)地反映奶酪樣品中物種豐度及多樣性，測(cè)序結(jié)果的有效性較高[24]。圖2 所示，稀釋性曲線隨著測(cè)序深度的增加而逐漸趨于平坦，表明本實(shí)驗(yàn)測(cè)序深度較好，測(cè)序數(shù)據(jù)量合理，能夠反映契達(dá)奶酪的微生物群落組成[25]。

表1 契達(dá)奶酪微生物群落豐度和多樣性Table 1 Microbial community abundance and diversity of Cheddar cheese

圖2 稀釋性曲線Fig.2 Rarefaction curves

采用α多樣性指標(biāo)的Shannon 指數(shù)、Simpson指數(shù)與Chao1 指數(shù)分別對(duì)六組樣品微生物物種豐富度和多樣性進(jìn)行評(píng)估。Shannon 指數(shù)和Simpson指數(shù)反映該組微生物群落多樣性和物種分布情況。其中，Shannon 指數(shù)常用來(lái)評(píng)價(jià)微生物群落的物種多樣性，對(duì)樣品中的微生物群落物種豐富度更為敏感，指數(shù)越大代表樣品中的微生物多樣性越高，Chaol 指數(shù)反映該組微生物豐度，指數(shù)越大代表樣品中的微生物豐度越高[26]。契達(dá)奶酪在加工和成熟過(guò)程中微生物群落多樣性和物種豐富度變化如表1所示。結(jié)果表明，A 組內(nèi)樣品Chao1 指數(shù)和Shannon 指數(shù)的平值均最高，即微生物群落多樣性和豐度平均值均為最高，多樣性指數(shù)平均值為6.09±1.52，豐度指數(shù)平均值為1415.78±154.47，而在E 組微生物群落多樣性最低，指數(shù)平均值為0.55±0.20；C 組微生物群落豐度最低，指數(shù)平均值為541.69±35.98。B 組內(nèi)樣品Chao1 指數(shù)差異大，變化范圍為557.25～1054.53，平均值為767.05±189.84。成熟初期（D 組）組內(nèi)樣品Chao1 指數(shù)平均值 為533.05±149.98，成熟中期（E 組）和成熟后期（F 組）Chao1 指數(shù)平均值分別為630.72±136.21 和705.18±110.12，物種豐度呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，但上升幅度明顯降低，表明成熟過(guò)程中樣品內(nèi)的微生物正在逐漸適應(yīng)生長(zhǎng)環(huán)境，豐度最終有趨于穩(wěn)定的可能。成熟過(guò)程中，Shannon 指數(shù)平均值分別為0.86±0.35、0.55±0.20 和 0.73±0.31，表明契達(dá)奶酪成熟過(guò)程微生物群落多樣性呈先下降后上升的趨勢(shì)。

2.2 契達(dá)奶酪OTU 分布的花瓣圖分析

OTUs（Operational Taxonomic Units）是對(duì)奶酪樣品中的序列進(jìn)行歸類操作（cluster），一般情況下，將相似性高于97%的不同 16S rDNA 序列定義為一個(gè)OTU，每一個(gè)OTU 通常被視為一個(gè)微生物物種[27]。根據(jù)OTUs 聚類分析結(jié)果繪制花瓣圖（圖3）?；ò陥D是一種表示樣本/組間特有和共有OTU 數(shù)目的展示方式，每個(gè)花瓣代表一組樣品，core 數(shù)字代表每組共有OTU 數(shù)目，每個(gè)花瓣上的數(shù)字代表該組特有的OTU 數(shù)目。由圖可知，契達(dá)奶酪樣品共有OTU 數(shù)量為16 個(gè)，其中具體各組樣品平均OTU 數(shù)目分別為：巴氏殺菌后（F_milk）：（1458 個(gè)；854 個(gè)；914 個(gè)，942 個(gè)；1258 個(gè)）、凝乳階段（Curd）：（681 個(gè)；465 個(gè)；364 個(gè)；422 個(gè)；340 個(gè)）、成熟0 d（Ch_0）：（210 個(gè)；276 個(gè)；227 個(gè)；242 個(gè)；345 個(gè)）、成熟30 d（Ch_30）：（496 個(gè)；335 個(gè)；245 個(gè)；220 個(gè)；308 個(gè)）、成熟60 d（Ch_60437 個(gè)；353 個(gè)；228 個(gè)；288 個(gè)；346 個(gè)）、成熟90 d（Ch_90）：（233 個(gè)；416 個(gè)；449 個(gè)；422 個(gè)；278 個(gè)）?；ò陥D結(jié)果表明：在所測(cè)樣本內(nèi)，巴氏殺菌后的菌群種類最為豐富，在凝乳階段其菌群種類豐度逐漸下降，隨著成熟時(shí)間的延長(zhǎng)，奶酪體系內(nèi)的菌群種類豐富度逐漸增加，到成熟末期，契達(dá)奶酪的特有OTU 數(shù)大于成熟初期，說(shuō)明成熟末期，契達(dá)奶酪體系中菌群種類較成熟初期更加豐富。

圖3 契達(dá)奶酪OTUs 數(shù)量花瓣圖Fig.3 Petal diagram of Cheddar cheese OTUs number

2.3 不同水平上契達(dá)奶酪菌群結(jié)構(gòu)分析

將各組契達(dá)奶酪樣品中得到的OTUs 序列從門和屬2 個(gè)水平進(jìn)行物種注釋，得到每個(gè)OTU 在不同分類水平的物種分類信息，觀測(cè)樣本在不同分類水平上的群落結(jié)構(gòu)。將多個(gè)樣本的群落結(jié)構(gòu)分析放在一起，觀測(cè)其變化情況。用柱狀圖可視化觀察不同分組的物種組成情況可以看到不同水平上物種的相對(duì)豐度，如圖4 所示。

圖4 契達(dá)干酪中不同水平上物種的相對(duì)豐度Fig.4 Relative species abundance of microbial at various levels in cheese

在門水平對(duì)契達(dá)奶酪中的菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果如圖4A 所示。變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）和擬桿菌門（Bacteroidetes）為巴氏殺菌后樣品的優(yōu)勢(shì)菌門，其相對(duì)豐度均值之和達(dá)到91.77%，其中變形菌門（Proteobacteria）為該組內(nèi)的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌門，其相對(duì)豐度均值達(dá)到56.80%，而在其余五組中變形菌門的相對(duì)豐度分別為3.58%、1.16%、1.90%、0.78%、0.20%，這可能是由于變形菌門的大部分細(xì)菌為好氧型，不能適應(yīng)契達(dá)奶酪發(fā)酵過(guò)程中缺氧、產(chǎn)酸的環(huán)境，因而在發(fā)酵后的凝乳階段以及成熟階段其豐度迅速大幅度降低。除巴氏殺菌后期的樣品以外，其余樣品中厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和變形菌門（Proteobacteria）均為各組樣品中的優(yōu)勢(shì)菌門，其中厚壁菌門（Firmicutes）為契達(dá)奶酪成熟階段的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌門，成熟階段四組樣品相對(duì)豐度均值均達(dá)到96%以上，并且整個(gè)成熟過(guò)程中，其相對(duì)豐度變化不大趨于穩(wěn)定?？梢?，契達(dá)奶酪制作過(guò)程中各階段的優(yōu)勢(shì)菌門存在明顯差異，巴氏殺菌后的優(yōu)勢(shì)菌門與原料奶中大體一致，主要由厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和變形菌門（Proteobacteria）構(gòu)成。然而在凝乳步驟之后，厚壁菌門（Firmicutes）則表現(xiàn)為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌門，此外還有少量的變形菌門（Proteobacteria），這與Aldrete 等[17]對(duì)墨西哥Poro 奶酪制作過(guò)程中菌群結(jié)構(gòu)的研究一致。

圖4B 顯示了在屬水平上對(duì)契達(dá)奶酪的菌群結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果，可以明顯看出巴氏殺菌后契達(dá)奶酪體系內(nèi)的菌屬展現(xiàn)著高度的多樣性，已鑒定出來(lái)的菌屬就有20 余種。而在凝乳和成熟兩階段中的多樣性明顯降低，這與張敏等[28]對(duì)乳制品微生物多樣性的總結(jié)綜述一致，這是由于原料奶發(fā)酵后的奶酪中，乳酸菌發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸形成的生態(tài)位和資源競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)，將不利于其余大部分微生物的生長(zhǎng)，使乳酸菌成為各種發(fā)酵乳品中的優(yōu)勢(shì)菌群。其中巴氏殺菌后契達(dá)奶酪中的優(yōu)勢(shì)菌群為金黃桿菌屬（Chryseobacterium）和寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas），相對(duì)豐度均值分別為11.07%和21.04%。而在奶酪凝乳和成熟兩階段中，乳球菌屬（Lactococcus）則為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌群，并且在成熟期間，其相對(duì)豐度呈先上升后下降的趨勢(shì)，豐度均值均達(dá)92%以上，這與曾椿淋[29]的研究結(jié)果一致。在巴氏殺菌后的契達(dá)奶酪中還發(fā)現(xiàn)了假單胞菌屬（Pseudomonas）的存在，但在凝乳和成熟階段中均未檢測(cè)到，這可能是由于發(fā)酵后的高酸性環(huán)境不利于其生長(zhǎng)繁殖。契達(dá)奶酪中存在的乳球菌屬（Lactococcus）和部分酵母菌有著促進(jìn)乳品發(fā)酵的功能，而假單胞菌屬（Pseudomonas）的存在則會(huì)造成乳制品的腐敗變質(zhì)，給產(chǎn)品帶來(lái)安全隱患[28]。此外，較高含量的乳球菌屬（Lactococcus）的存在可能是由于在契達(dá)干酪發(fā)酵階段加入了乳酸乳球菌乳酸亞種（Lactococcus lactissubsp.lactis）和乳酸乳球菌乳脂亞種（Lactococcus lactissubsp.cremoris），說(shuō)明在奶酪中最主要的微生物是發(fā)酵劑微生物。Choi 等[30]的研究也表明奶酪微生物群落的組成在很大程度上取決于所使用的發(fā)酵劑種類。但是在凝乳階段和成熟階段的樣品中仍然發(fā)現(xiàn)了相對(duì)豐度較高的寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas），說(shuō)明不能僅僅只關(guān)注奶酪中已知占優(yōu)勢(shì)的乳酸菌類發(fā)酵劑微生物，也要對(duì)這些之前未被關(guān)注但數(shù)量不少的其他微生物進(jìn)行研究。

2.4 契達(dá)奶酪Beta 多樣性分析

Beta 多樣性分析是對(duì)兩組干酪樣本微生物群落構(gòu)成的差異。本研究采用PCA（Principal Component Analysis）分析和NMDS（Non-metric Multidimensional Scaling）兩種方式分析比較契達(dá)奶酪加工階段的樣本群落構(gòu)成差異。PCA 分析，即主成分分析，通過(guò)降維處理，把多維數(shù)據(jù)作圖，直觀每組樣本間群落構(gòu)成的相似性[31]。NMDS 分析同樣是通過(guò)對(duì)原始數(shù)據(jù)的降維處理，研究不同組樣本間群落構(gòu)成的相似情況[32]。通過(guò)點(diǎn)與點(diǎn)的距離表現(xiàn)在圖中，兩點(diǎn)之間的距離越遠(yuǎn)，表明兩個(gè)樣品中微生物群落的差異越大[33]，結(jié)果如圖5A、B 所示。

圖5 Beta 多樣性分析Fig.5 Beta diversity analysis

圖5A 所示，A 組內(nèi)五份樣品分布較為分散，說(shuō)明滅菌階段的契達(dá)奶酪體系中菌群組成存在差異，而其余五組內(nèi)樣品分布較為集中，并且成熟階段的四組樣品分布十分集中，說(shuō)明凝乳階段和成熟階段的契達(dá)奶酪體系中各組內(nèi)菌群組成較相似，成熟階段各組菌群結(jié)構(gòu)存在高度相似。圖5B 所示，對(duì)群落測(cè)序結(jié)果進(jìn)行排序分析，其stress 值為0.0024＜0.1，排序結(jié)果良好。A 組與其它五組的契達(dá)干酪均不存在重合現(xiàn)象，且相距較遠(yuǎn)，說(shuō)明滅菌階段的奶酪體系中菌群結(jié)構(gòu)與凝乳和成熟階段相比差異較大，綜合α多樣性和菌群結(jié)構(gòu)分析可知，此種差異主要來(lái)源于細(xì)菌相對(duì)豐度的改變，可能是由于滅菌后的原料乳在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的酸類及醇類等物質(zhì)的累積，不利于某些微生物的生長(zhǎng)繁殖，引起微生物總體豐度下降，導(dǎo)致發(fā)酵后取樣的凝乳階段以及成熟階段內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)與滅菌階段相比具有明顯差異。另外，在不同成熟階段各組樣品之間都存在明顯重疊部分，相距很近，說(shuō)明成熟期的延長(zhǎng)對(duì)其菌群結(jié)構(gòu)影響較小，這可能是由于成熟過(guò)程中微生物已經(jīng)逐漸適應(yīng)了當(dāng)前的生長(zhǎng)環(huán)境，因此各組內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)穩(wěn)定而呈現(xiàn)明顯的相似性。

3 結(jié)論

本研究采用高通量測(cè)序分析契達(dá)奶酪加工過(guò)程中菌群變化情況，發(fā)現(xiàn)契達(dá)奶酪加工各階段微生物群落結(jié)構(gòu)差異較大。巴氏殺菌后的優(yōu)勢(shì)菌門為厚壁菌門、擬桿菌門和變形菌門，而在凝乳后，厚壁菌門則表現(xiàn)為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌門，此外還存在少量的變形菌門。在屬水平上，巴氏殺菌后契達(dá)奶酪體系內(nèi)菌屬體現(xiàn)出高度的多樣性，而在凝乳和成熟兩階段多樣性明顯降低。巴氏殺菌后優(yōu)勢(shì)菌群為寡養(yǎng)單胞菌屬，凝乳和成熟階段菌群結(jié)構(gòu)相似，乳球菌屬為兩階段的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌群。同時(shí)Beta 多樣性分析結(jié)果也表明巴氏殺菌后奶酪體系中的菌群結(jié)構(gòu)與另外兩階段相比差異較大，成熟期的延長(zhǎng)對(duì)菌群結(jié)構(gòu)影響較小。本研究通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)監(jiān)控契達(dá)奶酪加工過(guò)程中微生物菌群結(jié)構(gòu)的變化，不僅可以錨定優(yōu)勢(shì)菌種，還將為契達(dá)奶酪體系內(nèi)的微生態(tài)結(jié)構(gòu)調(diào)控奠定理論基礎(chǔ)，為探究添加外源物質(zhì)對(duì)契達(dá)奶酪加工過(guò)程中原本菌群結(jié)構(gòu)的影響提供對(duì)照參考，但本研究?jī)H在屬水平上對(duì)菌種進(jìn)行鑒定，之后擬采用全基因組測(cè)序技術(shù)在種水平對(duì)其進(jìn)一步分析。