枳椇子黃酮的含量測(cè)定及其抗氧化作用的分子機(jī)制

劉菁華,駱潔雅,郭 鵬,葉 子,楊 娟,王柯琪,嚴(yán)湘儒,楊盛剛,黃 勁

(1. 貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,貴州 貴陽(yáng) 550025;2. 貴州醫(yī)科大學(xué)貴州省病原生物學(xué)特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴州 貴陽(yáng) 550025;3. 貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,貴州 貴陽(yáng) 550025)

枳椇子為鼠李科(Rhamnaceae)鼠李屬(Hovenia)植物枳椇(Hoveniadulcis)的干燥成熟帶肉質(zhì)花序軸的果實(shí)和種子,性平味甘,具有除煩止渴、清退濕熱、解酒毒之功效[1]。枳椇子黃酮作為一種天然抗氧化劑[2-4],在枳椇子中含量較高,主要包括雙氫楊梅素、雙氫槲皮素、槲皮素、雙氫山萘酚和山萘酚5種成分[3]。研究顯示,枳椇子黃酮可通過(guò)提高生物體內(nèi)抗氧化酶的活性,增強(qiáng)自由基的清除,進(jìn)而減少自由基介導(dǎo)的氧化應(yīng)激對(duì)肝臟的損傷,達(dá)到解酒保肝的作用[5-6]。因此,針對(duì)枳椇子黃酮產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)日益受到關(guān)注。

超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)是一種重要的特異性清除自由基的抗氧化酶,普遍存在于生物體內(nèi)[7]。SOD由2個(gè)亞基組成,能催化超氧離子生成H2O2和O2,使機(jī)體免受超氧離子的侵害,在抗炎、抗衰老和抗腫瘤等方面具有重要的作用[7]。有研究顯示,多種黃酮或黃酮類(lèi)化合物,如綠茶黃酮和白藜蘆醇等能通過(guò)與SOD結(jié)合,穩(wěn)定其構(gòu)象,從而影響其催化活性[8-10]。然而,目前鮮有枳椇子黃酮與SOD相互作用的報(bào)道,為進(jìn)一步探討枳椇子黃酮抗氧化活性的作用機(jī)制,本試驗(yàn)以槲皮素作為對(duì)照品,利用分光光度法測(cè)定枳椇子黃酮含量,并采用分子對(duì)接分析枳椇子黃酮與SOD的相互作用,為枳椇子產(chǎn)品深加工和枳椇子黃酮抗氧化應(yīng)激作用機(jī)制的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 中藥材和主要試劑 枳椇子,購(gòu)自遵義藥材批發(fā)市場(chǎng),經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院楊盛剛副教授鑒定為優(yōu)質(zhì)藥材。甲醇、乙醇、無(wú)水三氯化鋁(AlCl3)、冰醋酸和槲皮素等試劑,均為分析純,購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司。

1.2 主要儀器 UV-2700紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)(日本島津儀器有限公司),HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州澳華儀器有限公司),EL204電子天平(美國(guó)Mettler Toledo科技有限公司),DFT-100高速中藥粉碎機(jī)(溫嶺大得中藥器械有限公司),實(shí)驗(yàn)室超純水機(jī)(美國(guó)Millipore公司),RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)。

1.3 軟件 AutoDock 4.2.6和AutoDock Tools 1.5.6(美國(guó) Scripps研究所),PyMol 2.4(美國(guó)DeLano Scientific LLC公司),LigPlot+(歐洲分子生物實(shí)驗(yàn)室EMBL-EBI)。

1.4 方法

1.4.1 枳椇子供試品儲(chǔ)存液的制備 參照參考文獻(xiàn)[11]的方法制備枳椇子提取液。準(zhǔn)確稱(chēng)取枳椇子100 g,碾碎成粉末過(guò)80目篩,加蒸餾水(料液比1∶6),冷凝回流煎煮2次,合并濾液,即得水提液。取水提液100 mL,加入100 mL乙醇,過(guò)夜沉淀。隔日使用布氏漏斗進(jìn)行粗過(guò)濾,再經(jīng)過(guò)0.45 μm濾膜過(guò)濾,使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去乙醇,水浴鍋80 ℃加熱3 h制備浸膏,使用甲醇溶解配制濃度為100 mg/mL的供試品儲(chǔ)存液。

1.4.2 枳椇子總黃酮含量的測(cè)定 準(zhǔn)確稱(chēng)取槲皮素0.005 g于50 mL容量瓶中,甲醇溶解并定容得100 μg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液。準(zhǔn)確吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液0.0、0.1、0.2、0.4、0.6和0.8 mL,分別置于6個(gè)10 mL容量瓶中,加入濃度為0.1 mol/L的AlCl3甲醇溶液2 mL、濃度為0.2 mol/L的醋酸溶液4 mL,加甲醇定容至刻度,搖勻靜置40 min后備用。以未加對(duì)照品儲(chǔ)備液的溶液作為調(diào)零溶液,用紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)在190～800 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行紫外-可見(jiàn)光吸收光譜(Ultraviolet and visible spectrogram,UV-Vis)全波段掃描,選擇最大吸收波長(zhǎng)作為后續(xù)的檢測(cè)波長(zhǎng)。以吸光度值為縱坐標(biāo),對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將供試品儲(chǔ)存液(100 mg/mL)用甲醇稀釋10倍,準(zhǔn)確吸取0.625 mL于10 mL容量瓶中,加入0.1 mol/L的AlCl3甲醇溶液2 mL,0.2 mol/L的醋酸溶液4 mL,加甲醇定容至刻度,在對(duì)照品最大吸收波長(zhǎng)處檢測(cè)其吸光度值,按照公式(1)計(jì)算樣品的總黃酮含量。

(1)

式中,C(mg/mL)為枳椇子總黃酮濃度,V(mL)為供試品儲(chǔ)存液的體積,m(g)為枳椇子質(zhì)量。

1.4.3 配受體準(zhǔn)備 從PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中獲取枳椇子黃酮的主要成分:雙氫楊梅素(PubChem CID:161557)、雙氫槲皮素(PubChem CID:439533)、槲皮素(PubChem CID:5280343)、雙氫山萘酚(PubChem CID:122850)和山萘酚(PubChem CID:5280863)三維(3 Dimensions,3D)結(jié)構(gòu)的sdf格式文件,通過(guò)OpenBabel 3.1.1(http://openbabel.org/)[12]將其轉(zhuǎn)化為pdb格式文件,導(dǎo)入AutoDock Tools 1.5.6[13]中,對(duì)配體進(jìn)行加極性氫,計(jì)算Gasteiger電荷,添加原子類(lèi)型,設(shè)置可扭轉(zhuǎn)鍵,將位置和電荷等結(jié)構(gòu)信息保存為pdbqt格式文件。然后,從Protein Data Bank(http://www.rcsb.org/)中獲取SOD同源二聚體(PDB ID:4B3E)的晶體結(jié)構(gòu),通過(guò)PyMol 2.4刪除晶體中的原配體和水分子,保存為pdb格式文件,通過(guò)AutoDock Tools 1.5.6對(duì)酶進(jìn)行加氫,計(jì)算電荷,保存為pdbqt格式文件。由于SOD是一類(lèi)含銅鋅離子的金屬酶,且銅鋅離子在酶促反應(yīng)的進(jìn)行和SOD結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定方面具有重要作用,因此將銅和鋅離子的電荷數(shù)設(shè)為+2.0,保存于SOD的pdbqt格式文件中。

1.4.4 枳椇子黃酮與SOD的分子對(duì)接 使用北京大學(xué)來(lái)魯華和裴劍鋒團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)的CavityPlus軟件[14](http://pkumdl.cn:8000/cavityplus/index.php)中CorrSite2.0模塊預(yù)測(cè)枳椇子黃酮主要成分與SOD相互作用的潛在位點(diǎn),以Z-score分值作為評(píng)判標(biāo)準(zhǔn),得分高于0.5且數(shù)值越大,則表明該位點(diǎn)作為結(jié)合口袋的潛力越大;運(yùn)用AutoDock 4.2.6軟件中半柔性對(duì)接的方法,以拉馬克遺傳算法(Lamarckian genetic algorithm,LGA)進(jìn)行構(gòu)象搜索,設(shè)置對(duì)接參數(shù)Number of GA Run為50、Maximum number of evals為3 000 000、Maximum number of generations為30 000,其他參數(shù)為默認(rèn)值,然后將枳椇子黃酮5個(gè)主要成分依次與SOD的結(jié)合位點(diǎn)對(duì)接;將上述對(duì)接結(jié)果導(dǎo)入PyMol 2.4和LigPlot+中,分析配體與受體之間相互作用的氨基酸和化學(xué)鍵。

2 結(jié)果

2.1 槲皮素對(duì)照品的UV-Vis全波段掃描 結(jié)果見(jiàn)圖1,槲皮素對(duì)照品顯色在421 nm處出現(xiàn)最大吸收值,因此后續(xù)試驗(yàn)選用421 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖1 槲皮素對(duì)照品UV-Vis掃描

2.2 枳椇子總黃酮含量的測(cè)定 根據(jù)槲皮素對(duì)照品的吸光度值,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2),得枳椇子總黃酮濃度線性回歸方程為Y= 0.078 70X+0.001 006,R2=0.999 6,其中X為黃酮質(zhì)量濃度,Y為吸光度值。根據(jù)回歸方程和公式(1)計(jì)算,枳椇子總黃酮含量為8.23 mg/g。

圖2 槲皮素對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 枳椇子黃酮與SOD相互作用位點(diǎn)的分析 從Protein Data Bank獲得的SOD同源二聚體的三維結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖3,將其導(dǎo)入CavityPlus軟件預(yù)測(cè)枳椇子黃酮主要成分與SOD相互作用的潛在位點(diǎn),結(jié)果顯示,其相互作用的活性位點(diǎn)共有7個(gè),分別為Site1～7(圖4);Site1～7的Z-score分值分別是1.03、2.19、0.06、-0.67、-0.13、0.06和-0.40,其中Site2的 Z-score分值最高,為2.19,推測(cè)兩者結(jié)合位點(diǎn)為SOD中2條鏈交界面且靠近鋅離子的一凹陷區(qū)域,即Site2為枳椇子黃酮與SOD的結(jié)合位點(diǎn),故后續(xù)選用此位點(diǎn)作為枳椇子黃酮與SOD的對(duì)接口袋。

圖3 SOD同源二聚體的三維結(jié)構(gòu)

圖4 枳椇子黃酮主要成分與SOD潛在結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)

2.4 枳椇子黃酮與SOD相互作用的氨基酸和化學(xué)鍵 分子對(duì)接結(jié)果見(jiàn)圖5,枳椇子黃酮5個(gè)主要成分均能與SOD直接作用,其結(jié)合能范圍為-8.5～-8.3 kcal/mol,結(jié)合配受體間相互作用的氨基酸和氫鍵數(shù)量見(jiàn)表1,提示枳椇子黃酮化合物均能與SOD形成穩(wěn)定的復(fù)合物。

表1 枳椇子黃酮主要成分與SOD相互作用的氨基酸和化學(xué)鍵

圖5 枳椇子黃酮與SOD的分子對(duì)接

為探究枳椇子黃酮抗氧化作用分子機(jī)制,用PyMol 2.4和LigPlot+分析枳椇子黃酮與SOD相互作用的氨基酸和成鍵作用,結(jié)果如圖6所示,枳椇子黃酮5個(gè)主要成分分別與SOD的多個(gè)氨基酸殘基發(fā)生相互作用,其互作的氨基酸殘基見(jiàn)表1,枳椇子黃酮5個(gè)主要成分均與SOD中A鏈的Gly147和B鏈的Gly147氨基酸殘基有直接作用。進(jìn)一步分析兩者相互作用的化學(xué)鍵發(fā)現(xiàn),枳椇子黃酮的酚羥基和苯環(huán)分別通過(guò)氫鍵和疏水作用力與SOD發(fā)生相互作用(圖6)。如圖7所示,靜電作用力也進(jìn)一步起到穩(wěn)定復(fù)合物的作用。

圖6 枳椇子黃酮與SOD相互作用化學(xué)鍵的二維平面圖

圖7 枳椇子黃酮與SOD對(duì)接的靜電作用力

3 討論

枳椇子作為藥食同源植物枳椇的果實(shí)和種子,富含黃酮類(lèi)、生物堿類(lèi)、皂苷和糖苷類(lèi)等多種生物活性物質(zhì)[3],尤其是枳椇子黃酮具有較好的抗氧化和抗炎活性。研究表明,雙氫楊梅素、雙氫槲皮素、槲皮素、雙氫山萘酚和山萘酚是枳椇子黃酮中主要的5種活性成分,對(duì)酒精性肝損傷、糖尿病和腫瘤等疾病有一定的干預(yù)治療作用[4,6,15],其作為功能性食品或膳食補(bǔ)充劑具有良好的市場(chǎng)開(kāi)發(fā)潛力[16]。目前市場(chǎng)上的相關(guān)產(chǎn)品有枳椇子解酒飲料、枳椇子膠囊和枳椇子酸奶等[17],但是枳椇子深加工產(chǎn)品比較缺乏。本試驗(yàn)采用醇提法對(duì)貴州省遵義地區(qū)的枳椇子黃酮含量進(jìn)行評(píng)估,采用紫外-可見(jiàn)分光光度法測(cè)得枳椇子總黃酮含量為8.23 mg/g,這為后續(xù)枳椇子產(chǎn)品深加工提供了參考。

SOD是重要的抗氧化酶,通過(guò)清除氧自由基,維持機(jī)體的氧化與抗氧化平衡[7-8]。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn),枳椇子含藥血清能顯著提高細(xì)胞的SOD酶活性,減少自由基介導(dǎo)的氧化應(yīng)激對(duì)肝細(xì)胞的損傷,進(jìn)而發(fā)揮對(duì)酒精性肝損傷細(xì)胞的保護(hù)作用[5]。同時(shí)有文獻(xiàn)報(bào)道,枳椇子抗氧化活性與其所含的黃酮密切相關(guān),枳椇子黃酮可通過(guò)增加SOD活性,進(jìn)而參與多種疾病的干預(yù)和治療[5,18],但其作用機(jī)制尚不清楚。為進(jìn)一步探索枳椇子黃酮抗氧化應(yīng)激的潛在分子機(jī)制,本試驗(yàn)采用分子對(duì)接、計(jì)算機(jī)模擬分析枳椇子黃酮與SOD之間的相互作用,結(jié)果顯示,兩者結(jié)合位點(diǎn)為SOD中2條鏈交界面且靠近Zn2+的一凹陷區(qū)域,其結(jié)合能為-8.5～-8.3 kcal/mol;進(jìn)一步分析相互作用的基團(tuán)和化學(xué)鍵,發(fā)現(xiàn)枳椇子黃酮通過(guò)氫鍵、疏水作用力和靜電作用力與SOD發(fā)生直接作用。有研究通過(guò)核磁共振(Nuclear magnetic resonance,NMR)和電噴霧質(zhì)譜(Electrospray ionization mass spectrometry,ESI-MS)技術(shù)發(fā)現(xiàn),綠茶中的茶黃酮和表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(Epigallocatechin gallate,EGCG)以及白藜蘆醇等多酚類(lèi)化合物可與SOD形成穩(wěn)定的復(fù)合物[8-9,19-20]。有研究表明,配受體間相互作用的氫鍵、疏水作用力和靜電作用力等非共價(jià)鍵具有降低反應(yīng)結(jié)合能,增加酶結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的作用[9,20]。結(jié)合本試驗(yàn)中枳椇子黃酮主要成分與SOD相互作用的化學(xué)鍵,提示枳椇子黃酮可能通過(guò)氫鍵等非共價(jià)鍵與SOD結(jié)合,進(jìn)而促進(jìn)其與底物的結(jié)合,增強(qiáng)其抗氧化損傷作用。

綜上所述,本試驗(yàn)采用醇提法提取枳椇子黃酮成分,紫外-可見(jiàn)分光光度法測(cè)定黃酮含量,并進(jìn)一步采用分子對(duì)接分析枳椇子黃酮與SOD相互作用的潛在分子機(jī)制,為后續(xù)探索枳椇子黃酮抗氧化應(yīng)激作用機(jī)制及挖掘枳椇子產(chǎn)品的附加價(jià)值提供了科學(xué)依據(jù)。