綜合洗消體系對(duì)阻斷非洲豬瘟病毒傳入豬場的作用

張 韻,金睿妍,何佳蔚,程光勝,丁紅雷

(1. 西南大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 動(dòng)物支原體學(xué)實(shí)驗(yàn)室,重慶 北碚 400715;2. 重慶正大農(nóng)牧食品有限公司,重慶 江北 400021)

自2018年8月3日我國首例非洲豬瘟(African swine fever,ASF)病例確診以來,短短數(shù)月時(shí)間,該病就席卷我國大江南北,給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。由于低毒力菌株在田間的流行[3],有些非洲豬瘟陽性豬不表現(xiàn)出典型臨床癥狀,給非洲豬瘟陽性豬的清除帶來了很大挑戰(zhàn),甚至造成非洲豬瘟在豬場內(nèi)流行,最后不得不全群淘汰。在沒有良好疫苗的情況下,加強(qiáng)生物安全管理仍然是防控非洲豬瘟最為經(jīng)濟(jì)有效的手段。

動(dòng)物傳染病的流行過程就是從個(gè)體發(fā)病發(fā)展到群體發(fā)病的過程[4]。傳染病在動(dòng)物群體中蔓延流行,必需具備3個(gè)相互連接的條件,即傳染源、傳播途徑和易感動(dòng)物。在當(dāng)前條件下,徹底消滅非洲豬瘟的傳染源極其困難,并且沒有有效的非洲豬瘟疫苗也無法保護(hù)易感動(dòng)物[5-6]。建立嚴(yán)格的洗消體系,加強(qiáng)進(jìn)入豬場前車輛、人員和物資的洗消,切斷傳播途徑,阻斷非洲豬瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)傳入豬場是養(yǎng)殖企業(yè)防控非洲豬瘟切實(shí)可行的辦法[7]。

2019—2022年,本試驗(yàn)通過在某種豬場建立綜合洗消體系,加強(qiáng)對(duì)進(jìn)入豬場前車輛、人員和物資的洗消,并結(jié)合洗消后車輛、人員和物資的ASFV核酸實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測,將種豬場傳入ASFV的概率降至最低水平,最大限度地切斷了傳播途徑,為種豬場安全生產(chǎn)提供了有力保障。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)豬場 重慶市某農(nóng)牧企業(yè)下屬某種豬場,存欄母豬1 200頭。該種豬場10 km半徑內(nèi)無其他豬場、活畜交易市場、畜禽無害化處理場、畜禽屠宰場和垃圾處理廠,豬場距離公共交通道路超過1 km。除了進(jìn)出豬場的內(nèi)部道路,場區(qū)周圍以樹木作為天然隔離帶。飲水由自來水廠供應(yīng)。

1.2 主要試劑和儀器 DNA病毒基因組提取試劑盒,購自青島立見生物科技有限公司;ASFV實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測試劑盒,購自濟(jì)凡生物科技(常州)有限公司;ASFV ELISA抗體檢測試劑盒,購自北京金諾百泰生物技術(shù)有限公司;正立凈(濃戊二醛溶液),購自正大預(yù)混料(廣漢)有限公司;衛(wèi)清寧(過硫酸氫鉀復(fù)合粉),購自天津瑞普生物技術(shù)有限公司。高速冷凍離心機(jī),購自安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司;酶標(biāo)儀和實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀,均購自伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司。

1.3 進(jìn)入豬場車輛的洗消 對(duì)進(jìn)入種豬場的飼料配送車、物資配送車、仔豬轉(zhuǎn)運(yùn)車和淘汰豬運(yùn)輸車進(jìn)行三級(jí)洗消。所有洗消按照從外到里、從表面到內(nèi)部、從大體到細(xì)節(jié)的順序進(jìn)行。一級(jí)洗消:飼料配送車在飼料廠附近的洗車場、物資配送車在該農(nóng)牧企業(yè)存儲(chǔ)物資的中心庫房附近的洗車場、仔豬轉(zhuǎn)運(yùn)車在肥豬場附近的洗車場、淘汰豬運(yùn)輸車在屠宰場附近的洗車場進(jìn)行清洗和消毒。清洗和消毒的部位包括整車車身外壁、內(nèi)壁、底盤和駕駛室。二級(jí)洗消:所有車輛在接近種豬場附近1 km設(shè)立的洗消中心進(jìn)行整車車身外壁和內(nèi)壁、底盤和駕駛室的二級(jí)洗消(圖1)。洗消完畢后烘干車輛,70 ℃烘干至少10 min,時(shí)間達(dá)到后,關(guān)閉熱風(fēng)機(jī),20～30 min后采樣(圖2)。三級(jí)洗消:在種豬場門口對(duì)整車車身和底盤進(jìn)行噴霧消毒。用于一級(jí)和二級(jí)洗消的消毒劑為0.1%戊二醛,用于三級(jí)洗消的消毒劑為衛(wèi)清寧(1∶200稀釋),消毒劑至少作用1 h。

圖1 二級(jí)洗消

圖2 車輛烘干過程的溫度控制

1.4 進(jìn)入豬場車輛的樣品采集 采樣人員穿好一次性防護(hù)服,戴一次性手套。用生理鹽水將紗布?jí)K浸濕,依次對(duì)車輛的各個(gè)部位進(jìn)行擦拭,包括駕駛室的車門把手、扶手欄桿、方向盤、操作檔桿和按鈕、雨刷、儀表盤、掛擋、座椅、踏板、駕駛室地面、駕駛員鞋底和副駕駛位等;車體表面的車頭、車身兩側(cè)、車尾、車底輪胎、擋泥板、水箱和底盤等;仔豬轉(zhuǎn)運(yùn)車車廂各層的地板、側(cè)壁、欄桿、車頂、尾板和窗戶等。用浸濕的植絨拭子涂抹紗布無法采集的地方,包括縫隙(如駕駛室踏板的縫隙和輪胎縫隙等)、直角邊、欄桿內(nèi)部、孔隙和風(fēng)扇葉等邊角地方。每次二級(jí)洗消完畢均在上述位置進(jìn)行采樣。每5個(gè)采樣部位合用1個(gè)植絨拭子或1塊紗布。將采樣后的紗布和拭子放入采樣袋,標(biāo)記車牌號(hào)、采樣日期、洗消中心名稱和豬場名稱等信息。每份樣品密封完好,防止?jié)B漏和互相污染,以豬場和洗消中心為單位保存和送檢。

1.5 進(jìn)入豬場人員的洗消和樣品采集 豬場人員進(jìn)入洗消通道后,換鞋、換衣,進(jìn)入洗澡間洗澡,換干凈的豬場內(nèi)工作服。之后進(jìn)入生活區(qū)隔離24 h。進(jìn)入生活區(qū)后進(jìn)行棉拭子采樣,采樣部位包括頭發(fā)、鼻孔、耳朵和手指甲縫。換下的衣物經(jīng)紫外線照射和噴霧消毒2 h,對(duì)衣物表面和鞋底進(jìn)行植絨拭子采樣。每5個(gè)采樣部位合用1個(gè)植絨拭子或1塊紗布。

1.6 進(jìn)入豬場物資的消毒和樣品采集 根據(jù)物資的不同采用不同的消毒方法。例如,對(duì)獸藥進(jìn)行噴霧和紫外線消毒,對(duì)米、面和油等進(jìn)行紫外線消毒。物資采樣的部位根據(jù)物資的不同采用表面、內(nèi)部或表面+內(nèi)部的采樣方式。每5個(gè)采樣部位合用1個(gè)植絨拭子或1塊紗布。

1.7 豬只血液采集和處理 于豬只前腔靜脈采血,每頭豬采集血液2～5 mL,4 ℃、3 000 r/min離心5 min,取血清。若有溶血,則再次于4 ℃、5 000 r/min離心10 min,取上清,盡量去掉細(xì)胞成分。按體積比1∶1加入甘油,充分振蕩混勻后,-20 ℃保存。

1.8 ASFV實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測 在放置植絨拭子樣品或紗布樣品的滅菌離心管中加入0.5 mL生理鹽水,渦旋儀震蕩30～60 s,室溫靜置1～2 h,使病毒從樣品中充分釋放。12 000 r/min室溫離心3 min,取0.2 mL上清提取基因組。血清樣品則直接提取基因組。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)條件:37 ℃孵育2 min;95 ℃預(yù)變性20 s;95 ℃變性10 s,60 ℃延伸30 s,共40個(gè)循環(huán)。根據(jù)試劑盒說明書對(duì)檢測結(jié)果進(jìn)行判定。

1.9 ASFV抗體ELISA檢測 用樣品稀釋液將待檢血清按1∶100(V/V)進(jìn)行稀釋。每孔加入稀釋好的待檢血清100 μL,同時(shí)設(shè)陽性和陰性對(duì)照。置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱孵育30 min。棄去孔中液體,洗滌液洗滌4次,拍干。每孔加入工作濃度酶標(biāo)抗體100 μL,37 ℃孵育30 min。棄去孔中液體,洗滌液洗滌4次,拍干。每孔加入底物液100 μL,37 ℃避光孵育10 min。每孔加入終止液50 μL,振蕩混合均勻后,在450 nm波長下讀取光密度(Optical density,OD)值。根據(jù)試劑盒說明書計(jì)算結(jié)果并對(duì)結(jié)果進(jìn)行判定。

2 結(jié)果

2.1 進(jìn)入種豬場車輛ASFV核酸的檢出情況 2019—2022年,對(duì)洗消后進(jìn)入豬場的608臺(tái)車輛進(jìn)行2次洗消后檢測ASFV核酸,共有6輛車為ASFV核酸陽性,整體ASFV檢出率為1.0%;2019、2020、2021和2022年的ASFV檢出率分別為2.6%(4/156)、1.3%(2/150)、0(0/162)和0(0/140)(表1)。4年間,飼料配送車、物資配送車和仔豬轉(zhuǎn)運(yùn)車均未檢測到ASFV核酸,但2019和2020年淘汰豬運(yùn)輸車的ASFV檢出率分別為33.3%(4/12)和16.7%(2/12)。

表1 進(jìn)入豬場車輛ASFV核酸的檢出情況

2.2 進(jìn)入豬場人員ASFV核酸的檢出情況 豬場人員進(jìn)入洗消通道洗消后,在隔離房間采樣檢測ASFV核酸,整體ASFV檢出率為1.3%(5/394)。2019、2020、2021和2022年的ASFV檢出率依次為3.0%(3/100)、1.1%(1/92)、0(0/88)和0.9%(1/114)(表2)。

表2 進(jìn)入豬場人員ASFV核酸的檢出情況

2.3 進(jìn)入豬場物資ASFV核酸的檢出情況 2019—2022年,入場物資消毒后整體ASFV檢出率為3.8%(3/79);2019、2020、2021和2022年的ASFV檢出率分別為12.5%(2/16)、0(0/18)、5.9%(1/17)和0(0/28)(表3)。從入場物資類型來看,藥品和疫苗未檢測到ASFV核酸;生活物資(如米、面、油、調(diào)味品、干貨及其包裝)的整體ASFV檢出率為5.9%(3/51),每年的ASFV檢出率依次為20.0%(2/10)、0(0/12)、9.1%(1/11)和0(0/28)。

表3 進(jìn)入豬場物資ASFV核酸的檢出情況

2.4 豬只ASFV核酸的檢出情況 2019—2022年對(duì)該種豬場的斷奶仔豬、后備母豬和生產(chǎn)母豬進(jìn)行ASFV核酸檢測,所有樣品均未檢測到ASFV(表4)。

表4 豬只ASFV核酸的檢出情況

2.5 豬只ASFV抗體的檢出情況 2019—2022年對(duì)該種豬場的斷奶仔豬、后備母豬和生產(chǎn)母豬進(jìn)行ASFV抗體檢測,檢測結(jié)果均為陰性(表5)。

表5 豬只ASFV抗體的檢出情況

3 討論

鑒于非洲豬瘟的高致死率以及沒有有效的疫苗可以防控該病,嚴(yán)格的生物安全措施成為防控該病最為經(jīng)濟(jì)有效的手段,防止ASFV傳入豬場則是該病防控的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[8]?；诖?可通過對(duì)進(jìn)入豬場前的車輛、人員和物資進(jìn)行洗消,最大限度防止ASFV傳入豬場。通過ASFV實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測確認(rèn)進(jìn)入豬場的車輛、人員和物資沒有攜帶ASFV[9-10]。

本試驗(yàn)于2019—2022年監(jiān)測進(jìn)入豬場的車輛共608輛,其中6輛檢出ASFV核酸,這些車全部為淘汰豬運(yùn)輸車。淘汰豬運(yùn)輸車來自社會(huì)車輛,不由企業(yè)控制,在第1次洗消時(shí)也未經(jīng)過企業(yè)監(jiān)督,可能存在車輛第1次洗消不徹底,甚至未進(jìn)行洗消的情況。飼料配送車、仔豬轉(zhuǎn)運(yùn)車和物資配送車由養(yǎng)豬企業(yè)內(nèi)部提供,由養(yǎng)豬企業(yè)人員負(fù)責(zé)和監(jiān)督,清洗完畢后均拍照并上傳企業(yè)內(nèi)部管理系統(tǒng),由專人檢查通過后才能確定洗消完畢,最大限度切斷了傳播途徑。從不同年度來看,淘汰豬運(yùn)輸車ASFV檢出率逐年下降,且在2021年和2022年均未檢測到ASFV核酸。這可能有三方面的原因:一是2019年洗消系統(tǒng)尚未完善,系統(tǒng)運(yùn)行模式尚未成熟,處于摸索階段;二是公司加大了對(duì)淘汰豬運(yùn)輸車司機(jī)的處罰力度,為了降低損失,司機(jī)主動(dòng)加強(qiáng)非洲豬瘟防控知識(shí)的學(xué)習(xí),生物安全意識(shí)逐年增強(qiáng),車輛洗消的質(zhì)量逐年提高;三是種豬場每月組織生產(chǎn)人員進(jìn)行生物安全知識(shí)專題培訓(xùn)和考試,考試成績作為每月績效的重要參考指標(biāo)和年底職級(jí)調(diào)整的重要參考依據(jù),促進(jìn)了豬場生產(chǎn)人員對(duì)淘汰豬運(yùn)輸車司機(jī)的督促和監(jiān)督。研究發(fā)現(xiàn),飼料里面也能檢測到少量ASFV核酸[11]。本試驗(yàn)中監(jiān)測的種豬場使用的飼料來自該企業(yè)的飼料公司,對(duì)飼料原料中ASFV核酸檢測有嚴(yán)格的要求,減少了飼料被ASFV污染的概率。

本試驗(yàn)在4年間,共檢出5名進(jìn)場人員ASFV核酸陽性。2019年的3名為普通飼養(yǎng)員和實(shí)習(xí)學(xué)生,2020年和2022年的2名為實(shí)習(xí)學(xué)生,豬場場長和技術(shù)骨干均未檢出ASFV核酸。這可能是由于普通飼養(yǎng)員的文化水平較低,實(shí)習(xí)學(xué)生剛剛接觸生產(chǎn)實(shí)踐,缺少生物安全防控理念,并且在非工作期間缺少對(duì)可能攜帶ASFV材料和豬肉等自覺遠(yuǎn)離的觀念。隨著企業(yè)和豬場對(duì)這類人員加強(qiáng)教育和培訓(xùn),其生物安全意識(shí)不斷增強(qiáng),ASFV檢出率逐年下降,在2021年達(dá)到進(jìn)場人員ASFV零檢出的效果。

本試驗(yàn)51批入場生活必需品物資中,有3批檢測到ASFV核酸,未在藥品和疫苗中檢測到ASFV核酸。養(yǎng)豬企業(yè)與藥品和疫苗等獸用投入品供應(yīng)企業(yè)簽訂的供貨協(xié)議中要求這些投入品必須為ASFV陰性,供應(yīng)企業(yè)很好地執(zhí)行了這一要求。米、面和油等生活必需品雖然不是豬肉制品,但在食品供應(yīng)中,不可避免與豬肉及其制品接觸。因此,在2019年和2021年的生活物資中檢測到ASFV核酸,提示對(duì)生活物資中ASFV的檢測應(yīng)更加嚴(yán)格。

在洗消過程中,一些較為隱蔽的部位不容易清洗干凈。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),某洗消10次的淘汰豬運(yùn)輸車仍然能檢出ASFV,最終確認(rèn)病毒來源于車輛底盤1個(gè)封閉的凹槽。把封閉凹槽的擋板卸下清洗凹槽后,再次對(duì)該車輛采樣,進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測,結(jié)果為陰性,提示在車輛洗消過程中尤其要注意隱蔽部位的洗消,同時(shí)也說明車輛洗消后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測的重要性。

本試驗(yàn)還調(diào)查了不同季節(jié)和天氣情況對(duì)ASFV檢出的影響,但未發(fā)現(xiàn)某一季節(jié)或某種天氣對(duì)車輛洗消效果有影響,說明車輛洗消效果的關(guān)鍵是要按照規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行操作。

本試驗(yàn)共采集了4 120份豬血液樣品進(jìn)行ASFV核酸和抗體檢測,結(jié)果均為陰性,說明通過對(duì)進(jìn)入豬場的車輛、人員和物資嚴(yán)格洗消和ASFV核酸檢測,能有效阻斷ASFV傳入豬場,保證豬只不被ASFV感染,確保豬群健康。

綜上可知,通過建立種豬場的綜合洗消體系,同時(shí)聯(lián)合應(yīng)用ASFV核酸檢測技術(shù),能有效阻斷ASFV傳入豬場。本洗消體系能在不同的豬場復(fù)制,方法簡便易行,為各個(gè)豬場特別是種豬場非洲豬瘟防控提供了參考。