1例梅花鹿狂犬病的病理學診斷及其病原遺傳進化分析

高 雅,智 宇,張 迪,喬 蕾,邵國玉,丁玉林,葛金英,王金玲

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018;2. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動物疾病臨床診療技術(shù)重點實驗室,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018;3. 內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學院,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010051;4. 內(nèi)蒙古通遼市科爾沁區(qū)畜牧水產(chǎn)工作站,內(nèi)蒙古 通遼 028000;5. 中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所 獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室,黑龍江 哈爾濱 150001;6. 內(nèi)蒙古自治區(qū)興安盟科爾沁右翼前旗動物疫病預防控制中心,內(nèi)蒙古 科爾沁右翼前旗 137713)

狂犬病(Rabies)是由狂犬病病毒(Rabies virus,RABV)引起的侵犯神經(jīng)系統(tǒng)的一種人獸共患的自然疫源性疾病[1]。RABV是單股負鏈不分節(jié)段的RNA病毒,屬于彈狀病毒科(Rhabdoviridae)、狂犬病毒屬(Lyssavirus)[2]。RABV的糖蛋白(Glycoprotein,G)能有效刺激機體產(chǎn)生中和抗體,與病毒的毒力和致病性有關(guān),因此,G基因是檢驗不同病毒株之間關(guān)系的最好選擇[3]。核蛋白(Nucleoprotein,N)基因結(jié)構(gòu)高度保守,因此,N基因經(jīng)常作為病毒基因分型和進化的標準[4]。幾乎所有溫血脊椎動物都易感染RABV,但自然界中最易感染RABV的動物是犬科和貓科動物,以及一些翼手目動物(如蝙蝠)和一些嚙齒類動物[5]。野生動物(如狼、狐貍和鼬獾)是RABV的主要自然宿主。RABV對野生動物的危害是十分巨大的。在韓國[6]、阿根廷[7]和墨西哥[8]等國家均報告過鹿狂犬病病例,其感染與蝙蝠、浣熊和臭鼬有關(guān)。但是,目前世界范圍內(nèi)缺乏野生動物狂犬病散發(fā)性病例的相關(guān)臨床數(shù)據(jù)。中國RABV分離株來源于6個進化分支,China Ⅰ、China Ⅱ、China Ⅴ、China Ⅵ屬于Asian譜系,China Ⅲ屬于Cosmopolitan譜系,China IV屬于Arctic-like譜系[9]。本試驗通過組織病理學檢查、直接免疫熒光法(Direct immunofluorescence assay,DFA)和免疫組織化學(Immunohistochemistry,IHC)對導致1例梅花鹿病死病例的RABV進行鑒定,同時還進行了RABV分離毒株N和G基因的遺傳進化分析,以期為野生動物狂犬病的診斷和防控提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 病料來源 內(nèi)蒙古自治區(qū)包頭市某鹿園共飼養(yǎng)梅花鹿60只,有10余只梅花鹿陸續(xù)死亡,其中有1只成年梅花鹿(病例號為IMAU No. 11189)死前有明顯的狂暴型神經(jīng)癥狀,表現(xiàn)出流涎、流淚、結(jié)膜充血和食欲廢絕等癥狀。據(jù)飼養(yǎng)員介紹園內(nèi)常有野狗出入。

1.2 主要試劑 95%酒精和無水乙醇,均購自天津風船化學試劑科技有限公司;二甲苯,購自天津市北聯(lián)精細化學品開發(fā)有限公司;熒光標記的狂犬病病毒核蛋白單克隆抗體和狂犬病病毒ERA株弱毒疫苗免疫小鼠獲得的多克隆抗體,均由中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所提供;小鼠/兔通用型SAP試劑盒(貨號:SAP-9100),購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;胰酶抗原修復液,賽默飛世爾科技(中國)有限公司;病毒DNA/RNA提取試劑盒、一步法逆轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒和DL-2 000 DNA Marker,均購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

1.3 主要儀器 組織脫水機(Tissue-TeK?VIPTM5 Jr)、組織包埋機(Tissue-TeK?TECT)、水平切片機和烤片機(Tissue-TeK Slide Warmer PS-53),均購自日本Sakuar櫻花公司;展片機,購自德國Leica公司;染色機(Varistain Gemini 371)和蓋片機(Clearvue),購自Thermo Scientific公司;PCR擴增儀(C1000 TouchTM)和全自動凝膠成像分析儀(GelDoc),均購自Bio-Rad公司;電泳儀(DYY-6D),購自北京六一生物科技有限公司;光學顯微鏡(CX40),購自德國萊卡儀器有限公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 剖檢病變觀察 觀察園區(qū)內(nèi)情況,通過問診飼養(yǎng)員了解發(fā)病鹿病史,觀察并記錄發(fā)病鹿的臨床癥狀,并對1例發(fā)病死亡的梅花鹿進行系統(tǒng)的病理剖檢。

1.4.2 組織病理學檢查 剖檢時取腦、肝臟、肺臟、淋巴結(jié)和脾臟等主要的組織器官,立即放入固定液中固定。同時取小腦組織放入-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。將固定好的組織制作成石蠟切片,經(jīng)蘇木素-伊紅(Hematoxylin eosin,H.E.)染色后于顯微鏡下觀察。

1.4.3 DFA檢測 取1.4.2中制備的梅花鹿小腦組織石蠟切片,按照DFA常規(guī)步驟進行[10],以正常梅花鹿的小腦組織作為陰性對照。

1.4.4 IHC檢測 取1.4.2中制備的梅花鹿小腦組織石蠟切片,切片厚4 μm,用75%乙醇梯度脫蠟和水化,0.1%胰酶抗原修復液進行抗原修復,按照小鼠/兔通用型SAP試劑盒說明書,依次滴加內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑、山羊血清封閉,使用一抗(狂犬病病毒ERA株弱毒疫苗免疫小鼠獲得的多克隆抗體)4 ℃孵育過夜,PBS緩沖液洗去一抗后,依次滴加生物素標記山羊抗鼠IgG和辣根過氧化物酶標記鏈霉卵白素工作液。陰性對照使用PBS代替一抗,二氨基聯(lián)苯胺(3,3′-diaminobenzidine,DAB)顯色,中性樹膠封片后在顯微鏡下觀察。

1.4.5 PCR擴增 根據(jù)NCBI上已發(fā)表RABV序列KC193267設(shè)計N和G基因特異性引物(表1),交由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。使用病毒DNA/RNA提取試劑盒提取梅花鹿小腦組織RNA。對提取的RNA進行N和G基因一步法反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(Reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)鑒定。PCR擴增體系:2×One Step Mix 25 μL,One Step Enzyme Mix 2.5 μL,上、下游引物各2 μL,RNA模板2 μL,用RNase Free dH2O補足至50 μL。PCR擴增程序:反轉(zhuǎn)錄50 ℃ 30 min,預變性95 ℃ 3 min;變性94 ℃ 30 s、退火50 ℃ 30 s、延伸 72 ℃ 2 min,共30個循環(huán);72 ℃終延伸10 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表1 引物序列信息

1.4.6 RABVN和G基因的遺傳進化分析 將1.4.5的陽性PCR產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行N和G基因測序。測序結(jié)果用Mega 6生物分析軟件的最大似然法(Maximum likelihood method),通過1 000次重復計算引導值構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,使用DNASTAR 5.0軟件分析比較試驗獲得RABV序列與參考毒株序列的核苷酸同源性。

2 結(jié)果

2.1 剖檢病變觀察 對發(fā)病死亡的梅花鹿進行病理剖檢,可見腦水腫明顯,腦脊液增多,腦膜靜脈充血擴張(圖1A),腦干切面彌散分布針尖大小的出血點(圖1B)。其他組織器官眼觀無明顯病變。

圖1 病死梅花鹿腦組織剖檢病變觀察

2.2 病理組織學檢查 病死梅花鹿腦充血和水腫,呈現(xiàn)典型的非化膿性腦炎,可見大量以血管為中心的出血灶(圖2A)。部分腦神經(jīng)細胞變質(zhì),偶見大量淋巴細胞和少量巨噬細胞呈圍管性浸潤,形成淋巴細胞性“管套”病變(圖2B)。在腦組織神經(jīng)細胞的胞漿內(nèi)可見大小不等的、嗜酸性圓形或橢圓形的RABV包涵體,特別是在小腦浦肯野細胞(圖2C藍色箭頭)、大腦錐體細胞(圖2D藍色箭頭)、大腦多形細胞、海馬多形細胞、錐體細胞和脊髓多極運動神經(jīng)元胞漿內(nèi)。肝臟、肺臟、脾臟、淋巴結(jié)和腎臟等實質(zhì)器官出現(xiàn)充血和出血性變化。

圖2 病死梅花鹿腦組織病理組織學變化(H.E.染色)

2.3 DFA檢測 結(jié)果顯示,在陰性對照成立的情況下,在病死梅花鹿的小腦組織中檢測到大量特異性的亮綠色的RABC抗原陽性信號(圖3)。

圖3 DFA檢測病死梅花鹿小腦組織(A)和陰性對照(B)中狂犬病病毒抗原(400×)

2.4 IHC檢測 結(jié)果顯示,在病死梅花鹿的小腦浦肯野細胞的胞漿內(nèi)檢測到大小不等的、圓形或橢圓形的典型的棕色RABV抗原的特異性陽性信號(圖4)。

圖4 IHC檢測病死梅花鹿小腦組織(A)和陰性對照(B)中狂犬病病毒抗原(400×)

2.5 PCR擴增 PCR擴增得到1 675和1 424 bp大小的目的條帶(圖5),符合預期產(chǎn)物大小,將該RABV分離株命名為NM Deer 01。

圖5 病死梅花鹿腦組織RABV G和N基因的PCR擴增

2.6 RABVN基因的遺傳進化分析 通過Mega 6和DNASTAR 5.0軟件對本試驗獲得RABV分離毒株N和G基因序列與參考毒株進行遺傳進化分析。N基因核苷酸序列分析結(jié)果顯示,病毒NM Deer 01同2019年河南犬源毒株(MK567666)、2019年甘肅羊源毒株(MK577649)、2015年湖北牛源毒株(KR230090)、2009年福建犬源毒株(FJ866835)、2015年呼和浩特牛源毒株(KC193267)和2014年山東犬源毒株(JQ970486)位于同一分支,均屬于Asian譜系;NM Deer 01毒株與2015年呼和浩特牛源毒株(KC193267)和2015年湖北牛源毒株(KR230090)核苷酸同源性最高,均為99.5%,與其他參考毒株核苷酸同源性介于86.4%～99.5%(圖6)。

圖6 基于梅花鹿源RABV N基因構(gòu)建的遺傳進化樹

2.7 RABVG基因的遺傳進化分析G基因核苷酸序列分析結(jié)果顯示,病毒NM Deer 01同2019年河南犬源毒株(MK567666)、2019年甘肅羊源毒株(MK577649)、2015年湖北牛源毒株(KR230090)、2009年福建犬源毒株(FJ866835)、2015年呼和浩特牛源毒株(KC193267)和2014年山東犬源毒株(JQ970486)位于同一分支,均屬于Asian譜系;NM Deer 01毒株與2014年山東犬源毒株(JQ970486)和2015年呼和浩特牛源毒株(KC193267)同源性最高,均為99.3%,與其他參考毒株核苷酸同源性介于83.0%～99.3%(圖7)。

圖7 基于梅花鹿源RABV G基因構(gòu)建的遺傳進化樹

3 討論

動物狂犬病的臨床表現(xiàn)可分為狂暴型和麻痹型2種[11]?？癖┬捅憩F(xiàn)為極典型的神經(jīng)癥狀,如興奮、具有攻擊行為,后期會引起咽肌局部發(fā)生痙攣或全身肌肉麻痹而造成死亡。而麻痹型狂犬病發(fā)病動物從發(fā)病初期至死亡一直表現(xiàn)為精神沉郁[12]。本試驗中的病死梅花鹿有流涎、亂跑、頂人和亂撞等明顯的神經(jīng)癥狀,可判斷該鹿表現(xiàn)為狂暴型。狂犬病不同的臨床類型表現(xiàn)與咬傷部位感染的病毒量和毒株的種類不同有關(guān)[13]。

狂犬病的病理組織學診斷標準是在腦神經(jīng)細胞胞漿內(nèi)觀察到嗜酸性包涵體,即內(nèi)基氏小體(Negri body),這種小體主要分布于大腦皮層和海馬回椎體細胞、小腦浦肯野細胞和基底核、脊神經(jīng)核以及交感神經(jīng)節(jié)等處神經(jīng)細胞的胞質(zhì)內(nèi)[14]。本試驗病死梅花鹿除非化膿性腦炎病變外,在腦組織多數(shù)神經(jīng)細胞胞漿內(nèi)均發(fā)現(xiàn)了典型的嗜酸性RABV包涵體。DFA是世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)推薦的狂犬病實驗室診斷方法,我國也將此法作為檢測狂犬病的首選方法,該方法具有特異性高、靈敏度強的優(yōu)點[15]。有研究表明,犬和貓的大腦海馬是RABV檢測的最佳部位;牛在腦干部檢測RABV效果最明顯,其次在小腦;頸脊髓和靠近腦干的區(qū)域是馬屬動物檢測RABV抗原的最好部位;浣熊和臭鼬在腦組織的各個部位都可檢測到RABV[16]。本試驗病死梅花鹿采用DFA和IHC均在小腦組織中檢測到RABV特異性陽性信號。

鹿主要通過被帶毒犬咬傷以及在放牧、交配爭斗和鋸鹿角時損傷而感染RABV[17]。有報道顯示,我國自1950年以來,鹿狂犬病在部分地區(qū)的發(fā)病率高達30%,多出現(xiàn)于一些養(yǎng)殖場和養(yǎng)殖戶中[18]。野生鹿群感染狂犬病大多數(shù)由于與蝙蝠、浣熊和臭鼬接觸或鹿群的飲水和飼料被RABV污染。本試驗根據(jù)對現(xiàn)場環(huán)境調(diào)查結(jié)合問診園內(nèi)獸醫(yī)得知,鹿園內(nèi)常有流浪犬進出引起鹿群不安,個別梅花鹿身體上出現(xiàn)過咬傷,因此推測本例梅花鹿發(fā)生狂犬病與被帶毒流浪犬咬傷密切相關(guān)。RABV從傷口處進入并繁殖,然后通過逆行軸突運輸?shù)街袠猩窠?jīng)系統(tǒng),導致大腦或脊髓發(fā)生炎癥;RABV在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中經(jīng)過一段時間的復制后,病毒粒子可通過軸突進入唾液腺,從而很容易地完成傳播周期并感染下一個新的易感宿主[19]。

亞洲和非洲是狂犬病的高發(fā)地區(qū),RABV在人、寵物、家畜和野生動物之間不斷循環(huán)感染[20]。截至2014年,內(nèi)蒙古地區(qū)共報道了30多種動物患狂犬病,包括狗、貉、紅狐、牛、羊和駱駝等[21]。2018年,于明洋等[22]報道了2014—2016年內(nèi)蒙古地區(qū)5起野生狐貍、牛、駱駝和犬的狂犬病疫情,對6株RABVN基因序列進行遺傳進化分析,結(jié)果顯示,6株毒株均屬于Cosmopolitan譜系草原型RABV,該型毒株廣泛在俄羅斯、蒙古和哈薩克斯坦的野生狐貍和狼群中傳播。2022年,Feng等[23]報道了2019—2021年內(nèi)蒙古地區(qū)家畜和野生食肉動物(狐貍、獾和浣熊)的狂犬病發(fā)生情況,并對80株RABVN基因序列進行遺傳進化分析,結(jié)果顯示,97.5%的病毒株屬于Cosmopolitan譜系草原型,其余毒株屬于Arctic-related譜系和Asian譜系。2011年,Shao等[24]報道了內(nèi)蒙古地區(qū)5例浣熊狂犬病病例,對RABVN基因和G基因的遺傳進化分析顯示,分離毒株與俄羅斯遠東地區(qū)和韓國分離的Arctic-like譜系RABV密切相關(guān),但不同于中國流行地區(qū)廣泛分布的Asian譜系RABV。不同于上述文獻對內(nèi)蒙古地區(qū)野生動物RABV譜系的報道,本試驗對病死梅花鹿的N和G基因序列進行遺傳進化分析,結(jié)果顯示,分離毒株NM Deer 01的N和G基因均與2015年呼和浩特牛源毒株(KC193267)同源性最高,從基因?qū)用嫔献C明了該梅花鹿感染了RABV,分離毒株的N和G基因同呼和浩特、河南、甘肅、山東、湖北和福建等地毒株位于同一分支,同屬于Asian譜系,這與該鹿園與呼和浩特、河南、甘肅和山東的地理位置較近有關(guān)。依據(jù)疾病發(fā)生的時間和位置,推測該病毒有從北方逐漸向南方擴散蔓延的趨勢。

近年來,RABV依舊在世界范圍內(nèi)不斷感染野生動物和家畜,因此,對動物狂犬病進行防治十分必要。建議本試驗中的鹿場加強飼養(yǎng)管理,將鹿園周圍圍欄加裝細鐵絲網(wǎng),以防再有流浪犬進入鹿園;立即對未感染鹿群集體注射狂犬病疫苗,公梅花鹿2.5～3.5 mL/頭,母梅花鹿2.5 mL/頭[25];患病鹿立即處死,焚燒或緊急接種治療;病死鹿尸體立即焚燒,禁止取皮或食用;飼養(yǎng)人員也應盡早注射狂犬病疫苗,以防人員感染。