低溫沙藏及外源激素添加對唐古特瑞香種子萌發(fā)及生理生化的影響

賈襲偉，久西加，郭曉霞，徐寵然，馬 瀟，曾翠云， ，陳紅剛， ，杜 弢，?

（1.甘肅中醫(yī)藥大學藥學院，甘肅 蘭州 730000； 2.甘肅省藥品檢驗研究院，甘肅 蘭州 730070； 3.西北中藏藥協(xié)同創(chuàng)新中心，甘肅 蘭州 730000）

唐古特瑞香DaphnetanguticaMaxim.來源于瑞香科瑞香屬，又稱陜甘瑞香、甘肅瑞香、甘青瑞香、冬青草等，藏藥稱“省相那瑪”，是中藥祖師麻的基原植物之一［1］，主要分布于我國西北、西南等海拔2 700 ～3 100 m 的高山林下、林緣及灌木叢中，其根皮和莖皮入藥，具有祛風除濕、散寒止痛、活血散瘀功效［2］。唐古特瑞香作為常綠灌木，具有較高的生態(tài)價值和觀賞價值［3］，但其種子存在休眠期長、發(fā)芽率低、種群開拓性差等問題，資源再生困難，且野生資源過度采挖，難以滿足市場需求［4］。人工栽培可能是緩解資源短缺的主要手段，因此開展唐古特瑞香種子休眠研究具有重要的實際意義和應用價值。

種子休眠是植物維持生存或適應環(huán)境變化的重要特性，有利于種子順利度過逆境，在環(huán)境適宜的時候生根發(fā)芽，繁衍后代［5-6］。Baskin 把種子休眠主要分為生理休眠、物理休眠、形態(tài)休眠、形態(tài)生理休眠及復合休眠5 大類型［7］。目前唐古特瑞香種子休眠類型及原因仍不明確，相關研究報道較少，趙潔等［8］考察變溫沙藏和不同濃度赤霉素對唐古特瑞香種子萌發(fā)的影響，發(fā)現(xiàn)相比自然條件下，發(fā)芽率小幅提高，但種子基礎生物學指標、休眠原因、休眠類型及沙藏過程中種子內部生理生化特性未見報道。本實驗以當年采收的唐古特瑞香種子為研究對象，通過種子吸水、種皮硬度測定、沙藏、外源激素浸種、種子發(fā)芽等試驗，探究唐古特瑞香種子休眠破除方法，為唐古特瑞香育苗技術的制定提供參考。

1 材料

1.1 藥物 唐古特瑞香種子于2020 年購買于武威泰康制藥有限公司，經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學藥學院杜弢教授鑒定為唐古特瑞香DaphnetanguticaMaxim.的種子。

1.2 試劑 6-芐氨基腺嘌呤（批號CB291530100）、赤霉素（批號616H022） 均購自南京吉特恩生物科技有限公司；蛋白定量測定試劑盒（批號A045-2-2）、植物可溶性糖檢測試劑盒（批號A145-1-1）、植物淀粉含量測試盒（批號A148-1-1） 均購自南京建成生物工程研究所； IAA （批號QC7898）、GA （批號 QC5680）、ABA （批號 QC4585）ELISA 檢測試劑盒均購自上海欽誠生物科技有限公司。

1.3 儀器 BSA224S-CW 電子天平（北京賽多利斯科學儀器有限公司）； GTOP-500 Y 智能光照恒溫培養(yǎng)箱（浙江托普儀器有限公司）； Leica-CM 1950 冷凍切片機［徠卡顯微系統(tǒng)（上海） 貿易有限公司］； 543OR 超速冷凍離心機（常州金壇良友儀器有限公司）； Vortex-Genie 2T 漩渦混合離心機（北京海天友誠科技有限公司）； T6 新世紀紫外-可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）； THZ-82 氣浴恒溫震蕩箱（常州金壇恒豐儀器制造有限公司）；HH-4 數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇金壇市環(huán)宇科學儀器廠）。

2 方法與結果

2.1 試驗設計 除去瑞香種子殘留果皮，水沉去除漂浮在水面上的癟子，剩余種子置陰涼處晾干，室溫條件下貯存?zhèn)溆?。挑選飽滿、無霉變、完整無機械損傷的種子裝入尼龍網(wǎng)袋中，分層儲藏于含水量為20%的濕沙盒內，沙盒置于4 ℃冰箱中，沙藏周期為120 d，每20 d 取樣1 次，測定內含物、內源激素含量?；谇捌诎l(fā)芽預實驗的條件選擇，同時將各沙藏階段的種子分別以6-芐氨基嘌呤（6-BA，20 mg/L）、赤霉素（GA，300 mg/L）、蒸餾水 （CK） 浸種24 h后于25 ℃培養(yǎng)箱內進行暗培養(yǎng)，統(tǒng)計發(fā)芽率、發(fā)芽時滯天數(shù)等指標，每組實驗重復3 次。

2.2 研究方法

2.2.1 唐古特瑞香種子千粒重測定 參照GB/T3543 標準對唐古特瑞香種子的千粒重進行測定［9］。

2.2.2 唐古特瑞香種子吸水率測定 隨機稱取風干的唐古特瑞香種子1.0 g，浸泡于蒸餾水中，分別在2、4、6、8、10、12 h 取出，用濾紙吸干種子表面水分，精密稱定（0.000 1 g），重復3 次［10-11］，直至種子質量變化范圍在0.005 g 內時結束測定，計算種子吸水率。公式為吸水率＝（Wt－W） /W×100%，式中Wt 為種子吸水后重量，W為種子干重。

2.2.3 唐古特瑞香種皮硬度測定 隨機取唐古特瑞香種子3 份，每份30 粒，于谷物種皮硬度測定儀中測定，計算平均值［12］。

2.2.4 發(fā)芽指標測定 定期取不同沙藏階段的唐古特瑞香種子各450 粒，用2%次氯酸鈉溶液浸泡消毒15 min，隨后蒸餾水沖洗30 min 用以發(fā)芽試驗，分別以300 mg/L GA 和20 mg/L 6-BA 浸種處理24 h，以蒸餾水浸種處理24 h 為對照（CK），最后播于紙床上，每皿播種50 粒，重復3 次，在25 ℃恒溫暗處培養(yǎng)，及時補足水分，統(tǒng)計發(fā)芽種子數(shù)，計算發(fā)芽率，公式為發(fā)芽率＝發(fā)芽種子粒數(shù)/總種子粒數(shù)×100%。發(fā)芽時滯天數(shù)自種子播于紙床上開始計算，持續(xù)到第一粒種子發(fā)芽所需時間。

2.2.5 生化指標測定 在低溫沙藏期間，定期取種子，經(jīng)液氮冷凍后，貯存于－80 ℃冰箱中。使用酶標儀，通過考馬斯亮藍法測定可溶性蛋白； 蒽酮比色法測定可溶性糖；酸水解法和蒽酮比色法測定淀粉； 酶聯(lián)免疫分析方法（ELISA） 測定樣品中赤霉素（GA）、生長素（IAA） 及脫落酸（ABA） 等內源激素含量，具體方法參照各試劑盒說明書［13-14］。

2.3 數(shù)據(jù)分析 使用Microsoft Excel 2010 軟件進行數(shù)據(jù)記錄并整理，采用SPSS 19.0 軟件對試驗中各測定指標數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析，運用軟件Origin 2019 軟件制圖，圖中的結果均以（±SE） 表示。

2.4 結果分析

2.4.1 唐古特瑞香種子形態(tài)、千粒重、種皮硬度及吸水率變化 唐古特瑞香種子發(fā)芽圖見圖1A。唐古特瑞香果實脫去果肉后其種子外種皮呈黑褐色，外形圓潤飽滿，為雙子葉無胚乳種子，種胚形態(tài)健全，見圖1B。當年采收的唐古特瑞香種子千粒重59.40 g，種殼硬度3.66 kgf，未除去外種皮的種子22 h 可吸水飽和。

圖1 唐古特瑞香種子發(fā)芽（A） 和形態(tài)特征圖（B）

2.4.2 不同沙藏時間對唐古特瑞香種子發(fā)芽時滯天數(shù)的影響 隨著沙藏時間延長，唐古特瑞香種子在各個沙藏階段發(fā)芽時滯天數(shù)逐漸縮短，未沙藏種子發(fā)芽時滯天數(shù)為24 d；沙藏20 d 后，發(fā)芽時滯天數(shù)縮短為10 d； 沙藏60 d 后，各階段種子發(fā)芽時滯天數(shù)趨于穩(wěn)定，縮短為4 d，見圖2。

圖2 沙藏時間對種子發(fā)芽時滯天數(shù)的影響

2.4.3 不同浸種處理對各階段沙藏種子發(fā)芽率的影響 圖3 表明，隨著沙藏時間的延長，外源激素對種子萌發(fā)影響顯著，20 mg/L 6-BA 浸種處理在沙藏60 d 時發(fā)芽率最高，為21.33%； 300 mg/L GA 浸種處理在沙藏80 d 時發(fā)芽率最高，為17.33%； 而清水浸種（CK） 在各沙藏階段中發(fā)芽率均不足5%。綜上所述，沙藏60 ～80 d 最有利于種子萌發(fā)，但必須結合外源激素浸種手段以提高發(fā)芽率，單純延長沙藏時間或施以外源激素浸種處理并不能有效打破唐古特瑞香種子的休眠。

圖3 不同浸種處理對沙藏種子發(fā)芽率的影響

2.4.4 不同沙藏時間對唐古特瑞香種子內含物含量的影響

2.4.4.1 對可溶性蛋白質含量的影響 由圖4 可知，沙藏初期可溶性蛋白含量下降平緩，其含量在60 d 時出現(xiàn)最小值11.237 mg/g，60 d 后又平緩上升，總體呈下降趨勢。隨著沙藏時間的持續(xù)延長，除60 d 時可溶性蛋白含量顯著低于其他階段外，其他沙藏階段可溶性蛋白含量差異不顯著?？扇苄缘鞍踪|主要參與各種酶蛋白的代謝或作為基礎供能物質被消耗，經(jīng)過一系列的生理活動最終降解為氨基酸，為種子休眠的解除和萌發(fā)提供足夠的氮源，其含量變化可以間接反映種子內部生命活動代謝的強弱［15］。

圖4 沙藏時間對唐古特瑞香種子可溶性蛋白含量的影響

2.4.4.2 對淀粉含量的影響 由圖5 可知，隨著沙藏時間的延長，唐古特瑞香種子淀粉含量總體呈下降趨勢，其中沙藏20～40 d 時，淀粉含量下降迅速，40 d 后下降較為平緩，120 d 出現(xiàn)最小值為1.274 mg/g。未沙藏種子可溶性淀粉含量顯著高于各階段沙藏處理，說明在沙藏過程中，呼吸作用使種子內部的儲能物質發(fā)生轉變，淀粉逐漸分解，轉化成可溶性糖等，供應種子正常的生理代謝消耗，為種子萌發(fā)做前期準備［16］。

圖5 沙藏時間對唐古特瑞香種子可溶性淀粉含量的影響

2.4.4.3 對可溶性糖含量的影響 由圖6 可知，沙藏時間在20～60 d 期間，可溶性糖含量呈下降趨勢，60 d 達到最小值9.331 mg/g，其中20～40 d 可溶性糖含量下降最為迅速，60～100 d 可溶性糖含量有所升高，在100 d 時達到峰值，120 d 時含量又有所下降，在整個沙藏過程中種子可溶性糖含量總體呈下降趨勢。縱觀整個沙藏過程種子中可溶性糖含量變化曲線，20 ～60 d 可能是由于此時種子內部生理代謝活動旺盛，大量消耗了子葉中貯藏的可溶性糖，在60～100 d 種子中可溶性糖含量增加，當達到100 d 時其含量顯著高于60 d，從沙藏60 d 開始，唐古特瑞香種子內部可溶性糖消耗速率減緩，可能因淀粉分解使得可溶性糖含量有所升高，種子內部代謝活動發(fā)生變化。

圖6 沙藏時間對唐古特瑞香種子可溶性糖含量的影響

2.4.5 不同沙藏時間對唐古特瑞香種子內源激素含量的影響

2.4.5.1 對IAA 含量的影響 如圖7 所示，隨著沙藏時間的延長，吲哚乙酸（IAA） 含量呈現(xiàn)“N” 形曲線變化，在0～40 d 和80～120 d 時出現(xiàn)2 次增長； 其最高峰出現(xiàn)在沙藏40 d，IAA 含量為4.184 ng/g，除與沙藏120 d 時比較差異不顯著外，顯著高于其他各沙藏階段； 80 d 時IAA 含量最低為2.187 ng/g，顯著低于其他沙藏階段； 在40～80 d 期間IAA 含量平緩下降。有研究表明，IAA 含量在適宜的濃度范圍內對種子解除休眠有一定的促進作用，間接影響種胚的發(fā)育和其他激素水平，具有釋放種子休眠、促進種子萌發(fā)的作用［17］，但在本實驗中不同沙藏階段IAA 含量并未表現(xiàn)出規(guī)律性的變化。

圖7 沙藏時間對唐古特瑞香種子IAA 含量的影響

2.4.5.2 對GA 含量的影響 由圖8 可知，唐古特瑞香種子在整個沙藏過程中赤霉素（GA） 含量呈上升趨勢，各沙藏階段的種子GA 含量均顯著高于未沙藏種子，在沙藏初期（20、40 d） 含量增加平緩且無顯著性差異，60 d 時含量顯著升高，此后穩(wěn)定，一直持續(xù)到100 d； 100 ～120 d 時其含量又急劇增加，120 d 達到最大值116.656 ng/g。赤霉素（GA） 在種子處理中應用廣泛，對多種植物種子萌發(fā)具有促進作用［17］，本實驗中特別是沙藏后期，GA 含量逐步升高，同時發(fā)芽率亦表現(xiàn)出升高的趨勢，說明GA 含量增加對唐古特瑞香種子休眠的解除具有積極作用，能夠提高發(fā)芽率，很有可能是唐古特瑞香種子萌發(fā)的主要促進物質。

圖8 沙藏時間對唐古特瑞香種子GA 含量的影響

2.4.5.3 對GA/ABA 比值的影響 種子內源激素的消長平衡調控著種子的休眠水平，大量研究表明種子內源激素的絕對含量只是調控機制中的一個方面，然而激素間的相對比值關系直接影響內源激素最終的調控效果。近年來，赤霉素與脫落酸（GA/ABA） 的比值受到更多科研工作者的關注［15］，ABA 被認為是最常見的種子萌發(fā)抑制劑，與GA存在拮抗作用，正向調節(jié)種子休眠時間，抑制其萌發(fā)［18］。圖9 顯示，GA/ABA 值在整個沙藏階段呈現(xiàn)雙峰增長曲線，先緩增再急減，又急增后降低，GA/ABA 值在40 d 時急劇上升，60 d 和80 d 兩個階段均保持在較高水平，分別為12.48、10.71，與此同時60 d 和80 d 兩個階段唐古特瑞香種子發(fā)芽率顯著提高，分別為21.33%和17.33%，80 d 后GA/ABA 值急劇下降并低于沙藏前期，種子發(fā)芽率隨之降低，最低為2%。結果顯示，GA/ABA 比值與唐古特瑞香種子發(fā)芽率有著密切聯(lián)系。

3 討論

3.1 唐古特瑞香種子休眠解除與營養(yǎng)物質轉化的關系 本實驗通過對唐古特瑞香種子在4 ℃恒溫條件下進行為期120 d 的低溫沙藏處理，沙藏過程中淀粉、可溶性糖含量總體呈降低趨勢，作為種子呼吸作用的基礎物質被消耗利用，與許美玲［19］研究結果一致。沙藏前期變化幅度較大，后期變化趨于平緩，這可能是因為種子沙藏前后環(huán)境溫度不同，種子內部代謝增強，淀粉分解為可溶性糖的速率提高，以增強種子抗寒機能，便于種子保持正常的生理活性，與沙藏后種子內部新陳代謝活動改變有關［20-22］?？扇苄缘鞍踪|在沙藏前期可能作為基礎供能物質有所消耗； 60 d 后含量逐漸增加，可能由于種子內部代謝規(guī)律發(fā)生變化。

3.2 唐古特瑞香種子休眠解除與內源激素的關系 在內源激素含量中，IAA 含量在整個沙藏過程中變化呈“N” 形曲線，40～80 d 時呈下降趨勢，并在80 d 達到最低點。有研究表明IAA 含量在適宜濃度范圍與其他內源激素相互作用可間接影響種胚發(fā)育［23］； 也有研究表明IAA 低濃度可促進種子萌發(fā)，高濃度對種子萌發(fā)具有抑制作用［24］。IAA 含量在2.187～3.386 ng/g （對應時期為沙藏60 ～80 d） 范圍內有利于唐古特瑞香種子萌發(fā)，但整個沙藏過程中未表現(xiàn)出一致的變化規(guī)律。GA 作為一種信號物質，其促進種子發(fā)芽的作用已被廣泛認可，本實驗中GA 含量在沙藏過程中總體呈上升趨勢，各沙藏階段GA 含量均顯著高于未沙藏種子，這與張成才等［25］關于百蕊草種子休眠研究結果一致。相對單一激素含量來講，不同激素含量間的平衡消長變化對于種子休眠與發(fā)芽的調控作用更為重要，尤其是生長促進類激素與生長抑制類激素含量間的平衡［26］。有研究指出，ABA 是種子發(fā)芽抑制類物質，而GA 與ABA 的比值是決定種子休眠是否解除的關鍵因素［27］，從GA/ABA 值來看，在整個沙藏階段呈現(xiàn)“雙峰” 增長曲線，在60 d 時出現(xiàn)了短暫的峰值后轉為平緩下降趨勢，60 d 時以20 mg/L的6-BA 浸種后種子發(fā)芽率明顯提高，這與前人關于GA/ABA 值是調控種子繼續(xù)休眠或萌發(fā)的重要因素的研究結論相似［28］。但沙藏后未用外源激素浸種處理的種子發(fā)芽率仍不足5%，推測在唐古特瑞香種子整個沙藏過程中，其內源激素代謝并不能達到理想的平衡狀態(tài)促使種子萌發(fā)，需用適量的外源激素幫助其打破休眠狀態(tài)，這與趙潔等［8］研究結論相似，盡管模擬其生境溫度時設置了變溫沙藏試驗，但與本實驗4 ℃恒溫沙藏的種子發(fā)芽率接近。

4 結論

唐古特瑞香種子子葉發(fā)達，種胚形態(tài)健全，種子吸水率良好，故不存在形態(tài)休眠和吸水障礙； 在內源激素方面，GA 與ABA 含量的比值可能是解除唐古特瑞香種子休眠的關鍵； 4 ℃沙藏60 d 時以20 mg/L 6-BA 浸種24 h，或沙藏80 d 時以300 mg/L GA 浸種24 h 可有效破除休眠現(xiàn)象，提高種子發(fā)芽率。