六味地黃丸對阿爾茨海默病秀麗隱桿線蟲模型的神經(jīng)保護作用

雷 霞，王加朋，佟玉良，張金鳳，蘇 婷，于 浩，金美玲，徐紅丹，張 寧?

（1.南京中醫(yī)藥大學無錫附屬醫(yī)院，江蘇省中醫(yī)退行性骨關節(jié)病臨床醫(yī)學創(chuàng)新中心，江蘇 無錫 214071；2.黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040； 3.佳木斯大學藥學院，黑龍江 佳木斯 154007； 4.無錫衛(wèi)生高等職業(yè)技術(shù)學校，江蘇 無錫 214028）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD） 是一種與年齡相關的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，目前AD 患者已超過3 500 萬人［1］。有研究表明，在受AD 影響的海馬神經(jīng)元中，常出現(xiàn)線粒體功能障礙和生物能量缺陷，而這些異常在出現(xiàn)AD癥狀之前就已經(jīng)存在。線粒體功能障礙導致細胞能量缺陷和氧化損傷引發(fā)Aβ 沉積，進一步導致認知缺陷［2］。因此，保護線粒體功能是治療AD 的重要策略。

六味地黃丸源自《小兒藥證直訣》，具有滋陰補腎之功效。有研究表明，六味地黃丸在治療AD 方面具有顯著的療效［3-5］。實驗研究也發(fā)現(xiàn)，六味地黃丸對氫化可的松和側(cè)腦室注射Aβ25-35構(gòu)建的老年癡呆癥狀有改善作用［6］。課題組前期已經(jīng)證明六味地黃丸具有神經(jīng)保護作用，且可能與調(diào)節(jié)腦能量代謝密切相關［7］。秀麗隱桿線蟲Caenorhabditiselegans不僅具有體積小、生命周期短、易于培養(yǎng)和觀察等特點，而且其組成以神經(jīng)元細胞為主，幾乎所有涉及哺乳動物神經(jīng)元功能的基因家族都存在于線蟲中，這使得線蟲更易于用作探究神經(jīng)元水平的能量代謝情況［8］。因此，本研究以C.elegans為實驗對象，探索六味地黃丸對神經(jīng)元線粒體損傷的保護作用機制，從能量代謝衰竭學說角度尋找安全可靠的抗AD 中藥。

1 材料

1.1 實驗動物 秀麗隱桿線蟲，CL2355 （轉(zhuǎn)染人源Aβ 基因） 品系、CL2122 （野生型） 品系線蟲株均購自明尼蘇達大學秀麗隱桿線蟲遺傳中心（CGC）。

1.2 試劑與藥物 六味地黃丸濃縮丸、鹽酸二甲雙胍片（北京同仁堂藥店哈爾濱店）。Phospho-AMPKα （Thr172）抗體（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號AA393）；Anti-SIRT1、Anti-β-actin 抗體（武漢博士德生物工程有限公司，批號PB0173、BM3873）； TRIzol 總RNA 提取試劑（美國賽默飛世爾科技公司，批號223306）； FastKing cDNA第一鏈合成試劑盒（去基因組） ［天根生化科技（北京）有限公司，批號U8819］。

1.3 儀器 電泳儀、半干轉(zhuǎn)膜儀（美國伯樂公司，型號PowerPacTMHC、PowerPacTMBasic）； 實時熒光定量PCR 儀（美國安捷倫科技有限公司，型號Mx3000P）； 生化培養(yǎng)箱（上海智城分析儀器制造有限公司，型號ZSD-1160）； 熒光倒置顯微鏡、體式顯微鏡 （日本奧林巴斯公司，型號IX71、SZ-51）。

2 方法

2.1 實驗分組 實驗分為空白組（CL2122 型）、模型組（CL2355 型）、陽性藥組（CL2355 型，50 mmol/L 二甲雙胍） 和六味地黃丸低、中、高劑量組（CL2355 型，0.5、1.0、2.0 mg/mL）。

2.2 溶液配制

2.2.1 六味地黃丸提取物的制備 取六味地黃丸濃縮丸，研細，取96 g 置于燒杯中并加入500 mL 80%乙醇，攪拌，超聲提取1 h，回流萃取2 次，每次30 min，將濃縮液凍干，得到六味地黃丸提取物凍干粉。研究表明80%六味地黃丸乙醇提取物中含有沒食子酸、5-羥甲基糠醛、莫諾苷、馬錢苷、芍藥苷、山茱萸新苷、丹皮酚等主要有效成分?？紤]盡量除雜和盡可能多地保留有效成分，本實驗采用80%乙醇對六味地黃丸進行萃取。

2.2.2 六味地黃丸含藥培養(yǎng)基的配制 精密稱取六味地黃丸提取物100、200、400 mg，分別加至200 mL 滅菌的50 ℃線蟲生長培養(yǎng)基（NGM） 中，搖勻，使終質(zhì)量濃度分別為0.5、1、2 mg/mL。取上述藥液100 mL 于滅菌的培養(yǎng)皿中，冷卻凝固為含藥培養(yǎng)基； 另外100 mL 加入大腸桿菌，制備含藥菌液。取20 μL 含藥菌液滴在培養(yǎng)基中心位置，置于37 ℃恒溫下培養(yǎng)12～14 h，15 ℃下貯存。本實驗直接將六味地黃丸凍干粉加入配制好的約50 ℃的NGM 培養(yǎng)基中。NGM 培養(yǎng)基配制時已加入無水乙醇助溶，故六味地黃丸粉末可完全溶于培養(yǎng)基中。

2.2.3 二甲雙胍含藥培養(yǎng)基的配制 取鹽酸二甲雙胍片，碾碎，精密稱取1.656 3 g，加到200 mL 滅菌的50 ℃NGM培養(yǎng)基中，按照“2.2.2” 項下六味地黃丸含藥培養(yǎng)基、含藥菌液的制備步驟進行配制。二甲雙胍溶于水，其粉末亦可在NGM 培養(yǎng)基中溶解，故無需考慮溶酶介質(zhì)的影響。

2.2.4 OP50 細菌的培養(yǎng) 在細菌培養(yǎng)板上挑取大腸桿菌OP50 單菌落至5 mL 的LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)過夜。細菌的分離純化步驟為取200 μL 菌液于LB 固體培養(yǎng)基上，用滅菌的涂布器涂布均勻，37 ℃培養(yǎng)過夜。培養(yǎng)OP50 作為線蟲的食物，待平板上長出單菌落后，用滅菌的接種環(huán)挑取單菌落至200 mL LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖床振蕩培養(yǎng)24 h。

2.2.5 NGM 配制 取蛋白胨（peptone） 2 g、瓊脂16 g、NaCl 2.4 g，置于潔凈1 000 mL 玻璃三角瓶，加入1 mol/L磷酸緩沖液20 mL，蒸餾水定容至800 mL （此混合物為初始培養(yǎng)基），120 ℃高壓蒸汽滅菌30 min，置于55 ℃水浴鍋中冷卻，依次加入5 mg/mL 膽固醇（無水乙醇溶解，不滅菌） 0.8 mL，高壓滅菌的1 mol/L MgSO4、1 mol/L CaCl2各0.8 mL，搖勻即得到完全培養(yǎng)基。

2.2.6 含菌NGM 培養(yǎng)基配制 取200 μL OP50 菌液于NGM 平板上，用滅菌的涂布器輕輕地涂布均勻，涂布時使菌苔距離平板2 cm 左右，涂布完畢后，室溫放置菌液干透，轉(zhuǎn)至20 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)過夜，使培養(yǎng)基上長出一層薄薄的菌苔。

2.3 行為學實驗 野生型線蟲對NaCl 具有趨向性，在饑餓和NaCl 這2 種條件的刺激下，線蟲會避開NaCl。NaCl趨向性分析實驗裝置是含有NGM 培養(yǎng)基的直徑6 cm 的普通培養(yǎng)皿，也稱為趨向性檢測皿。每組隨機抽取50 只線蟲，用M9 緩沖液洗凈后，將其移至不含食物的新鮮馴化皿或模擬條件馴化皿上，在20 ℃下進行4 h 的馴化，然后將其洗脫移至檢測皿中。取含100 mmol/L NaCl 的圓柱狀瓊脂塊，移至檢測皿上A 點，在培養(yǎng)基上產(chǎn)生連續(xù)的NaCl梯度。14 ～24 h 后移走該瓊脂塊，在A 點加入1 μL 0.5 mol/L NaN3。將檢測皿放置在20 ℃條件下，讓線蟲自行活動30 min，最終求出趨向指數(shù)（CI），公式為CI ＝ （NANB） /（NAll－NC），NA表示A 區(qū)，NB表示B 區(qū)，NC表示C 區(qū)，NAll表示檢測皿中所有線蟲數(shù)目，線蟲化學趨向性檢測皿示意圖見圖1。實驗平行重復3 次。

圖1 線蟲化學趨向性檢測皿示意圖

2.4 Western blot 法檢測線蟲體內(nèi)p-AMPK、SIRT1 蛋白表達 嚴格按照蛋白提取試劑盒說明提取線蟲蛋白，BCA 法檢測蛋白濃度。各組蛋白上樣量均為25 μg，進行SDSPAGE 凝膠電泳，然后將其轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，加5% 脫脂奶粉溶液在室溫下封閉1.5 h，加SIRT1、p-AMPK、βactin 抗體（1 ∶1 500），于4 ℃下孵育過夜，TBST 清洗3次，每次10 min，加二抗（1 ∶5 000） 室溫孵育1.5 h，TBST 清洗3 次，每次10 min，滴加發(fā)光液，顯影、成像，采用凝膠成像系統(tǒng)拍照，分析目的蛋白相對表達。

2.5 RT-qPCR 法檢測線蟲體內(nèi)paqr-1、aak-1、sir-2.1 mRNA 表達 取同步化至L4 期的線蟲，M9 緩沖液洗2 次，TRIzol 法提取總RNA，然后使用Fast King RT Kit （With gDNase） 將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用Super Real Pre Mix Plus （SYBY Green） 實時熒光定量PCR 試劑盒檢測paqr-1、aak-1、sir-2.1 mRNA 表達。引物應用核酸系列保守區(qū)內(nèi)設計，引物長度20～22 bp，G＋C 含量45% ～55%，堿基隨機分布，引物利用NCBI 軟件設計，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列見表1。

表1 引物序列

2.6 統(tǒng)計學分析 通過SPSS 21.0 軟件進行處理，數(shù)據(jù)以（±s） 表示，組間比較采用單因素方差分析，進一步比較采用LSD 和SNK 檢驗。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 六味地黃丸提取物對AD 模型線蟲化學趨向性的影響 如圖2 所示，在缺乏食物和暴露于NaCl 的條件下（＋NaCl； -E.coli），與空白組比較，模型組線蟲對NaCl 的趨向性升高（P＜0.01），學習記憶行為受到抑制； 與模型組比較，陽性藥組和六味地黃丸中、高劑量組線蟲NaCl 的趨向性降低（P＜0.01），聯(lián)想性學習行為得到修復。而在缺乏食物和NaCl 的條件下（-NaCl； -E.coli），與空白組比較，模型組線蟲對NaCl 的趨向性降低（P＜0.01），學習記憶行為受到抑制； 與模型組比較，陽性藥組和六味地黃丸中、高劑量組線蟲對NaCl 的趨向性升高 （P＜0.05，P＜0.01），學習記憶行為得到修復。

圖2 六味地黃丸提取物對AD 模型線蟲化學趨向性的影響（±s，n＝50）

3.2 六味地黃丸提取物對AD 模型線蟲AMPK、SIRT1 蛋白表達的影響 如圖3 所示，與空白組比較，模型組p-AMPK 和SIRT1 蛋白表達降低（P＜0.01）； 與模型組比較，陽性藥組和六味地黃丸中、高劑量組p-AMPK 與SIRT1 蛋白表達升高（P＜0.01）。

圖3 六味地黃丸提取物對AD 模型線蟲p-AMPK、SIRT1 蛋白表達的影響（±s，n＝3）

3.3 六味地黃丸提取物對AD 模型線蟲aak-1、sir-2.1 和paqr-1 mRNA 表達的影響 如圖4 所示，與空白組比較，模型組aak-1、sir-2.1、paqr-1 mRNA 表達降低（P＜0.01）； 與模型組比較，陽性藥組和六味地黃丸中、高劑量組aak-1、sir-2.1、paqr-1 mRNA 表達升高（P＜0.01）。

圖4 六味地黃丸提取物對AD 模型線蟲aak-1、sir-2.1、paqr-1 mRNA 表達的影響（±s，n＝3）

4 討論

AD 患者常出現(xiàn)記憶減退，本研究以轉(zhuǎn)染人源Aβ 基因的秀麗隱桿線蟲為AD 模型［9］，通過化學趨向性實驗考察線蟲學習記憶能力，發(fā)現(xiàn)AD 模型線蟲出現(xiàn)聯(lián)想學習記憶能力障礙，而六味地黃丸能夠改善癥狀。在明確六味地黃丸能夠有效改善記憶障礙的前提下，本實驗深入研究其抗AD 作用機制。

線粒體功能障礙是AD 發(fā)病機制的早期事件，線粒體在延緩衰老和預防神經(jīng)退行性疾病方面發(fā)揮著重要作用［10］。有研究表明，線粒體功能障礙和能量代謝缺陷是在人類AD 中持續(xù)存在的特征。在AD 大腦中可觀察到能量產(chǎn)生減少、耗氧量降低、復合體Ⅰ和Ⅳ活性下降。在AD 轉(zhuǎn)基因小鼠和過量表達Aβ 的線蟲等模型生物中也觀察到類似的代謝變化［11-12］。脂聯(lián)素（adiponectin，APN） 是一種能夠發(fā)揮神經(jīng)保護、調(diào)節(jié)能量代謝的脂肪因子，其表達情況與線粒體功能相關［13］。脂聯(lián)素受體1 （adiponectin receptor 1，AdipoR1） 作為APN 重要受體之一［14］，在神經(jīng)元的細胞膜上廣泛表達［15］。AdipoR1 可以激活AMPK，調(diào)節(jié)能量代謝［16］，也可以激活SIRT1，誘導過氧化物酶體增殖物激活受體γ 輔助活化因子-1α （PGC-1α） 去乙?；?7］，發(fā)揮調(diào)節(jié)能量代謝的作用。本實驗結(jié)果顯示，六味地黃丸提取物能夠上調(diào)AD 模型線蟲AdipoR1 基因表達，可能是通過提高脂聯(lián)素受體表達進而激活下游途徑相關分子表達生物活性，發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

腺苷酸活化蛋白激酶 （AMP-activatedproteinkinase，AMPK） 是APN 信號的主要下游組成部分，可感知細胞的ATP 水平變化［18］。在低能量條件下，AMPK 通過磷酸化特定的酶與生長控制節(jié)點來增加ATP 的生成和減少ATP 的消耗。AMPK 能調(diào)節(jié)細胞內(nèi)線粒體網(wǎng)絡的形狀，刺激線粒體生物發(fā)生來控制線粒體數(shù)量，以及通過調(diào)節(jié)自噬和有絲分裂來控制線粒體質(zhì)量［19］。在AD 中，AMPK 可以通過調(diào)節(jié)β 和γ 分泌酶的表達以減少Aβ 的沉積，從而改善癡呆癥狀和異常的大腦能量代謝［20］。

沉默信息調(diào)節(jié)因子 1 （ silentinformationregulator1，SIRT1） 存在于細胞核和細胞質(zhì)中。SIRT1 能增加線粒體生物發(fā)生、降低氧化應激［21］，并且可以通過對PGC-1α 的去乙?；瘉硪种芇PARγ 表達，調(diào)節(jié)體內(nèi)重要臟器的能量代謝［22］。AMPK 與SIRT1 在細胞穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)中關系緊密，AMPK 通過增加細胞NAD＋水平來增強SIRT1 活性，從而實現(xiàn)下游SIRT1 靶標的脫乙?；驼{(diào)節(jié)［23］。由本實驗結(jié)果可知，六味地黃丸組p-AMPK、SIRT1 蛋白和mRNA 表達均升高，提示六味地黃丸提取物在激活AD 模型線蟲AdipoR1 后進一步激活了下游的AMPK 和SIRT1 通路，發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)六味地黃丸提取物可通過增強AD 模型線蟲AdipoR1 表達，激活AMPK/SIRT1 信號通路調(diào)節(jié)能量代謝，改善神經(jīng)元線粒體功能，發(fā)揮神經(jīng)保護作用。以秀麗隱桿線蟲為模式生物研究中藥、中藥復方防治AD具有一定的可行性，特別是從神經(jīng)元能量代謝角度深入挖掘機制。