HPLC 法同時測定舒肝利膽丸中5 種成分的含量

畢映燕，李季文，徐志偉，李俊江

（甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050）

舒肝利膽方由醋柴胡、金錢草、白豆蔻、荊芥、生白芍、郁金、天花粉、麩炒枳殼、紫蘇子、白芥子、炙甘草、干姜、大棗等藥味組成，諸藥合用共奏疏肝利膽、清熱祛濕，理氣止痛之功，主要用于慢性膽囊炎的治療。前期為方便患者服用，在保留原物質的基礎上擬將其開發(fā)為舒肝利膽濃縮丸。

現代藥理研究證實，膽囊炎的發(fā)病機理與炎癥反應、代謝紊亂、膽汁滯留等相關［1］。柴胡中柴胡皂苷具有抗炎，促進膽汁酸排泄的作用［2］，為疏肝利膽藥效活性部位。金錢草黃酮類成分具有降低膽汁黏度，促進膽汁流動的作用［3］。紫蘇子水溶性酚酸類成分迷迭香酸具有保肝的藥理活性［4］。甘草中甘草苷、枳殼中橙皮苷通過發(fā)揮保肝、抗炎、調節(jié)代謝等作用［5-9］，達到治療膽囊炎目的。該方在我院以協定處方應用多年，但尚無舒肝利膽方及其制劑的質量控制報道，也未見同時測定柴胡皂苷a、槲皮素、迷迭香酸、橙皮苷、甘草苷含量的研究。因此，本實驗建立HPLC 法同時測定上述5 種有效成分的含量，為全面控制舒肝利膽丸質量提供參考。

1 材料

1.1 儀器 PEA10 型高效液相色譜儀（美國珀金埃爾默儀器公司）； HS6150 數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）； LX 系列電子分析天平（瑞士普利賽斯公司）；HWS26 型電熱恒溫水浴鍋（鄭州長城科工貿有限公司）。

1.2 試劑與藥物 舒肝利膽丸 （中試產品，批號20210701、20210802、20210803） 為甘肅省中醫(yī)院自制。甘草苷（批號111610-201607，純度98%）、橙皮苷（批號110721-201818，純度98%）、迷迭香酸 （批號111871-201706，純度98%）、槲皮素（批號100081-201610，純度98%）、柴胡皂苷a （批號20736-09-8，純度98%） 對照品均購自中國食品藥品檢定研究院。甲醇、乙腈（色譜純，山東禹王集團化工分公司）； 甲醇（分析純，天津市博迪化工有限公司）； 磷酸（色譜純，天津大茂化學試劑廠）；水為實驗室自制。

2 方法與結果

2.1 溶液制備

2.1.1 對照品溶液 精密稱取對照品甘草苷21.60 mg、橙皮苷20.50 mg、迷迭香酸41.20 mg、槲皮素0.80 mg、柴胡皂苷a 21.20 mg，置于10 mL 量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻，得質量濃度分別為甘草苷2.16 mg/mL、橙皮苷2.05 mg/mL、迷迭香酸4.12 mg/mL、槲皮素0.08 mg/mL、柴胡皂苷a 2.12 mg/mL 的溶液，即得，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.2 供試品溶液制備 將舒肝利膽丸置于研缽中，研成細粉狀，取2.0 g，加甲醇20 mL，稱定質量，超聲（300 W、40 kHz） 提取40 min，室溫下放置20 min，甲醇補足減失的質量，搖勻，0.45 μm 濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得［10］。

2.1.3 陰性樣品溶液制備 按處方配比和生產工藝，分別制備缺醋柴胡、缺金錢草、缺枳殼、缺紫蘇子、缺甘草的陰性樣品，按“2.1.2” 項下方法制備，即得。

2.2 色譜條件 Waters Symmetry Shield 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）； 流動相乙腈（A） -0.1% 磷酸（B），梯度洗脫（0～12 min，17% A； 12 ～18 min，17% ～22% A；18～24 min，22% ～30%A； 24～32 min，30% ～38%A； 32 ～45 min，38% ～80%A； 45～55 min，80% ～17%A）； 體積流量1.0 mL/min； 柱溫20 ℃； 檢測波長0 ～18 min 237 nm（甘草苷），18 ～24 min 283 nm （橙皮苷），24 ～28 min 330 nm （迷迭香酸），28 ～35 min 368 nm （槲皮素），35 ～55 min 210 nm （柴胡皂苷a）； 進樣量10 μL［11-13］。

2.3 系統適用性考察和專屬性試驗 精密吸取對照品、供試品、陰性樣品溶液適量，在“2.2” 項色譜條件下進樣測定。結果，供試品溶液中甘草苷、橙皮苷、迷迭香酸、槲皮素、柴胡皂苷a 保留時間與對照品溶液中一致，與相鄰色譜峰分離度大于1.5，陰性無干擾，理論塔板數以甘草苷計不低于4 000，見圖1。

圖1 各成分HPLC 色譜圖

2.4 線性關系考察 精密吸取“2.1.1” 項下對照品適量，甲醇逐級稀釋成系列質量濃度，在“2.2” 項色譜條件下進樣測定。以對照品峰面積（Y） 對其質量濃度（X） 進行回歸，結果見表1，可知各成分在各自范圍內線性關系良好。

表1 各成分線性關系

2.5 精密度試驗 取對照品溶液適量，在“2.2” 項色譜條件下進樣測定6 次，測得甘草苷、橙皮苷、迷迭香酸、槲皮素、柴胡皂苷a 峰面積RSD 分別為1.02%、0.85%、0.62%、0.93%、1.16%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液（批號20210701） 適量，于0、4、8、12、18、24 h 在“2.2” 項色譜條件下進樣測定，測得甘草苷、橙皮苷、迷迭香酸、槲皮素、柴胡皂苷a峰面積 RSD 分別為1.85%、0.95%、1.17%、0.93%、1.16%，表明溶液在24 h 內穩(wěn)定性良好［14］。

2.7 重復性試驗 取本品 （批號20210701） 適量，按“2.1.2” 項下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.2” 項色譜條件下進樣測定，測得甘草苷、橙皮苷、迷迭香酸、槲皮素、柴胡皂苷a 峰面積RSD 分別為1.73%、1.25%、1.17%、1.81%、1.44%，表明該方法重復性良好［13-15］。

2.8 加樣回收率試驗 精密稱取本品（批號20210701）1.0 g，精密加入對照品溶液（未稀釋） 適量，按“2.1.2”項下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.2” 項色譜條件下進樣測定，計算回收率。結果，甘草苷、橙皮苷、迷迭香酸、槲皮素、柴胡皂苷a 的平均加樣回收率分別為100.42%，99.94%，100.54%，102.22%，98.41%，RSD分別為2.59%、1.78%、2.11%、2.81%、2.62%。

2.9 樣品測定 取3 批樣品，按“2.1.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.2” 項色譜條件下進樣測定，計算含量，結果見表2。

表2 各成分含量測定結果（mg/g，n＝3）

3 討論

3.1 檢測波長選擇 采用A10 PAD 檢測器，對甘草苷、橙皮苷、迷迭香酸、槲皮素、柴胡皂苷a 進行波長掃描，發(fā)現最大吸收波長分別為237、283、330、368、210 nm。比較不同波長下色譜圖，發(fā)現雜質對所測成分的干擾較少，并且較易檢出。為提高分離度，結合所測成分出峰時間，確定波長切換方式為0 ～18 min 237 nm （甘草苷），18 ～24 min 283 nm （橙皮苷），24 ～28 min 330 nm （迷迭香酸），28～35 min 368 nm （槲皮素），35～55 min 210 nm （柴胡皂苷a）［16-17］。

3.2 流動相、色譜柱選擇 本實驗考察了甲醇、乙腈分別與不同體積分數的磷酸、甲酸、醋酸溶液組成的流動相，發(fā)現乙腈作為有機相時基線較平穩(wěn)，進一步篩選乙腈與不同濃度磷酸、甲酸、醋酸組成的流動相，發(fā)現迷迭香酸在磷酸系統下峰對稱性優(yōu)于甲酸、醋酸系統，因此選擇乙腈-0.1%磷酸作為流動相，并分別比較Agilent C18、Waters C18、Kromasil C18色譜柱，發(fā)現3 種色譜柱均可用于含量測定［18-24］。

3.3 提取方法選擇 本實驗考察了回流，超聲，浸漬提取方式對5 種有效成分提取率的影響，發(fā)現浸漬提取方式提取率低、耗時長，回流、超聲提取對5 種成分提取率影響較小，但后者操作簡便，故選用超聲提取［25-27］。分別比較超聲提取20、40、60 min 對5 種成分的影響，發(fā)現40、60 min 對提取率影響不大，因此選擇40 min 作為提取時間。

4 結論

本實驗建立HPLC 法同時測定甘草苷、橙皮苷、迷迭香酸、槲皮素、柴胡皂苷a 的含量，該方法操作簡單、重復性好，可用于舒肝利膽丸的質量控制，同時也為其他醫(yī)院制劑質量控制提升提供參考。