金雀異黃素通過(guò)調(diào)控TGF-β1/Smad3 信號(hào)通路對(duì)2 型糖尿病大鼠心肌纖維化的影響

姜 欣，王 智，王 娟

（1.北華大學(xué)附屬醫(yī)院心血管科，吉林 吉林 132001； 2.吉林市中心醫(yī)院婦科，吉林 吉林 132001）

糖尿病心肌病是導(dǎo)致糖尿病患者心源性休克、心力衰竭甚至死亡的主要因素，是糖尿病最常見(jiàn)的并發(fā)癥之一［1-2］。糖尿病心肌病發(fā)病因素眾多，機(jī)制復(fù)雜，目前并沒(méi)有闡明確切的機(jī)制，但心肌纖維化在糖尿病心肌病發(fā)病進(jìn)程中起著關(guān)鍵作用，同時(shí)也是引起糖尿病患者心功能降低的主要因素［3］。抑制心肌纖維化對(duì)于防治糖尿病心肌病具有深遠(yuǎn)意義。

金雀異黃素是大豆異黃酮類(lèi)化合物，又稱(chēng)染料木黃酮或染料木素，具有抗炎、抗氧化、抗癌、治療骨質(zhì)疏松及提高免疫力等多種作用［4-5］。文獻(xiàn)報(bào)道金雀異黃素可以通過(guò)降低Aβ 蛋白沉積和Tau 蛋白的磷酸化水平，增加神經(jīng)生長(zhǎng)因子和營(yíng)養(yǎng)因子表達(dá)，改善糖尿病小鼠記憶功能障礙［6］； 可以提高腎皮質(zhì)基質(zhì)金屬蛋白酶-2/基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1 比值，降低非肌肉型肌球蛋白重鏈表達(dá)，延緩糖尿病腎病進(jìn)展［7］； 可逆轉(zhuǎn)糖尿病的氧化應(yīng)激和炎癥，緩解血管功能障礙［8］。但目前為止，金雀異黃素對(duì)糖尿病大鼠心肌纖維化的抑制作用及機(jī)制研究鮮有報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立大鼠2 型糖尿病 （type 2 diabetes mellitus，T2DM） 模型，旨在探討金雀異黃素對(duì)糖尿病大鼠心肌纖維化的影響，并闡明潛在的作用機(jī)制，從而為糖尿病心肌病的防治提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物及飼料 雄性SD 大鼠60 只，SPF 級(jí)，體質(zhì)量180～220 g，購(gòu)自長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司 ［實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（吉） 2020-0002］，飼養(yǎng)于吉林醫(yī)藥學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心［實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK （吉） 2022-0003］，分籠飼養(yǎng)（5 只/籠），明暗各12 h，相對(duì)濕度50% ～60%，室溫23～25 ℃。本研究經(jīng)北華大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理號(hào)2021021601），符合動(dòng)物倫理相關(guān)規(guī)定。高脂飼料由基礎(chǔ)飼料、膽酸鈉、蛋黃粉、豬油及膽固醇構(gòu)成，各成分比例分別為83.5%、0.5%、5%、10% 及1%，由斯貝福（北京） 生物技術(shù)有限公司提供。

1.2 藥物與試劑 金雀異黃素（貨號(hào)YYI-023，含量98%） 購(gòu)自陜西永源生物技術(shù)有限公司； 二甲雙胍（國(guó)藥準(zhǔn)字H20023370，規(guī)格0.5 g/片） 購(gòu)自中美上海施貴寶制藥有限公司。鏈脲菌素（streptozotocin，STZ，貨號(hào)18883-66-4） 購(gòu)自美國(guó)Merck 公司； 肌酸激酶同工酶 （creatine kinase isoenzyme，CK-MB，貨號(hào)H197-1-2）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 （aspartate aminotransferase，AST，貨號(hào)C010-2-1） 及乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH，貨號(hào)A020-2-2） 酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA） 試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所； Masson 染色試劑盒（貨號(hào)R21866-7） 購(gòu)自上海尚寶生物科技有限公司； TRIzol （貨號(hào)15596026）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號(hào)K1691） 及qPCR 試劑盒（貨號(hào)A44360） 購(gòu)自美國(guó) Thermo Fisher Scientific 公司； Ⅰ型膠原（Collagen Ⅰ，貨號(hào)ab21286）、Ⅲ型膠原（CollagenⅢ，貨號(hào)ab7778）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1 （transforming growth factor-β1，TGF-β1，貨號(hào)ab92486） 及Smad同源物3 （smad homolog 3，Smad3，貨號(hào)ab84177）多克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)Abcam 公司； 甘油醛-3-磷酸脫氫酶 （glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH，貨號(hào)TA-08） 及IgG 二抗（貨號(hào)10494-1-AP） 均購(gòu)自北京中杉金橋生物科技有限公司；DAB 顯色試劑盒（貨號(hào)DA10155）、增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑盒（enhanced chemiluminescence，ECL，貨號(hào)SW20305） 均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 儀器 ZA600R3 型分析天平（上海贊維衡器有限公司）； OneTouch Ⅱ型血糖儀（美國(guó)Johnson＆ Johnson 公司）； Vevo 3100LT 型小動(dòng)物超聲儀（美國(guó) FUJIFILM Visualsonics 公司）； SuPerMax 3100 型酶標(biāo)儀（上海閃譜生物科技有限公司）；RM2245 型切片機(jī)（德國(guó)Leica 公司）； 4XC20BD型光學(xué)顯微鏡（上海光學(xué)儀器廠(chǎng)）； 7500 型qPCR儀（美國(guó)ABI 公司）； DYCZMINI4 型電泳設(shè)備、DYCZ-TRANS2 型轉(zhuǎn)印設(shè)備（北京六一生物科技有限公司）。

2 方法

2.1 模型建立、分組與給藥 參照高振華等［9］的方法建立T2DM 大鼠模型。將SD 大鼠飼養(yǎng)1 周后，按照體質(zhì)量隨機(jī)分為正常組（10 只） 及高脂組（50 只），正常組大鼠給予基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，高脂組大鼠給予高脂飼料喂養(yǎng)。4 周后，各組大鼠均禁食12 h，高脂組大鼠腹腔注射35 mg/kg STZ 溶液（用pH 4.5 的檸檬酸鈉緩沖液溶解），正常組大鼠腹腔注射等體積檸檬酸鈉緩沖液。1 周后，測(cè)量空腹血糖值，空腹血糖值≥16.7 mmo/L 認(rèn)為模型建立成功。共有42 只大鼠符合成模標(biāo)準(zhǔn)，將空腹血糖值最高和最低的大鼠各1 只排除，剩余40 只。成模大鼠隨機(jī)分為模型組、二甲雙胍組 （100 mg/kg） 及金雀異黃素低、高劑量組 （50、100 mg/kg），每組10 只，其中金雀異黃素給藥劑量參考楊琪等［10］的研究并結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果而設(shè)定，二甲雙胍給藥劑量參考林心君等［11］的研究。給藥組每天灌胃給藥1 次，連續(xù)8 周； 正常組及模型組大鼠灌胃溶媒（0.5% 羧甲基纖維素鈉），灌胃體積均為10 mL/kg。

2.2 體質(zhì)量、心功能、心臟質(zhì)量及心臟指數(shù)等指標(biāo)檢測(cè) 末次灌胃給藥24 h 后，稱(chēng)定大鼠體質(zhì)量。利用動(dòng)物超聲儀檢測(cè)每搏輸出量（stroke volume，SV）、射血分?jǐn)?shù)（ejection fraction，EF）、左心室收縮末期內(nèi)徑（left ventricular internal diameter endsystole，LVIDs） 及左心室舒張末期內(nèi)徑 （left ventricular internal diameter end-diastole，LVIDd） 等心功能指標(biāo)。用戊巴比妥鈉麻醉大鼠，通過(guò)腹主動(dòng)脈取血，離心分離血清。迅速剖取心臟，反復(fù)清洗至無(wú)血液，擦干水分后稱(chēng)定心臟質(zhì)量，用心臟質(zhì)量與體質(zhì)量之比計(jì)算心臟指數(shù)。血清及心臟均保存于超低溫（－80 ℃） 冰箱。

2.3 血清CK-MB、AST 及LDH 活性檢測(cè) 采用ELISA 法檢測(cè)血清CK-MB、AST 及LDH 活性，相關(guān)操作步驟嚴(yán)格按照大鼠CK-MB、AST 及LDH 活性檢測(cè)試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2.4 心肌纖維化程度觀(guān)察 心肌組織經(jīng)常規(guī)固定、脫水、包埋及切片等步驟，根據(jù)Masson 染色試劑盒的操作指南進(jìn)行處理。于光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察，其中呈藍(lán)色的為膠原纖維，肌纖維呈紅色，并通過(guò)Image-Pro Plus 6.0 軟件分析心肌組織膠原相對(duì)面積。

2.5 心肌組織Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ蛋白分布及表達(dá)檢測(cè) 心肌組織經(jīng)常規(guī)固定、脫水、包埋及切片等步驟，于枸櫞酸緩沖液中進(jìn)行微波修復(fù)。在室溫下用3% H2O2孵育30 min，再用5%山羊血清封閉30 min，分別加入稀釋至合適比例的CollagenⅠ（1 ∶ 5 000） 和Collagen Ⅲ（1 ∶5 000） 多克隆抗體，在4 ℃環(huán)境下孵育過(guò)夜。再加入二抗（1 ∶5 000），在37 ℃環(huán)境下孵育30 min； 滴加ABC 工作液，在37 ℃環(huán)境下繼續(xù)孵育60 min。DAB 顯色后再用蘇木素復(fù)染，二甲苯透明后，進(jìn)行脫水處理，封片。通過(guò)Image-Pro Plus 6.0 軟件分析積分吸光度。

2.6 心肌組織TGF-β1、Smad3 mRNA 表達(dá)檢測(cè) 心肌組織總RNA 采用TRIzol 試劑提取，隨后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，獲得cDNA 模板。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，行PCR 擴(kuò)增反應(yīng)，所需引物由吉林省庫(kù)美生物科技有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1。通過(guò)2－ΔΔCT方法計(jì)算TGF-β1 及Smad3 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

2.7 心肌組織TGF-β1、Smad3 蛋白表達(dá)檢測(cè) 將組織裂解液預(yù)冷，每100 mg 心肌組織加入1 mL 組織裂解液，放入超聲破碎儀中，勻漿后離心收集上清，用二喹啉甲酸法測(cè)定蛋白含量。制備的上清液與5×上樣緩沖液混合后，于水浴鍋中煮沸10 min使蛋白變性。取10 μg 蛋白上樣，行10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，半干法轉(zhuǎn)蛋白至聚偏二氟乙烯膜，用5% 脫脂奶粉溶液在室溫下封閉1 h。洗膜后，加入稀釋至合適比例的TGF-β1（1 ∶1 000）、Smad3 （1 ∶1 000） 及GAPDH （1 ∶2 500） 多克隆抗體，在4 ℃下孵育過(guò)夜。洗膜后，再加入二抗（1 ∶5 000），在室溫下孵育30 min。再次洗膜，滴加ECL 液顯色，曝光后拍照，通過(guò)Image J 1.8 軟件分析目的蛋白TGF-β1 及Smad3 相對(duì)表達(dá)量。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過(guò)SPSS 22.0 軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料以（±s） 表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 金雀異黃素對(duì)糖尿病大鼠體質(zhì)量、心臟質(zhì)量及心臟指數(shù)的影響 正常組大鼠反應(yīng)靈敏，毛發(fā)光澤，飲水、飲食及尿量均正常； 模型組大鼠活動(dòng)減少，毛發(fā)干枯發(fā)黃，飲水、飲食及尿量均增多；各給藥組大鼠上述糖尿病癥狀均有不同程度的緩解。如表2 所示，給藥8 周后，與正常組比較，模型組大鼠體質(zhì)量降低（P＜0.01），心臟質(zhì)量無(wú)明顯變化 （P＞0.05），心臟指數(shù)增加 （P＜0.01）； 與模型組比較，金雀異黃素各劑量組及二甲雙胍組大鼠體質(zhì)量增加（P＜0.01），心臟質(zhì)量無(wú)明顯變化（P＞0.05），心臟指數(shù)降低 （P＜0.05，P＜0.01）。

表2 金雀異黃素對(duì)糖尿病大鼠體質(zhì)量、心臟質(zhì)量及心臟指數(shù)的影響（±s，n＝10）Tab.2 Effects of genistein on weight of the body and heart，and cardiac indices levels in diabetic rats （±s，n＝10）

表2 金雀異黃素對(duì)糖尿病大鼠體質(zhì)量、心臟質(zhì)量及心臟指數(shù)的影響（±s，n＝10）Tab.2 Effects of genistein on weight of the body and heart，and cardiac indices levels in diabetic rats （±s，n＝10）

注： 與正常組比較，??P＜0.01； 與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

組別劑量/（mg·kg－1）體質(zhì)量/g心臟質(zhì)量/g心臟指數(shù)/%正常組—682.86±49.351.65±0.200.241±0.031模型組—399.32±50.46??1.54±0.130.386±0.045??金雀異黃素低劑量組50438.56±63.71＃＃1.50±0.090.342±0.039＃金雀異黃素高劑量組100552.94±45.54＃＃1.52±0.120.275±0.024＃＃二甲雙胍組100564.30±58.28＃＃1.57±0.160.278±0.033＃＃

3.2 金雀異黃素對(duì)糖尿病大鼠心功能的影響 如表3 所示，與正常組比較，模型組大鼠SV、EF 降低（P＜0.01），LVIDs、LVIDd 升高（P＜0.05，P＜0.01）； 與模型組比較，金雀異黃素高劑量組及二甲雙胍組大鼠SV、EF 升高（P＜0.01），LVIDs、LVIDd 降低（P＜0.05，P＜0.01），金雀異黃素低劑量組大鼠SV、EF 升高（P＜0.01），LVIDs 降低（P＜0.05），LVIDd 無(wú)明顯變化（P＞0.05）。

表3 金雀異黃素對(duì)糖尿病大鼠心功能的影響（±s，n＝10）Tab.3 Effects of genistein on cardiac function of diabetic rats （±s，n＝10）

表3 金雀異黃素對(duì)糖尿病大鼠心功能的影響（±s，n＝10）Tab.3 Effects of genistein on cardiac function of diabetic rats （±s，n＝10）

注： 與正常組比較，?P＜0.05，??P＜0.01； 與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

組別劑量/（mg·kg－1）SV/μLEF/%LVIDs/mmLVIDd/mm正常組—185.10±19.2472.68±8.433.81±0.436.82±0.64模型組—83.61±11.76??45.53±5.27??5.92±0.51??7.56±0.82?金雀異黃素低劑量組50101.33±9.80＃＃52.85±5.66＃＃5.28±0.65＃7.24±0.67金雀異黃素高劑量組100125.79±10.47＃＃59.76±7.19＃＃4.73±0.38＃＃6.70±0.73＃二甲雙胍組100109.32±12.51＃＃61.09±6.38＃＃5.12±0.54＃＃6.75±0.59＃

3.3 金雀異黃素對(duì)糖尿病大鼠血清CK-MB、AST及LDH 活性的影響 如表4 所示，與正常組比較，模型組大鼠血清CK-MB、AST 及LDH 活性均升高（P＜0.01）； 與模型組比較，金雀異黃素各劑量組及二甲雙胍組大鼠血清CK-MB、AST 及LDH 活性均降低（P＜0.05，P＜0.01）。

表4 金雀異黃素對(duì)糖尿病大鼠血清CK-MB、AST 及LDH 活性的影響（±s，n＝10）Tab.4 Effects of genistein on serum levels of CK-MB，AST and LDH activities in diabetic rats （±s，n＝10）

表4 金雀異黃素對(duì)糖尿病大鼠血清CK-MB、AST 及LDH 活性的影響（±s，n＝10）Tab.4 Effects of genistein on serum levels of CK-MB，AST and LDH activities in diabetic rats （±s，n＝10）

注： 與正常組比較，??P＜0.01； 與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

組別劑量/（mg·kg－1）CK-MB/（U·L－1）AST/（U·L－1）LDH/（U·L－1）正常組—619.84±72.4393.48±7.2635.60±4.07模型組—846.65±97.54??169.56±18.67??59.78±6.32??金雀異黃素低劑量組50764.03±68.91＃142.64±12.80＃42.54±5.86＃＃金雀異黃素高劑量組100720.47±83.66＃＃131.22±15.14＃＃33.19±4.36＃＃二甲雙胍組100651.71±51.34＃＃117.09±10.38＃＃35.20±3.15＃＃

3.4 金雀異黃素對(duì)糖尿病大鼠心肌纖維化的影響 如圖1 所示，正常組大鼠心肌細(xì)胞整齊排列，形態(tài)正常，心肌間質(zhì)幾乎無(wú)膠原纖維分布； 模型組大鼠心肌細(xì)胞紊亂排列，心肌細(xì)胞肥大，部分細(xì)胞溶解、腫脹、變形，心肌間質(zhì)可見(jiàn)膠原纖維大量沉積； 金雀異黃素各劑量組及二甲雙胍組大鼠心肌細(xì)胞排列紊亂的現(xiàn)象有不同程度的改善，結(jié)構(gòu)形態(tài)較正常，心肌間質(zhì)膠原纖維沉積情況有所緩解，尤其是金雀異黃素高劑量組及二甲雙胍組更為明顯。通過(guò)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)一步分析心肌組織膠原相對(duì)面積，結(jié)果見(jiàn)表5，與正常組比較，模型組大鼠心肌組織膠原相對(duì)面積增加（P＜0.01）； 與模型組比較，金雀異黃素各劑量組及二甲雙胍組大鼠心肌組織膠原相對(duì)面積減少（P＜0.01）。

圖1 金雀異黃素對(duì)糖尿病大鼠心肌纖維化的影響（Masson，×200）Fig.1 Effects of genistein on myocardial fibrosis in diabetic rats （Masson，×200）

表5 金雀異黃素對(duì)糖尿病大鼠心肌組織膠原相對(duì)面積的影響（±s，n＝6）Tab.5 Effects of genistein on relative collagen deposition area in myocardial tissue of diabetic rats （±s，n＝6）

表5 金雀異黃素對(duì)糖尿病大鼠心肌組織膠原相對(duì)面積的影響（±s，n＝6）Tab.5 Effects of genistein on relative collagen deposition area in myocardial tissue of diabetic rats （±s，n＝6）

注： 與正常組比較，??P＜0.01； 與模型組比較，＃＃P＜0.01。

組別劑量/（mg·kg－1）膠原相對(duì)面積/%正常組—2.20±0.37模型組—9.45±1.24??金雀異黃素低劑量組505.86±0.89＃＃金雀異黃素高劑量組1003.21±0.55＃＃二甲雙胍組1003.67±0.61＃＃

3.5 金雀異黃素對(duì)糖尿病大鼠心肌組織CollagenⅠ和Collagen Ⅲ蛋白表達(dá)的影響 如圖2、表6 所示，正常組大鼠心肌組織Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ蛋白均呈弱陽(yáng)性表達(dá)，在心肌組織中微量存在； 與正常組比較，模型組大鼠心肌組織Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ蛋白表達(dá)均升高（P＜0.01）； 與模型組比較，金雀異黃素各劑量組及二甲雙胍組大鼠心肌組織Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ蛋白表達(dá)均降低（P＜0.05，P＜0.01）。

圖2 金雀異黃素對(duì)糖尿病大鼠心肌組織Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ蛋白表達(dá)的影響（免疫組化，×200）Fig.2 Effects of genistein on protein expressions of Collagen Ⅰand Collagen Ⅲin myocardial tissue of diabetic rats （IHC，×200）

表6 金雀異黃素對(duì)糖尿病大鼠心肌組織Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ蛋白積分吸光度的影響（±s，n＝6）Tab.6 Effects of genistein on integrated absorbance of Collagen Ⅰand Collagen Ⅲin myocardial tissue of diabetic rats （±s，n＝6）

表6 金雀異黃素對(duì)糖尿病大鼠心肌組織Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ蛋白積分吸光度的影響（±s，n＝6）Tab.6 Effects of genistein on integrated absorbance of Collagen Ⅰand Collagen Ⅲin myocardial tissue of diabetic rats （±s，n＝6）

注： 與正常組比較，??P ＜0.01； 與模型組比較，＃P ＜0.05，＃＃P＜0.01。

組別劑量/（mg·kg－1） Collagen ⅠCollagen Ⅲ正常組—0.08±0.010.10±0.01模型組—0.21±0.03?? 0.33±0.04??金雀異黃素低劑量組500.17±0.02＃ 0.15±0.02＃＃金雀異黃素高劑量組1000.11±0.01＃＃ 0.13±0.01＃＃二甲雙胍組1000.09±0.01＃＃ 0.12±0.02＃＃

3.6 金雀異黃素對(duì)糖尿病大鼠心肌組織TGF-β1、Smad3 mRNA 表達(dá)的影響 如表7 所示，與正常組比較，模型組大鼠心肌組織TGF-β1、Smad3 mRNA表達(dá)升高（P＜0.01）； 與模型組比較，金雀異黃素各劑量組大鼠心肌組織TGF-β1、Smad3 mRNA 表達(dá)降低（P＜0.01）。

表7 金雀異黃素對(duì)糖尿病大鼠心肌組織TGF-β1、Smad3 mRNA 表達(dá)的影響（±s，n＝3）Tab.7 Effects of genistein on mRNA expressions of TGF-β1 and Smad3 in myocardial tissue of diabetic rats （±s，n＝3）

表7 金雀異黃素對(duì)糖尿病大鼠心肌組織TGF-β1、Smad3 mRNA 表達(dá)的影響（±s，n＝3）Tab.7 Effects of genistein on mRNA expressions of TGF-β1 and Smad3 in myocardial tissue of diabetic rats （±s，n＝3）

注： 與正常組比較，??P＜0.01； 與模型組比較，＃＃P＜0.01。

組別劑量/（mg·kg－1）TGF-β1/GAPDHSmad3/GAPDH正常組—1.02±0.041.05±0.06模型組—2.73±0.32??2.29±0.20??金雀異黃素低劑量組501.68±0.21＃＃1.51±0.18＃＃金雀異黃素高劑量組1001.26±0.17＃＃1.42±0.23＃＃二甲雙胍組1001.54±0.26＃＃1.27±0.14＃＃

3.7 金雀異黃素對(duì)糖尿病大鼠心肌組織TGF-β1、Smad3 蛋白表達(dá)的影響 如圖3、表8 所示，與正常組比較，模型組大鼠心肌組織TGF-β1、Smad3蛋白表達(dá)升高（P＜0.01）； 與模型組比較，金雀異黃素各劑量組及二甲雙胍組大鼠心肌組織TGF-β1、Smad3 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05，P＜0.01）。

圖3 各組大鼠心肌組織TGF-β1、Smad3 蛋白條帶圖Fig.3 Protein bands of TGF-β1 and Smad3 in myocardial tissue of rats in each group

表8 金雀異黃素對(duì)糖尿病大鼠心肌組織TGF-β1、Smad3 蛋白表達(dá)的影響（±s，n＝3）Tab.8 Effects of genistein on protein expressions of TGF-β1 and Smad3 in myocardial tissue of diabetic rats （±s，n＝3）

表8 金雀異黃素對(duì)糖尿病大鼠心肌組織TGF-β1、Smad3 蛋白表達(dá)的影響（±s，n＝3）Tab.8 Effects of genistein on protein expressions of TGF-β1 and Smad3 in myocardial tissue of diabetic rats （±s，n＝3）

注： 與正常組比較，??P＜0.01； 與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

組別劑量/（mg·kg－1）TGF-β1/GAPDHSmad3/GAPDH正常組—0.33±0.050.19±0.03模型組—0.95±0.11??0.87±0.08??金雀異黃素低劑量組500.71±0.09＃0.62±0.04＃＃金雀異黃素高劑量組1000.46±0.05＃＃0.37±0.04＃＃二甲雙胍組1000.53±0.06＃＃0.48±0.05＃＃

4 討論

本研究給予T2DM 模型大鼠金雀異黃素8 周后發(fā)現(xiàn)，金雀異黃素可以增加大鼠體質(zhì)量，減少心臟指數(shù)，升高SV、EF，降低LVIDs、LVIDd，同時(shí)還可降低血清CK-MB、AST 及LDH 活性，證實(shí)了金雀異黃素可以緩解心臟損傷，具有保護(hù)心臟功能的作用。

心肌纖維化是糖尿病性心肌病最典型的病理變化，其主要由膠原纖維含量升高、過(guò)量沉積或膠原成分發(fā)生變化所引起［12］。成纖維細(xì)胞是細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生的重要來(lái)源，在心肌纖維化中起到關(guān)鍵作用，是心肌間質(zhì)纖維化的重要效應(yīng)細(xì)胞［13］。心肌成纖維細(xì)胞合成與分泌膠原纖維的主要類(lèi)型為Collagen I、Collagen Ⅲ、Collagen Ⅳ和Collagen V，其中Collagen I 占80%，Collagen Ⅲ占11%。王振賢等［14］研究發(fā)現(xiàn)，白芍總苷可改善糖尿病大心肌組織鼠病理變化，降低心肌組織Collagen I、Collagen Ⅲ表達(dá)，抑制心肌纖維化。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，金雀異黃素可以降低心肌組織膠原相對(duì)面積及Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ蛋白表達(dá)，具有減輕糖尿病大鼠心肌纖維化作用。

TGF-β1/Smad3 信號(hào)通路在心肌纖維化與合成心肌膠原過(guò)程中起著舉足輕重的作用，目前已成為心肌纖維化研究領(lǐng)域的焦點(diǎn)［15］。TGF-β1 可通過(guò)激活下游Smad3 等經(jīng)典的Smads 途徑，活化心肌成纖維細(xì)胞，促進(jìn)Collagen I 及Collagen Ⅲ的大量分泌，引起心肌纖維化，影響心臟功能［16］。阻斷TGF-β1/Smad3 信號(hào)通路能夠有效抑制心肌成纖維細(xì)胞的增殖與分化，減少Collagen I 及Collagen Ⅲ的合成，從而緩解心肌纖維化癥狀［17］。竹節(jié)參總皂苷能夠使心肌組織中TGF-β1、Smad3 蛋白表達(dá)降低，通過(guò)調(diào)節(jié)TGF-β1/Smad3 信號(hào)通路改善衰老大鼠心肌纖維化程度［18］。本研究發(fā)現(xiàn)，金雀異黃素可以降低TGF-β1、Smad3 mRNA 及蛋白表達(dá)，具有抑制TGF-β1/Smad3 信號(hào)通路的作用，該作用可能是其減輕糖尿病大鼠心肌纖維化，進(jìn)而發(fā)揮保護(hù)心臟效應(yīng)的潛在機(jī)制。金雀異黃素對(duì)TGF-β1/Smad3 信號(hào)通路的影響已在多項(xiàng)研究中被證實(shí)。研究發(fā)現(xiàn)，金雀異黃素可以通過(guò)降低TGF-β1、Smad3 等蛋白的表達(dá)，起到抗糖尿病大鼠腎臟纖維化作用［19］。金雀異黃素也可以通過(guò)TGF-β1/Smad3依賴(lài)性信號(hào)通路緩解雙腎單切高血壓大鼠血管功能障礙和腎臟損傷［20］。

綜上所述，金雀異黃素可以通過(guò)抑制TGFβ1/Smad3 信號(hào)通路，減輕糖尿病大鼠心肌纖維化，進(jìn)而發(fā)揮保護(hù)心臟效應(yīng)。本研究的相關(guān)工作可為糖尿病心肌病提供新的防治靶點(diǎn)，也可為金雀異黃素用于糖尿病心肌病的防治提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。