巴芪柔肝方基準樣品HPLC 特征圖譜建立及其量值傳遞規(guī)律研究

耿賽龍，周 琴，孫水根，李 曼，趙立杰，張繼全?，馮 怡?

（1.上海中醫(yī)藥大學創(chuàng)新中藥研究院，中藥現(xiàn)代制劑技術(shù)教育部工程研究中心，上海 201203； 2.上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院細胞免疫實驗室，上海 201203）

巴芪柔肝方是上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院治療肝纖維化的中藥復方，由巴戟肉、黃芪、地黃、澤蘭、片姜黃、醋青皮6 味中藥組成，功效補腎益氣、活血化瘀，主治脾腎虧虛兼淤血阻絡的慢性肝病纖維化，目前已申請相關專利［1］。如何建立有效的質(zhì)量評價方法，確定合理的制備工藝，保證制劑的質(zhì)量穩(wěn)定，是臨床經(jīng)方走向院內(nèi)制劑或中藥新藥過程中必須面臨的問題［2-3］。在尊重臨床應用實際的基礎上，選擇湯液基準樣品作為實驗對象，以特征/指紋圖譜表征方劑質(zhì)量整體性和個性，通過特征成分在制備過程中的轉(zhuǎn)移變化佐證工藝參數(shù)的合理性，建立一套多維度的評價方式，已逐漸成為制劑質(zhì)量研究的新趨向［4-5］。本實驗建立巴芪柔肝方基準樣品HPLC 特征圖譜，并考察其量值傳遞規(guī)律，以期為該方質(zhì)量評價體系開發(fā)提供參考。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1200/1260 型高效液相色譜儀，配置VWD、ELSD 檢測器，購自美國安捷倫公司；XP205 型電子天平（十萬分之一），購自梅特勒-托利多儀器（上海） 有限公司； FA2104N 型電子天平（萬分之一），購自上海精密科學儀器有限公司； ZNHW 型電熱套，購自鞏義市予華儀器有限責任公司； HSH-6 型水浴鍋，購自常州榮華儀器制造有限公司； R-210 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，購自瑞士步琦公司； PB-10 型酸度計，購自賽多利斯科學儀器（北京） 有限公司。

1.2 試劑與藥物 毛蕊異黃酮葡萄糖苷（批號111920-201907）、橙皮苷（批號110721-202019）、迷迭香酸（批號111871-202007）、柚皮苷（批號110722-202116） 對照品均購自中國食品藥品檢定研究院； 5-羥甲基糠醛（批號PS020460）、莪術(shù)烯醇（批號PU1007） 對照品均購自成都普思生物科技股份有限公司； 橘皮素（批號ST00630120）、蕓香柚皮苷（批號ST05590120）、川橙皮素（批號ST00690120） 對照品均購自上海詩丹德標準技術(shù)服務有限公司。巴戟肉、黃芪、生地黃、片姜黃、澤蘭、醋青皮均收集自藥材市場，經(jīng)上海中醫(yī)藥大學中藥學院生藥教研室倪梁紅副教授鑒定為正品。乙腈、甲醇、甲酸為色譜純，均購自國藥集團化學試劑有限公司； 水為超純水，由實驗室自制。

2 方法與結(jié)果

2.1 基準樣品制備 在前期實驗室提取工藝研究中，分別對加水量、提取次數(shù)、提取時間等因素進行考察，參照臨床使用情況，最終確定制備方法為飲片加10 倍量水提取2 次，每次1.5 h。飲片信息見表1，以隨機數(shù)字表組合成15 批，具體見表2。

表1 飲片信息Tab.1 Information of decoction pieces

表2 飲片組合Tab.2 Combinations of decoction pieces

取巴戟肉、黃芪、地黃、澤蘭各10 g，片姜黃9 g，醋青皮6 g，加550 mL 水煎煮2 次，每次1.5 h，300 目濾網(wǎng)趁熱過濾，合并濾液，冷卻至室溫，減壓濃縮至275 mL，即得。同法制備各單味飲片樣品及其對應陰性樣品。

2.2 HPLC 特征圖譜建立

2.2.1 色譜條件 Shiseido CAPCELL PAK MG C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）； 流動相乙腈-0.2%甲酸，梯度洗脫（0 ～10 min，4%乙腈； 10 ～22 min，4% ～13% 乙腈； 22 ～42 min，13% 乙腈；42 ～45 min，13% ～15%乙腈； 45 ～65 min，15% ～18%乙腈； 65 ～70 min，18% 乙腈； 70 ～85 min，18% ～21% 乙腈； 85 ～90 min，21% ～36% 乙腈；90～95 min，36%乙腈； 95～110 min，36% ～44%乙腈； 110 ～115 min，44% ～48% 乙腈； 115 ～120 min，48% ～50%乙腈）； 體積流量1.0 mL/min； 柱溫30 ℃； 檢測波長260 nm； 進樣量10 μL。

2.2.2 供試品溶液制備 精密吸取基準樣品5 mL至10 mL 量瓶中，超純水稀釋定容至刻度，搖勻，超聲（450 W、40 kHz） 提取5 min 后12 000 r/min離心10 min，取上清液，即得。

2.2.3 對照品溶液制備 精密稱取5-羥甲基糠醛、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、迷迭香酸、川橙皮素、莪術(shù)烯醇、橘皮素對照品適量，甲醇制成質(zhì)量濃度分別為38.01、39.14、159.76、39.64、40.96、81.54、45.42、41.56、200.50 μg/mL 的溶液，即得。

2.2.4 方法學考察

2.2.4.1 精密度試驗 取第13 批基準樣品的供試品溶液適量，在“2.2.1” 項色譜條件下進樣測定6 次，以橙皮苷為參照，測得各特征峰相對保留時間RSD 均小于0.15%，相對峰面積RSD 均小于2.02%，表明儀器精密度良好。

2.2.4.2 重復性試驗 取第13 批基準樣品的供試品溶液6 份，在“2.2.1” 項色譜條件下進樣測定，以橙皮苷為參照，測得各特征峰相對保留時間RSD 均小于0.11%，相對峰面積RSD 均小于2.11%，表明該方法重復性良好。

2.2.4.3 穩(wěn)定性試驗 取第13 批基準樣品的供試品溶液適量，于0、2、4、8、12、24 h 在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定，以橙皮苷為參照，測得各特征峰相對保留時間RSD 均小于0.27%，相對峰面積RSD 均小于2.33%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.5 特征峰歸屬和指認 取15 批基準樣品的供試品溶液適量，在“2.2.1” 項色譜條件下進樣測定，將相關數(shù)據(jù)導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)” （2012 年版） 軟件，以第13 批數(shù)據(jù)為參照，采用平均數(shù)法，設置時間窗為0.5，自動匹配色譜峰，以共有模式色譜為對照測定相似度，結(jié)果見表3，可知均大于0.90，表明所選特征物質(zhì)群在不同批次之間較穩(wěn)定。HPLC 特征圖譜見圖1。

圖1 15 批巴芪柔肝方基準樣品HPLC 特征圖譜Fig.1 HPLC characteristic chromatograms of fifteen batches of Baqi Rougan Decoction reference samples

綜合實際分離情況與文獻［6］ 報道進行目標峰取舍，盡量使所選特征峰能反映藥味特點，最終通過對照品比對在16 個特征峰中指認出9 個，見圖2。再通過比對全方、單味藥（圖3）、陰性樣品（圖4） HPLC 特征圖譜來進行歸屬，發(fā)現(xiàn)峰1歸屬于巴戟肉，峰2 （5-羥甲基糠醛） 為地黃、巴戟肉共有特征峰，峰12、5 （毛蕊異黃酮葡萄糖苷） 歸屬于黃芪，峰6、11 （迷迭香酸） 歸屬于澤蘭，峰4、8、15 （莪術(shù)烯醇） 歸屬于片姜黃，峰3、7 （蕓香柚皮苷）、9 （柚皮苷）、10 （橙皮苷）、13、14 （川橙皮素）、16 （橘皮素） 歸屬于醋青皮，表明所有藥味均有特征峰，歸屬關系明確，可較穩(wěn)定地從飲片傳遞到基準樣品。

圖2 對照品（A）、巴芪柔肝方基準樣品（B） HPLC 特征圖譜Fig.2 HPLC characteristic chromatograms of reference substances （ A） and Baqi Rougan Decoction reference sample （B）

圖3 巴芪柔肝方基準樣品、單味藥HPLC 特征圖譜Fig.3 HPLC characteristic chromatograms of Baqi Rougan Decoction reference sample and single drugs

圖4 巴芪柔肝方基準樣品、陰性樣品HPLC 特征圖譜Fig.4 HPLC characteristic chromatograms of Baqi Rougan Decoction reference sample and negative samples

2.3 成分含量測定及量值傳遞規(guī)律研究

2.3.1 毛蕊異黃酮葡萄糖苷、橙皮苷、迷迭香酸、莪術(shù)烯醇

2.3.1.1 色譜條件 同“2.2.1” 項。

2.3.1.2 供試品溶液的制備 同“2.2.2” 項。

2.3.1.3 對照品溶液制備 精密稱取毛蕊異黃酮葡萄糖苷、橙皮苷、迷迭香酸、莪術(shù)烯醇對照品適量，甲醇制成質(zhì)量濃度分別為1 117.07、639.46、1 032.99、1 240.68 μg/mL 的溶液，即得。

2.3.1.4 線性關系考察 精密吸取 “2.3.1.3”項下對照品溶液適量，甲醇稀釋成系列質(zhì)量濃度，在“2.2.1” 項色譜條件下進樣測定。以對照品峰面積為縱坐標（Y），進樣量為橫坐標（X） 進行回歸，并分別以信噪比（S/N） 3、10 為檢出限、定量限，結(jié)果見表4，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關系良好。

表4 各成分線性關系Tab.4 Linear relationships of various constituents

2.3.1.5 精密度試驗 按“2.2.4.1” 項下方法操作，測得毛蕊異黃酮葡萄糖苷、橙皮苷、迷迭香酸、莪術(shù)烯醇峰面積RSD 分別為0.69%、0.11%、0.90%、0.23%，表明儀器精密度良好。

2.3.1.6 重復性試驗 按“2.2.4.2” 項下方法操作，測得毛蕊異黃酮葡萄糖苷、橙皮苷、迷迭香酸、莪術(shù)烯醇含量RSD 分別為0.85%、0.28%、0.77%、0.30%，表明該方法重復性良好。

2.3.1.7 穩(wěn)定性試驗 按“2.2.4.3” 項下方法操作，測得毛蕊異黃酮葡萄糖苷、橙皮苷、迷迭香酸、莪術(shù)烯醇峰面積RSD 分別為0.86%、0.11%、1.29%、0.23%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.1.8 加樣回收率試驗 取第13 批基準樣品適量，按100%水平加入對照品（含毛蕊異黃酮葡萄糖苷0.052 mg、橙皮苷1.090 mg、迷迭香酸0.095 mg、莪術(shù)烯醇0.249 mg），按“2.2.2” 項下方法制備6 份供試品溶液，在“2.2.1” 項色譜條件下進樣測定，計算回收率。結(jié)果，毛蕊異黃酮葡萄糖苷、橙皮苷、迷迭香酸、莪術(shù)烯醇平均加樣回收率分別為 95.34%、99.55%、101.86%、98.38%、99.81%，RSD 分別為2.17%、1.84%、2.15%、1.87%。

2.3.2 耐斯糖含量測定

2.3.2.1 色譜條件 YMC-Triart C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）； 流動相甲醇-0.1% 甲酸 （1 ∶99）； 體積流量0.7 mL/min； 柱溫20 ℃； 進樣量10 μL； 蒸發(fā)光散射檢測器霧化溫度35 ℃； 蒸發(fā)溫度80 ℃； 氣體體積流量1.7 L/s； PMT 2.0。

2.3.2.2 供試品溶液制備 取基準樣品的供試品溶液適量，12 000 r/min 離心10 min，精密移取上清液2.5 mL，超純水稀釋定容至10 mL 量瓶中，搖勻，即得。

2.3.2.3 對照品溶液制備 精密稱取耐斯糖對照品適量，加水制成質(zhì)量濃度為978.24 μg/mL 的溶液，即得。

2.3.2.4 專屬性考察 分取吸取樣品制備用水、對照品溶液、缺巴戟肉陰性樣品溶液、供試品溶液適量，在“2.3.2.1” 項色譜條件下進樣測定，發(fā)現(xiàn)陰性無干擾，表明該方法專屬性良好。

2.3.2.5 線性關系考察 精密吸取對照品溶液適量，超純水依次稀釋至782.59、586.95、391.30、293.47、195.65、146.74 μg/mL，在“3.2.1” 項色譜條件下進樣測定。以峰面積對數(shù)值（Y） 對進樣量對數(shù)值（X） 進行回歸，并分別以信噪比（S/N） 3、10 為檢出限、定量限，結(jié)果見表4，可知耐斯糖在其范圍內(nèi)線性關系良好。

2.3.2.6 精密度試驗 取第13 批基準樣品的供試品溶液適量，在“2.3.2.1” 項色譜條件下進樣測定6 次，測得耐斯糖峰面積RSD 為1.43%，表明儀器精密度良好。

2.3.2.7 重復性試驗 取第13 批基準樣品適量，按“2.3.2.2” 項下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.3.2.1” 項色譜條件下進樣測定，測得耐斯糖含量RSD 為1.28%，表明該方法重復性良好。

2.3.2.8 穩(wěn)定性試驗 取第13 批基準樣品的供試品溶液適量，于0、2、4、8、12、24 h 在“2.3.2.1”項色譜條件下進樣測定，測得耐斯糖峰面積RSD為1.51%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.2.9 準確度試驗 取第13 批基準樣品適量，按100% 水平加入耐斯糖對照品1.770 mg，按“2.3.2.2” 項下方法制備6 份供試品溶液，在“2.3.2.1” 項色譜條件下進樣測定，計算回收率。結(jié)果，耐斯糖平均加樣回收率為99.81%，RSD為1.65%。

2.3.3 飲片-水煎液-基準樣品中傳遞規(guī)律 分別按“2.3.1” “2.3.2” 項下方法測定各成分含量，計算轉(zhuǎn)移率，結(jié)果見表5～6。由此可知，黃芪飲片中毛蕊異黃酮葡萄糖苷平均含量為（0.060±0.011）%，飲片-基準樣品平均轉(zhuǎn)移率為（77.81±8.31）%； 巴戟肉飲片中耐斯糖平均含量為（5.49±0.77%），飲片-基準樣品平均轉(zhuǎn)移率為（83.14±6.25）%。

表5 黃芪飲片-水煎液-基準樣品毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量、轉(zhuǎn)移率測定結(jié)果Tab.5 Results for content and transfer rate determination of calycosin 7-O-glucoside in Astragali Radix decoction pieceaqueous decoction-reference sample

表6 巴戟肉飲片-水煎液-基準樣品中耐斯糖含量、轉(zhuǎn)移率測定結(jié)果Tab.6 Results for content and transfer rate determination of nystose in Morindae officinalis Radix decoction piece-aqueous decoction-reference sample

除了關注君藥巴戟肉、黃芪中相對穩(wěn)定成分的轉(zhuǎn)移過程外，本實驗對澤蘭所含迷迭香酸、片姜黃所含莪術(shù)烯醇在水煎液-基準樣品中的含量也進行了測定，結(jié)果見圖5，可知兩者平均轉(zhuǎn)移率分別為（81.71±6.27）%、（72.16±5.91）%。另外，在熱的水溶液中上述2 種成分均表現(xiàn)出不穩(wěn)定性，可能與其結(jié)構(gòu)密切相關，迷迭香酸中縮合咖啡酸、丹參素的酯鍵易受熱水解［7-8］，而莪術(shù)烯醇的烯醇式結(jié)構(gòu)易受溶劑環(huán)境、溫度影響發(fā)生轉(zhuǎn)化［9-10］。在當前水溶液體系和熱作用過程中，不同批次樣品之間的差異可能會導致迷迭香酸、莪術(shù)烯醇變化更復雜，從而產(chǎn)生更離散的轉(zhuǎn)移率分布。因此，不穩(wěn)定化合物在制備過程中的量值變化規(guī)律可作為工藝條件對物料影響程度的指標［11］，對其變化速率、程度的探索可為工藝參數(shù)選擇提供重要參考。

圖5 迷迭香酸、莪術(shù)烯醇轉(zhuǎn)移率Fig.5 Transfer rates of rosmarinic acid and curcumenol

2.4 出膏率、pH 值測定

2.4.1 出膏率 精密吸取基準樣品供試品溶液10 mL，置于已恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干后在105 ℃下干燥3 h，取出，置于干燥器中冷卻至室溫，精密稱定質(zhì)量，以2 次稱定結(jié)果之差計算出膏率。結(jié)果，15 批樣品平均出膏率為 （38.91 ±1.46）%，穩(wěn)定性較好。

2.4.2 pH 值 取基準樣品水提液20 mL，測定pH 值，平行3 次，結(jié)果見表7。由此可知，15 批樣品平均pH 值為5.13±0.08，即呈弱酸性。

表7 出膏率、pH 值測定結(jié)果Tab.7 Results for paste-forming rate and pH value determination

3 討論

3.1 特征成分選擇 特征成分是否對方中藥味具有一定的代表性，是進行指標篩選的重要考量依據(jù)［12］。去乙酰車葉草苷酸是巴戟肉中典型的環(huán)烯醚萜類成分之一，相較于巴戟天在炮制過程中寡糖類成分的裂解，其含量更穩(wěn)定［13-14］，但極性與其他成分差異過大，雖然前期實驗已指認（保留時間約5 min），但考慮到整體協(xié)調(diào)未將該成分作為特征峰處理?；谏V條件、專屬性要求，綠原酸、槲皮素、蘆丁等化合物也均未標示為特征峰。地黃中梓醇、地黃苷D 均在紫外末端吸收而不易被準確測定，前期發(fā)現(xiàn)兩者在巴芪柔肝方中的專屬性均不強，含量均過低，不適合作為該藥材特征成分。5-羥甲基糠醛作為美拉德反應中的標志性產(chǎn)物，其含量變化與受熱過程有關［15-16］，在含糖豐富的地黃、巴戟肉中均能檢測到，可間接反映兩者炮制程度。毛蕊異黃酮葡萄糖苷作為黃芪中重要的黃酮類成分之一，被認為是該藥材潛在質(zhì)量標志物［17］。迷迭香酸是澤蘭中酚酸類成分的代表［18］。莪術(shù)烯醇是片姜黃水提后保留的主要倍半萜類化合物［19-20］。橙皮苷作為青皮中標志性黃酮類成分，與柚皮苷、新橙皮苷含量的差異可區(qū)別于同屬植物枳實、枳殼、化橘紅，具有一定代表性［21-23］。

3.2 色譜條件選擇 為了使包含酚酸、黃酮、倍半萜等多種類型成分的目標物質(zhì)能協(xié)調(diào)地呈現(xiàn)在色譜圖上，需結(jié)合波長掃描（210 ～400 nm） 來觀察整體分離情況，最終選擇260 nm 作為檢測波長。在流動相考察過程中，本實驗比較了冰醋酸、甲酸、磷酸對峰形的改善作用，發(fā)現(xiàn)加入甲酸時分離度最佳。在供試品溶液制備過程中，提高甲醇體積分數(shù)會使色譜前段的峰面積降低，故選擇水作為稀釋溶劑。在色譜柱篩選過程中，本實驗對郁金香、月旭、Shiseido、SVEA、HICHROM、Kromasil 等品牌的C18色譜柱進行測試，最終選擇分離度較好的Shiseido 色譜柱。

4 結(jié)論

本實驗采用多批次來源飲片，篩選穩(wěn)定存在、能體現(xiàn)藥味特點的色譜信息建立巴芪柔肝方HPLC特征圖譜，并進行多成分含量測定，同時結(jié)合工藝流程中熱穩(wěn)定或熱不穩(wěn)定指標成分的轉(zhuǎn)移率，可為確定該方工藝參數(shù)、探索其關鍵質(zhì)量屬性提供參考。