一測(cè)多評(píng)法同時(shí)測(cè)定天麻頭風(fēng)靈膠囊中10 種成分的含量

郭緒生，邱學(xué)偉，李 麗，吳愛英，陳安珍，劉紅兵，盧京光，3?

（1.中國海洋大學(xué)，山東 青島 266000； 2.海洋中藥質(zhì)量研究與評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266000；3.青島市食品藥品檢驗(yàn)研究院，山東 青島 266000）

頭痛是臨床上常見的主訴癥狀［1］，2018 年國際頭痛學(xué)會(huì)頒布了第3 版 《頭痛疾病的國際分類》［2］，將本病分為原發(fā)性頭痛、繼發(fā)性頭痛、痛性顱神經(jīng)病變和其他面痛、其他類型頭痛。天麻頭風(fēng)靈膠囊由天麻、牛膝、玄參、當(dāng)歸、川芎、野菊花、槲寄生等10 味藥材組成，具有滋陰潛陽、祛風(fēng)、強(qiáng)筋骨功效［3-4］，用于治療一般頭痛、長期手足麻木、慢性腰腿酸痛等癥［5］，但關(guān)于該制劑質(zhì)量研究的文獻(xiàn)大多是對(duì)單一成分天麻素［6-9］或阿魏酸［10-11］的含量測(cè)定，導(dǎo)致其整體質(zhì)量難以綜合評(píng)價(jià)。

一測(cè)多評(píng)法是由王智民［12］提出的通過測(cè)定1種代表性成分（對(duì)照品易得、價(jià)廉、有效） 含量，依據(jù)相對(duì)校正因子完成對(duì)多種成分（對(duì)照品難以獲得、價(jià)格昂貴） 含量測(cè)定的方法，能有效解決對(duì)照品缺乏的問題，節(jié)約檢測(cè)成本，從而完成對(duì)中藥及其復(fù)方制劑所含多成分的質(zhì)量控制［13-16］。因此，本實(shí)驗(yàn)建立一測(cè)多評(píng)法同時(shí)測(cè)定天麻頭風(fēng)靈膠囊中天麻素、巴利森苷E、紫丁香苷、巴利森苷B、巴利森苷C、阿魏酸、巴利森苷A、蒙花苷、哈巴俄苷、肉桂酸的含量，以期為該制劑質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260 infintiyⅡ高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）； LC-2030C 高效液相色譜儀（日本島津公司）； ME204T 電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）； AS10200BT 超聲波清洗器（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）

1.2 試劑與藥物 天麻素（批號(hào)110807-202010，純度95.5%）、紫丁香苷 （批號(hào)111574-201605，純度95.2%）、阿魏酸（批號(hào)110773-201915，純度99.4%）、蒙花苷（批號(hào)111528-201911，純度98.5%）、哈巴俄苷 （批號(hào)111730-201709，純度95.9%）、肉桂酸 （批號(hào)110786-201604，純度98.8%） 對(duì)照品均購自中國食品藥品檢定研究院；巴利森苷A （批號(hào)FS1625402，純度99.9%）、巴利森苷B （批號(hào)FS1625459，純度99.7%）、巴利森苷C （批號(hào)FS1625455，純度99.3%）、巴利森苷E （批號(hào)FS1625458，純度99.9%） 對(duì)照品均購自天津阿爾塔科技有限公司。天麻頭風(fēng)靈膠囊分別來自陜西白云制藥有限公司（每粒0.2 g，批號(hào)170401、170501、170502、170503、170504）、貴州益佰制藥股份有限公司 （每粒0.2 g，批號(hào)170402、171101、171102、180301、180302、180401、180402）。陰性實(shí)驗(yàn)所用中藥均由青島善大天源中藥飲片有限公司生產(chǎn)，經(jīng)青島市食品藥品檢驗(yàn)研究院吳愛英主任中藥師鑒定為正品。乙腈為色譜純（德國Merck 公司）； 其他試劑均為分析純； 水為純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 GL Science InertsilTMODS-3 色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）； 流動(dòng)相乙腈（A） -0.1%磷酸（B），梯度洗脫（0 ～10 min，1.0% ～11.0%A； 10 ～18 min，11.0% ～13.0% A； 18 ～30 min，13.0% ～20.0% A； 30 ～40 min，20.0% ～35.0% A； 40 ～43 min，35.0% A； 43 ～45 min，35.0% ～80.0% A）； 體積流量1.0 mL/min； 柱溫30 ℃； 檢測(cè)波長220 nm （0 ～33 min，天麻素、巴利森苷E、紫丁香苷、巴利森苷B、巴利森苷C、阿魏酸、巴利森苷A）、280 nm （33 ～45 min，蒙花苷、哈巴俄苷、肉桂酸）［17-21］； 進(jìn)樣量5 μL，色譜圖見圖1。由此可知，各成分色譜峰分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)均不低于5 500，陰性無干擾。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱取天麻素、巴利森苷E、紫丁香苷、巴利森苷B、巴利森苷C、阿魏酸、巴利森苷A、蒙花苷、哈巴俄苷、肉桂酸對(duì)照品適量，70% 甲醇制成質(zhì)量濃度分別為0.197 0、0.410 4、0.205 2、0.448 8、0.243 8、0.263 6、0.420 0、0.062 24、0.193 8、0.401 2 mg/mL 的貯備液，精密吸取適量，70%甲醇稀釋成分別含上述成分37.627、32.799、7.814、35.796、9.684、10.481、50.350、12.261、7.434、1.903 μg/mL 的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液 取本品內(nèi)容物6 粒，混勻，取約1.2 g，精密稱定，置于100 mL 錐形瓶中，精密加入70% 甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，密塞，超聲（功率350 W，頻率50 kHz） 處理30 min，放冷，70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液 按處方和工藝，分別制成缺天麻、缺槲寄生、缺當(dāng)歸和川芎、缺野菊花、缺玄參的陰性樣品，按 “2.2.2” 項(xiàng)下方法制備，即得。

2.3 線性關(guān)系考察 取“2.2.1” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，70% 甲醇稀釋成6 個(gè)質(zhì)量濃度，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y） 進(jìn)行回歸，結(jié)果見表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各成分線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn) 吸取“2.2.1” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次，測(cè)得天麻素、巴利森苷E、紫丁香苷、巴利森苷B、巴利森苷C、阿魏酸、巴利森苷A、蒙花苷、哈巴俄苷、肉桂酸峰面積RSD 分別為0.18%、0.12%、0.34%、0.15%、0.93%、0.41%、0.09%、0.22%、0.17%、0.55%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一份本品 （批號(hào)170401），按“2.2.2” 項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得天麻素、巴利森苷E、紫丁香苷、巴利森苷B、巴利森苷C、阿魏酸、巴利森苷A、蒙花苷、哈巴俄苷、肉桂酸含量RSD 分別為0.38%、0.76%、0.54%、1.22%、0.83%、0.44%、1.52%、0.60%、0.45%、0.58%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份本品 （批號(hào)170401），按“2.2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，于0、2、4、8、12、24 h 在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得天麻素、巴利森苷E、紫丁香苷、巴利森苷B、巴利森苷C、阿魏酸、巴利森苷A、蒙花苷、哈巴俄苷、肉桂酸峰面積RSD 分別為0.14%、1.19%、1.09%、0.40%、1.84%、0.44%、1.19%、0.72%、0.67%、1.36%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.4 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取各成分含量已知的本品（批號(hào)171101） 0.6 g，共6 份，按100%水平精密加入對(duì)照品溶液，按“2.2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果，天麻素、巴利森苷E、紫丁香苷、巴利森苷B、巴利森苷C、阿魏酸、巴利森苷A、蒙花苷、哈巴俄苷、肉桂酸平均加樣回收率分別 為 102.23%、100.06%、100.29%、101.16%、98.82%、101.18%、101.25%、99.01%、98.53%、99.60%，RSD 分別為 2.57%、2.59%、1.65%、1.62%、1.42%、1.36%、1.64%、2.52%、2.98%、1.65%。

2.5 相對(duì)校正因子計(jì)算 取對(duì)照品溶液適量，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下分別進(jìn)樣1、3、5、8、10 μL測(cè)定，以紫丁香苷為內(nèi)標(biāo)，計(jì)算其他9 種成分的相對(duì)校正因子fk/s，公式為fk/s＝fk/fs＝ （CkAs） /（CsAk），其中Ck為其他成分含量，Ak為其他成分峰面積，Cs為內(nèi)標(biāo)含量，As為內(nèi)標(biāo)峰面積，結(jié)果見表2。

表2 各成分相對(duì)校正因子Tab.2 Relative correction factors of various constituents

2.6 耐用性試驗(yàn)

2.6.1 儀器、色譜柱 取“2.2.1” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，分別考察Agilent 1260 Infintiy Ⅱ、LC-2030C 色譜儀，以及 GL Science InertsilTMODS-3 （150 mm× 4.6 mm，5 μm）、NanoChrom ChromCoreTMC18（250 mm × 4.6 mm，5 μm）、Agilent Eclipse Plus C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱對(duì)各成分相對(duì)校正因子的影響，結(jié)果見表3，可知均無明顯影響（RSD＜3.0%）。

表3 不同儀器、色譜柱對(duì)相對(duì)校正因子的影響Tab.3 Effects of different instruments and columns on relative correction factors

2.6.2 體積流量、柱溫 取“2.2.1” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，分別考察不同體積流量（0.7、0.8、0.9、1.0、1.1 mL/min）、柱溫 （25、28、30、32、35 ℃） 對(duì)各成分相對(duì)校正因子的影響，結(jié)果見表4～5，可知均無明顯影響（RSD＜2.0%）。

表4 不同體積流量對(duì)相對(duì)校正因子的影響Tab.4 Effects of different volumetric flow rates on relative correction factors

表5 不同柱溫對(duì)相對(duì)校正因子的影響Tab.5 Effects of different column temperatures on relative correction factors

2.6.3 色譜峰定位 取“2.2.1” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，分別在“2.6.1” 項(xiàng)儀器、色譜柱上測(cè)定保留時(shí)間，計(jì)算相對(duì)保留時(shí)間ti/s，結(jié)果見表6，可知均無明顯變化（RSD＜3.24%）。

表6 各成分相對(duì)保留時(shí)間Tab.6 Relative retention time of various constituents

2.7 樣品含量測(cè)定 取12 批樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，分別采用外標(biāo)法、一測(cè)多評(píng)法計(jì)算含量，并通過SPSS 17.0 軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，結(jié)果見表7，可知2 種方法所得結(jié)果無顯著差異（P＞0.05）。

表7 各成分含量測(cè)定結(jié)果（mg/g，n＝3）Tab.7 Results for content determination of various constituents （mg/g，n＝3）

3 討論

3.1 供試品溶液制備方法選擇 課題組前期分別采用不同試劑（50%甲醇、70%甲醇、甲醇、稀乙醇、乙醇） 進(jìn)行提取，并分別考察了超聲、回流提取，以及不同提取時(shí)間（20、30、40 min），發(fā)現(xiàn)70%甲醇超聲提取30 min 時(shí)效率最高，而且操作簡(jiǎn)便，各成分色譜峰良好，故選擇其作為供試品溶液制備方法。

3.2 色譜條件選擇 本實(shí)驗(yàn)分別考察了流動(dòng)相甲醇-水、甲醇-磷酸、乙腈-水、乙腈-磷酸，發(fā)現(xiàn)乙腈-0.1%磷酸洗脫時(shí)基線噪音小，各成分色譜峰分離度更好。通過全波長掃描發(fā)現(xiàn)，天麻素、巴利森苷E、紫丁香苷、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷A 在220 nm 處有最大吸收，而阿魏酸在該處也有較強(qiáng)吸收，并且峰形、分離度良好，故選擇220 nm 測(cè)定上述7 種成分； 哈巴俄苷、肉桂酸分別在280、276 nm 處有最大吸收，而蒙花苷在280 nm 處有較強(qiáng)吸收，并且峰形、分離度良好，故選擇280 nm 測(cè)定上述3 種成分。

3.3 內(nèi)標(biāo)選擇 由于紫丁香苷具有性質(zhì)穩(wěn)定、含量高、對(duì)照品易得價(jià)廉的特點(diǎn)，故本實(shí)驗(yàn)選擇其作為內(nèi)標(biāo)。

3.4 成分分析 陜西白云制藥有限公司所生產(chǎn)的天麻頭風(fēng)靈膠囊中所有成分均可測(cè)得，而貴州益佰制藥股份有限公司所生產(chǎn)的缺少部分藥味成分，需引起關(guān)注。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立一測(cè)多評(píng)法同時(shí)測(cè)定天麻頭風(fēng)靈膠囊中天麻素、巴利森苷E、紫丁香苷、巴利森苷B、巴利森苷C、阿魏酸、巴利森苷A、蒙花苷、哈巴俄苷、肉桂酸10 種成分的含量，該方法準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可用于該制劑質(zhì)量控制，能有效降低檢驗(yàn)成本，從而為客觀評(píng)價(jià)其整體質(zhì)量提供依據(jù)。