荊芥多倍體的誘導(dǎo)及農(nóng)藝性狀評(píng)價(jià)

齊琳琳 溫春秀 劉靈娣 姜濤

摘要 以荊芥種子萌發(fā)的幼苗為材料，開展秋水仙素誘導(dǎo)染色體倍性變異的最佳濃度和最適處理時(shí)間研究，調(diào)查比較多倍體植株的農(nóng)藝性狀。結(jié)果表明：用0.10%秋水仙素溶液處理荊芥幼苗生長點(diǎn)3 d最有利于四倍體的產(chǎn)生，誘導(dǎo)率達(dá)到1.15%。顯微鏡觀察變異植株根尖染色體數(shù)目為2n=4x=24。田間表現(xiàn)四倍體植株較二倍體植株葉片厚大、葉色濃綠、穗多且密、種子大，且四倍體植株較二倍體植株有效成分含量提高。

關(guān)鍵詞 荊芥；秋水仙素；多倍體；農(nóng)藝性狀

中圖分類號(hào) S567? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A? 文章編號(hào) 0517-6611（2024）03-0175-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.03.042

Polyploid Induction and Agronomic Evaluation of Schizonepeta tenuifolia

Abstract Using germinating seedlings of Schizonepeta tenuifolia as materials，the optimum concentration and treatment time of colchicine induced chromosomal ploidy variation were carried out，the agronomic characters of polyploid plants were investigated and compared. The results showed that 0.10% colchicine solution was the most beneficial to tetraploid production at the growth point 3 d of Schizonepeta tenuifolia seedlings， and the induction rate reached 1.15%. The number of chromosome in the root tip of the mutant plants was 2n=4x=24. Compared with diploid plants， tetraploid plants had thicker leaves， darker green leaves， more dense ears and larger seeds， and the content of effective components in tetraploid plants was higher than that in diploid plants.

Key words Schizonepeta tenuifolia;Colchicine;Polyploidy;Agronomic character

荊芥（Schizonepeta tenuifolia Briq.）為唇形科植物荊芥的干燥地上部分［1］，又稱為香荊芥、線芥、四棱桿蒿、假蘇［2］，以全草或花穗入藥，分別為荊芥和荊芥穗。荊芥味辛、苦，性微溫，歸肺、肝經(jīng)［3］，具有祛風(fēng)解表、宣毒透疹、散瘀止血之功效［4］，常用于感冒發(fā)熱、頭痛、咽喉腫痛、麻疹、風(fēng)疹等［5］，為中醫(yī)臨床常用藥物［6］。現(xiàn)在入藥用的荊芥大部分為人工培育而成［7］，在全國大部分地區(qū)均有種植，主要分布在河北、江蘇、浙江、江西、湖北、湖南和東北三省等地，其中河北安國和浙江蕭山最為有名［8］。

荊芥由于其重要的藥用價(jià)值和廣泛的藥理作用越來越引起人們的關(guān)注。多年來，國內(nèi)外學(xué)者對(duì)荊芥進(jìn)行了廣泛的研究，尤其是化學(xué)成分和藥理作用方面進(jìn)行了深入探討，但是針對(duì)其多倍體誘導(dǎo)方面的研究卻很少。目前國內(nèi)針對(duì)荊芥種質(zhì)資源倍性的系統(tǒng)研究鮮見報(bào)道。該研究采用秋水仙素處理植株生長點(diǎn)誘導(dǎo)獲得變異植株，通過流式細(xì)胞術(shù)和根尖染色體鑒定多倍體的方法，獲得了四倍體荊芥，為今后的新品種選育奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 供試材料荊芥種子來源于河北安國。

1.2 誘導(dǎo)方法

播種荊芥種子，待荊芥幼苗長出兩對(duì)真葉時(shí)，用帶針頭的注射器分別吸取濃度0.05%、0.10%、0.20%、0.30%、0.40%的秋水仙素溶液，滴1滴溶液在待處理的親本幼苗生長點(diǎn)上，以后每天09：00和16：00處理一次，分別處理3、4、5 d，設(shè)對(duì)照，共18個(gè)處理。

1.3 多倍體的鑒定方法

1.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定。

將處理后長出新芽的荊芥與對(duì)照植株進(jìn)行比較，篩選出具有葉片變厚、葉色變綠、葉片皺縮、植株生長緩慢等特點(diǎn)的變異植株，進(jìn)一步進(jìn)行倍性鑒定。

1.3.2 流式細(xì)胞術(shù)倍性鑒定。

采用Cytoflex流式細(xì)胞儀（美國Beckman公司）進(jìn)行染色體倍性鑒定。取荊芥待鑒定植株第二對(duì)真葉以上的幼嫩葉片1 cm2，加提取緩沖液1.5 mL后用鋒利的刀片將葉片迅速垂直切碎，然后用300目濾網(wǎng)過濾到1.5 mL離心管中，得到細(xì)胞懸浮液。1 000 r/min離心3 min，倒出上清液，在管中加入50 μL提取緩沖液和50 μL DAPI染液（染液中加入適量RNA酶，排除雙鏈RNA的干擾，濃度為50 μg/mL）混勻，避光染色1 min后上機(jī)檢測。熒光通道選擇PB450-A。

1.3.3 根尖染色體鑒定。

待疑似多倍體植株生長成熟收獲種子后，取其種子培養(yǎng)生根，采用壓片法進(jìn)行根尖染色體的檢測。選擇在荊芥種子幼根根尖分裂最活躍的時(shí)期（08：00—11：00）取其根尖1 cm左右，置于冰水混合物中于4 ℃冰箱中預(yù)處理24 h，卡諾固定液（無水乙醇∶冰醋酸=3∶1）處理24 h，流動(dòng)水洗2～3次，在1 mol/L的稀鹽酸中解離2 min（解離期間置于冰水混合物中），60 ℃恒溫水浴4 min左右，流動(dòng)水洗2～3次，吸干根表面的水分后切取1～3 mm的分生組織，用改良的卡寶品紅染色液染色20 min左右后壓片，使用Nikon E100光學(xué)顯微鏡鏡檢、拍照，觀察染色體數(shù)目。

1.4 多倍體株系的建立和田間農(nóng)藝性狀鑒定

在顯微鏡下觀察根尖染色體，重復(fù)3次以上均為多倍體，確定獲得的植株為多倍體，育苗后移栽至試驗(yàn)田，進(jìn)行田間農(nóng)藝性狀觀察與記錄。經(jīng)2年田間農(nóng)藝性狀鑒定和調(diào)查，選育出多倍體性狀特征明顯、農(nóng)藝性狀較好的荊芥株系進(jìn)一步擴(kuò)大繁殖，以便進(jìn)行品種比較試驗(yàn)和示范推廣應(yīng)用。

1.5 荊芥中主要有效成分含量測定 用高效液相色譜法［1］測定荊芥二倍體與四倍體株系中胡薄荷酮含量，用于評(píng)價(jià)多倍體株系的藥材質(zhì)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度秋水仙素對(duì)荊芥多倍體的誘導(dǎo)效果

分別用0.05%、0.10%、0.20%、0.30%、0.40%濃度的秋水仙素溶液處理荊芥幼苗生長點(diǎn)3、4、5 d，待荊芥長出新芽后，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行染色體倍性的初步鑒定，得到疑似多倍體植株；移栽大田單株收種后，用根尖進(jìn)行染色體鑒定，經(jīng)3次以上鑒定確定四倍體。試驗(yàn)結(jié)果（表1）表明：0.10%秋水仙素溶液處理荊芥幼苗生長點(diǎn)3 d時(shí)，誘導(dǎo)率最高，為1.15%。

2.2 荊芥四倍體的流式細(xì)胞術(shù)篩選

流式細(xì)胞術(shù)鑒定法因其制樣簡單、靈敏度高、分辨率高、準(zhǔn)確性好、數(shù)據(jù)的可重復(fù)性好、測試速度快、植物損傷性小，目前已經(jīng)成為倍性鑒定的主要方法，尤其適合大量樣品的染色體倍性分析［6］。將誘導(dǎo)后長出新芽的荊芥與對(duì)照植株進(jìn)行比較，篩選出具有葉片增厚、葉色變綠、植株生長緩慢等特點(diǎn)的目標(biāo)植株，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果（圖1）顯示，對(duì)照的峰值處于35×104道附近，四倍體的峰值處于70×104道左右，約為對(duì)照的2倍，峰值出現(xiàn)與染色體倍性關(guān)系準(zhǔn)確。

2.3 荊芥四倍體根尖染色體鑒定

根尖染色體鑒定結(jié)果（圖2）表明，荊芥二倍體植株根尖染色體數(shù)目為2n=2x=12，四倍體植株根尖染色體數(shù)目為2n=4x=24，增加了1倍。

2.4 四倍體荊芥農(nóng)藝性狀評(píng)價(jià)

二倍體和四倍體荊芥植株在株高、葉片大小及形狀、花大小等性狀上有明顯差別（表2）。四倍體幼苗的葉片較二倍體大而厚，葉色濃綠（圖3）。田間性狀調(diào)查結(jié)果表明，四倍體植株較二倍體植株株型矮，分枝數(shù)少，莖稈粗，頂端裂片短而寬，花大，葉片皺縮，穗多、穗密（圖4），種子較大（圖5）。

2.5 四倍體株系與二倍體株系藥用成分含量比較

經(jīng)過多年田間性狀篩選及藥用成分含量檢測，得到6個(gè)優(yōu)良株系，分別為J-448、J-203、J-563、J-564、J-625、J-596。依據(jù)《中國藥典》標(biāo)準(zhǔn)對(duì)其藥用成分胡薄荷酮含量進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖6），四倍體株系的胡薄荷酮含量比對(duì)照品種的胡薄荷酮含量高，最高達(dá)0.231%，高于藥典含量（0.020%）。

3 討論與結(jié)論

自然界多倍體雖然分布廣泛，但數(shù)量有限［9］，因此，需要人工誘導(dǎo)。秋水仙素是目前多倍體育種中應(yīng)用最廣泛的化學(xué)試劑之一［10］，該研究采用不同濃度的秋水仙素處理荊芥幼苗生長點(diǎn)，確定最適秋水仙素處理濃度為0.10%，最適處理時(shí)間為3 d，此時(shí)的多倍體誘導(dǎo)率最高，可達(dá)1.15%。研究結(jié)果顯示，與二倍體相比，荊芥多倍體植株的葉片厚大且葉色濃綠，果穗多且密，種子明顯變大。通過對(duì)其藥用成分檢測，胡薄荷酮含量明顯高于《中國藥典》標(biāo)準(zhǔn)。

該研究獲得的荊芥多倍體植株，將進(jìn)行多年田間篩選鑒定，對(duì)穩(wěn)定株系開展生物學(xué)特性、農(nóng)藝性狀、營養(yǎng)成分及藥用成分比較分析，以產(chǎn)量和藥用成分含量作為核心選育指標(biāo)，選育獲得多倍體新品系。

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