茶皂素和博落回生物堿復配對4種病原菌的聯(lián)合毒力

杜曉靜 梁浩

摘要 為了明確博落回生物堿與茶皂素混配對棉花立枯病菌、棉花枯萎病菌、蘋果輪紋病菌和柑橘炭疽病菌的聯(lián)合毒力，采用生長速率法測定了博落回生物堿、茶皂素及其不同配比混劑對4種病菌的毒力，通過交互測定法測定了茶皂素和博落回生物堿的毒性比例和增效系數(shù)。結果表明：博落回生物堿與茶皂素復配對棉花枯萎病的聯(lián)合毒力主要為拮抗或相加作用，博落回生物堿與茶皂素復配對蘋果輪紋病的聯(lián)合毒力主要為相加作用，博落回生物堿與茶皂素質量比為1∶48.7的混劑對棉花立枯病表現(xiàn)為增效作用，增效系數(shù)為1.536；博落回生物堿與茶皂素質量比為1∶20.2的混劑對柑橘炭疽病菌表現(xiàn)出較好的增效作用，增效系數(shù)為1.537。

關鍵詞 博落回生物堿；茶皂素；植物病原菌；聯(lián)合毒力

中圖分類號 S48? 文獻標識碼 A? 文章編號 0517-6611（2024）03-0125-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.03.030

Combined Toxicity of Tea Saponin and Macleaya alkaloid Against Four Pathogenic Bacteriay

Abstract In order to determine the combined toxicity of Macleaya alkaloid and tea saponin to Rhizoctonia solani， Fusarium oxysporum f.sp.Vasinfectum （ATK） Sndyder & Hansln， Botryosphaeria berengeriana f. sp piricola and Colletotrichum gloeosporioides， the growth rate method was used to determine the toxicity of Macleaya alkaloid， tea saponin and their mixtures with different proportions to the four pathogens， and the toxicity ratio and synergism coefficient of tea saponin and Macleaya alkaloid were determined by the interaction method. The results showed that the combined toxicity of Macleaya alkaloid and tea saponin to Rhizoctonia solani and Botryosphaeria berengeriana f. sp piricola was mainly additive， and the mixture of Macleaya alkaloid and tea saponin with a mass ratio of 1∶48.7 showed synergistic effect on Rhizoctonia solanit， with a synergistic coefficient of 1.536; the mixture of Macleaya alkaloid and tea saponin with a mass ratio of 1∶20.2 showed a good synergistic effect on Colletotrichum gloeosporioides， with a synergistic coefficient of 1.537.

Key words Macleaya alkaloids;Tea saponin;Plant pathogen;Combined virulence

當前，我國農(nóng)藥市場當中，化學合成農(nóng)藥占主導地位［1］，但是化學農(nóng)藥的大量使用對環(huán)境造成了嚴重的污染及導致農(nóng)產(chǎn)品嚴重的農(nóng)殘問題［2-3］，安全無污染、環(huán)境友好型的生物農(nóng)藥特別是植物源農(nóng)藥越來越受到重視［4-5］。截至2019年底，我國在登記有效期內(nèi)的植物源農(nóng)藥共計28種，登記單劑數(shù)量總共247個，混劑36個，母藥/原藥41個，登記企業(yè)177家［6-7］。

博落回由于其開發(fā)成本較低，是一種具有較大開發(fā)利用價值的植物源農(nóng)藥資源［8］。博落回果莢和種子含有大量的異喹啉類生物堿，在防治蔬菜、果樹、茶樹、糧食作物等植物病蟲害方面表現(xiàn)出良好的殺蟲、抑菌活性［9-10］。茶皂素作為一種植物源農(nóng)藥，雖然自身抑菌活性不高，但研究表明其對多種農(nóng)藥都表現(xiàn)出較好的增效作用，通過其與其他農(nóng)藥復配，可大大減少農(nóng)藥的用量［11-12］。

棉花、蘋果、柑橘是我國重要的經(jīng)濟作物，筆者以這3種經(jīng)濟作物的常見病害病原菌（棉花立枯病菌、棉花枯萎病菌、蘋果輪紋病菌和柑橘炭疽病菌）為研究對象，測定了博落回生物堿和茶皂素2種單劑，及其混劑對4種病原菌室內(nèi)聯(lián)合毒力及增效作用，旨在為茶皂素和博落回生物堿在經(jīng)濟作物病害的田間防治實際應用方面提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種

棉花立枯病、棉花枯萎病、蘋果輪紋病和柑橘炭疽病菌由中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所提供。

1.2 主要材料與試劑

博落回生物堿（純度為76%），參照文獻［13］自制；茶皂素（65%；上海源葉生物科技有限公司）；葡萄糖、瓊脂粉等其他試劑為市售分析純試劑。

1.3 主要儀器與設備

超聲波清洗機（KQ800E，昆山超聲儀器有限公司）；紫外可見分光光度計（T10CS，北京普析通用儀器有限公司）；超凈工作臺（SW-CJ-2FD，蘇州凈化設備有限公司）；立式壓力蒸汽滅菌器（YM50，上海三申醫(yī)療器械有限公司）；恒溫恒濕箱（HWS450B，杭州綠博通用儀器有限公司）。

1.4 試驗方法

1.4.1 室內(nèi)離體活性測試。

用無菌水將2種藥劑配置成100 μg/mL溶液。采用菌落直徑法測定藥劑對病原菌的抑菌活性，病菌接種在含藥培養(yǎng)基上，菌絲朝下（每處理3次重復），置于25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期觀察，計算抑菌率。

1.4.2 博落回生物堿與茶皂素對4種病原菌的EC50值。

測定博落回生物堿與茶皂素對4種病原菌的EC50值時，采用菌落直徑法。設置5個濃度梯度。計算各濃度下對4種病原菌的抑制率，通過計算，得出測定博落回生物堿與茶皂素對4種病原菌的EC50值。

1.4.3 博落回生物堿與茶皂素最佳配比篩選。

測定采用Horsfal方法進行混配比例設計［14-15］，以博落回生物堿與茶皂素2種單劑的EC50為基礎濃度，將2種藥劑EC50藥液按照體積比和空白對照共設置12個處理進行測定（表1）。每處理3次重復，采用十字交叉法參照“1.4.1”計算各配比抑制率，再根據(jù)以下公式計算毒性比率（毒性比率>1.25為增效；毒性比率<0.75為拮抗；0.75≤毒性比率≤1.25為相加），在此基礎上篩選出最佳配比。

預期抑制率（％）＝博落回生物堿EC50值劑量實際抑制率×配比中博落回生物堿EC50值劑量百分比＋茶皂素EC50值劑量實際抑制率×配比中茶皂素EC50值劑量百分比

毒性比率＝實際抑制率/預期抑制率

1.4.4 最佳配比聯(lián)合毒力測定。

采用Wadley法定量篩選［16］，根據(jù)篩選出的最佳配比（“1.4.3”試驗結果），將有增效作用的體積配比進行混合測定聯(lián)合毒力并計算混劑的增效系數(shù)（SR，SR>1.5為增效，0.5≤SR≤1.5為相加，SR＜0.5為拮抗），評價復配劑增效比。

EC50（th）=（a+b）/［a/EC50（ob）（A）+b/EC50（ob）（B）］

SR＝EC50（th）/EC50（ob）

式中：EC50（ob）（A）、EC50（ob）（B）分別代表混劑中博落回生物堿和茶皂素的EC50實測值；EC50（ob）為實測值，EC50（th）為理論值；a為博落回生物堿的百分含量，％；b為茶皂素在混劑中的百分含量，%；SR代表增效系數(shù)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用orgin 9.1軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計，計算各處理平均菌落直徑和平均抑制率；采用IBM SPSS Statistics 26軟件對藥劑濃度對數(shù)值及其對應的菌絲生長抑制率進行回歸分析，求出各單劑及其不同配比混劑的毒力回歸方程、相關系數(shù)（r）和EC50值。

2 結果與分析

2.1 室內(nèi)離體活性測試

抑菌活性測定結果表明（表2），博落回生物堿對棉花立枯病、棉花枯萎病和柑橘炭疽病均表現(xiàn)出較好的抑菌活性，抑菌活性高于吡唑醚菌酯，與多菌靈相當。

2.2 博落回生物堿與茶皂素對4種病原菌的EC50值

由表3可知，博落回生物堿對棉花立枯病、蘋果輪紋病、棉花枯萎病和柑橘炭疽病4種病原菌均有較好的抑菌活性，EC50值分別為5.700、19.511、52.011和18.398 μg/mL，茶皂素對4種病原菌的抑菌活性較差。

2.3 博落回生物堿與茶皂素最佳配比篩選

以單劑博落回生物堿與茶皂素的近似EC50值為基礎，采用交互測定法進行最佳配比的篩選，試驗結果表明（表4），在所選配比中，博落回生物堿和茶皂素EC50值劑量比例40∶60和30∶70時對棉花立枯病菌的毒性比率分別為1.311 1和1.265 4，表現(xiàn)為增效作用。因此，取40∶60和30∶70這2個比例作下一步的聯(lián)合毒力驗證；博落回生物堿和茶皂素EC50值劑量比例為60∶40和10∶90時對柑橘炭疽病菌的毒性比率分別為1.268 7和1.291 7，表現(xiàn)為增效作用。因此，取60∶40和10∶90這2個比例作下一步的聯(lián)合毒力驗證。

2.4 最佳配比聯(lián)合毒力測定

結合2種單劑的EC50值，根據(jù)Wadley法計算博落回生物堿與茶皂素不同比例混劑理論上的EC50（th），并與實際觀察的EC50（ob）比較，計算增效系數(shù)（SR）。由表5可知，博落回生物堿與茶皂素EC50值劑量比例40∶60混劑對棉花立枯病菌的增效系數(shù)為1.283，表現(xiàn)為相加作用，比例30∶70混劑對棉花立枯病菌的增效系數(shù)為1.536，表現(xiàn)為增效作用。博落回生物堿與茶皂素EC50值劑量比例60∶40混劑對柑橘炭疽病菌的增效系數(shù)為1.537，表現(xiàn)為增效作用，比例10∶90混劑對柑橘炭疽病菌的增效系數(shù)為0.423，表現(xiàn)為拮抗作用。

3 結論與討論

博落回生物堿與茶皂素混配對棉花立枯病菌、棉花枯萎病菌、蘋果輪紋病菌和柑橘炭疽病菌均具有一定的增效或相加作用。根據(jù)毒性比率可知，博落回生物堿與茶皂素復配對棉花枯萎病菌的聯(lián)合毒力主要是拮抗或相加作用，博落回生物堿與茶皂素復配對蘋果輪紋病的聯(lián)合毒力主要為相加作用。由增效系數(shù)可知，針對棉花立枯病菌，博落回生物堿與茶皂素EC50值劑量比例為30∶70（實際含量比為1∶48.7）為增效作用，可作為最佳配比。針對柑橘炭疽病菌，博落回生物堿與茶皂素EC50值劑量比例為60∶40（實際含量比為1∶20.2）為增效作用，可作為最佳配比。

博落回生物堿在多種農(nóng)作物病蟲害防治方面表現(xiàn)出良好的殺蟲、抑菌活性，且有效成分使用后易降解，對環(huán)境污染小，病蟲害對其不產(chǎn)生抗性，對人畜安全可靠，在防治農(nóng)作物病害上具有廣闊的應用潛力［17-19］，但其對環(huán)境的不穩(wěn)定性和藥效持續(xù)時間是博落回生物堿開發(fā)和應用的關鍵問題。研究表明：農(nóng)藥合理混配不但可以延緩藥劑抗性的發(fā)生和發(fā)展，亦可擴大防治譜，提高防效及降低單位面積內(nèi)的用藥，不同作用機理的殺菌劑復配表現(xiàn)出優(yōu)于單劑的防治效果，極大地促進了復配殺菌劑的快速發(fā)展［20-21］。茶皂素作為一種非離子型表面活性劑，可增強農(nóng)藥在生物體表面黏著力和在靶體表面的持留能力，從而提高農(nóng)藥的田間防治效果［22-23］。目前國內(nèi)外不少學者報道了茶皂素對農(nóng)藥的增效作用，具有較好的復配利用基礎［24-25］。該研究結果表明，博落回生物堿與茶皂素按一定比例混配可達到增效作用，以EC50值達到相同抑菌效果所需博落回生物堿的量明顯減少，也有利于農(nóng)藥使用成本的降低。

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