實(shí)驗(yàn)室自繁大豆菌核萌發(fā)影響因素研究

李易初 孟慶林 石鳳梅 馬立功 劉佳 蘇保華 于良斌

摘要 采用人工繁育菌核進(jìn)行萌發(fā)試驗(yàn)，研究人工繁育菌核與自然菌核萌發(fā)區(qū)別及培養(yǎng)時間、形成菌核的菌齡和保存方式對菌核萌發(fā)的影響。結(jié)果表明，PDA平板培養(yǎng)菌核萌發(fā)時間較少，采集菌核萌發(fā)時間最長及萌發(fā)率最低；PDA平板15 d形成菌核萌發(fā)時間短，培養(yǎng)30和45 d菌核萌發(fā)時間無明顯差異；不同菌齡形成菌核萌發(fā)無差異；繁育菌核直接培養(yǎng)萌發(fā)時間最短，干燥儲存時間越長，后續(xù)萌發(fā)培養(yǎng)時間越長。

關(guān)鍵詞 核盤菌；大豆；菌核萌發(fā)；人工繁育

中圖分類號 S435.651? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A? 文章編號 0517-6611（2024）03-0122-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.03.029

Study on Influencing Factors of the Sclerotiums Germination in Laboratory Artificial Culture on Soybean

Abstract The artificial breeding sclerotiums were used for germination test. The germination difference between artificial breeding sclerotiums and natural sclerotiums， the influence of sclerotiums of several generations funguses and preservation methods on the germination of sclerotiums was studied.The results showed that the germination time of sclerotiums cultured by PDA substrate was less，the natural sclerotiums germination time was the longest and germination rate was the lowest， the germination time of sclerotiums which culture for 15 days in PDA substrate was shorter ， and there was no significant difference between 30 days and 45 days. There was no difference between sclerotiums from different age funguses groups. The germination time of fresh breeding sclerotiums was the shortest， and the longer the dry storage time， the longer the subsequent germination culture time.

Key words Sclerotinia sclerotiorum;Soybean;Sclerotiums germination;Artificial culture

大豆菌核病是由核盤菌Sclerotinia sclerotiorum（Lib.）be Bary引起的主要真菌病害，核盤菌世界范圍內(nèi)可以侵染上百種植物，侵染力強(qiáng)，寄主廣泛［1］。有關(guān)部門對我國大豆菌核病發(fā)生年份統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，大豆產(chǎn)量整體減產(chǎn)近34%，嚴(yán)重時減產(chǎn)50%，如遇特殊年份甚至絕收［2］。全球范圍內(nèi)暫未發(fā)現(xiàn)免疫大豆品種，對大豆菌核病侵染機(jī)理等方面的研究仍是解決核盤菌防治問題的重要研究方向。

核盤菌主要通過2種方式侵染大豆，一種是菌絲直接侵入，一種是通過菌核萌發(fā)形成子囊盤彈射子囊孢子侵染［3-4］。野外采集菌核數(shù)量有限且存在地域差異，核盤菌子囊孢子致病機(jī)理的研究多采用實(shí)驗(yàn)室自繁菌核萌發(fā)收集子囊孢子為接種菌，試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)自繁菌核萌發(fā)情況多樣，菌核間萌發(fā)狀態(tài)難以達(dá)成一致，影響子囊孢子的收集時間和數(shù)量，進(jìn)而影響后續(xù)試驗(yàn)順利進(jìn)行。與此同時，人工繁殖菌核與自然采集菌核萌發(fā)情況是否存在差異仍未明確。筆者研究人工培養(yǎng)菌核與自然形成菌核是否存在萌發(fā)差異，并初步探索人工繁育的菌核在室內(nèi)萌發(fā)培養(yǎng)的影響因素，為后續(xù)菌核萌發(fā)機(jī)制及子囊孢子致病力研究等提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株。

實(shí)驗(yàn)室內(nèi)常規(guī)方法分離收集自黑龍江省不同地區(qū)的菌核JH001、JH002和JH003，得到對應(yīng)的致病菌株4 ℃保存斜面?zhèn)溆?。田間采集菌核常溫干燥環(huán)境留存，部分菌核按照試驗(yàn)方法直接試驗(yàn)；菌株JH001、JH002和JH003轉(zhuǎn)接在PDA平板，待菌落氣生菌絲糾結(jié)成團(tuán)形成菌核，鑷子摘取PDA平板表面菌核用于試驗(yàn)；3種菌塊分別接種于馬鈴薯胡蘿卜培養(yǎng)基恒溫20 ℃培養(yǎng)20 d，形成菌核取出洗凈、陰干備用。

1.1.2 試驗(yàn)儀器。

超凈工作臺（WT-2N）、生化培養(yǎng)箱（SPX-420B）、恒溫干燥箱（DGX-9623 BC-1）、樣品保存柜（FYL-YS-430L）等。

1.2 方法

1.2.1 菌核來源對萌發(fā)的影響。

選擇3個菌株3種不同來源的菌核進(jìn)行萌發(fā)試驗(yàn)，挑選合適菌核相同條件培養(yǎng)。觀察菌核萌發(fā)時間，培養(yǎng)20 d調(diào)查每個發(fā)芽盒菌核萌發(fā)數(shù)量，計算萌發(fā)率。菌核分別來自PDA平板菌絲團(tuán)形成菌核，馬鈴薯胡蘿卜培養(yǎng)基培養(yǎng)得到，野外病株體上采集。

1.2.2 培養(yǎng)時間對菌核萌發(fā)的影響。

首次分離得到的菌株接種于馬鈴薯胡蘿卜培養(yǎng)基，25 ℃培養(yǎng)15、30、45 d，取出培養(yǎng)時間不同的菌核，洗凈備用。

1.2.3 菌齡對菌核萌發(fā)的影響。

第一次分離得到的菌株，再次轉(zhuǎn)接得到的第二代、第三代菌株通過室內(nèi)人工自繁（馬鈴薯胡蘿卜培養(yǎng)基培養(yǎng)）方法獲得菌核，沖洗干凈后直接進(jìn)行萌發(fā)試驗(yàn)。

1.2.4 保存狀態(tài)對菌核萌發(fā)的影響。

馬鈴薯胡蘿卜培養(yǎng)基培養(yǎng)得到菌核沖洗干凈后直接進(jìn)行萌發(fā)試驗(yàn)；菌核陰干后再進(jìn)行萌發(fā)試驗(yàn)；菌核陰干并儲存30 d再用于萌發(fā)試驗(yàn)。

按照試驗(yàn)設(shè)計培養(yǎng)選擇不同狀態(tài)大小均勻菌核，完全浸泡在5%次氯酸鈣溶液中，表面消毒30 min，無菌水沖洗3遍，擺放在鋪有完全濕潤滅菌沙的培養(yǎng)盒中，20 ℃恒溫明暗交替條件培養(yǎng)，隨時觀察菌核的萌發(fā)情況，記錄萌發(fā)時間。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌核來源對萌發(fā)的影響

不同來源菌核萌發(fā)情況見圖1。由圖1可知，馬鈴薯胡蘿卜培養(yǎng)的菌核部分形狀不規(guī)則，處理組中JH001菌核的萌發(fā)率可達(dá)70%，3種菌株菌核的萌發(fā)率平均高于59%，3個來源菌核的平均萌發(fā)率最高；PDA平板形成菌核形狀多為圓形和橢圓形，菌核一側(cè)接觸玻璃皿或培養(yǎng)基，形態(tài)扁平，飽滿程度不高，其中JH002菌核萌發(fā)率最高為30.67%，仍明顯低于其他2組處理；野外采集菌核萌發(fā)情況介于前2組處理之間，平均萌發(fā)率為53.56%。對比發(fā)現(xiàn)PDA平板培養(yǎng)的菌核平均萌發(fā)率最低，馬鈴薯胡蘿卜培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌核平均萌發(fā)率最高。

試驗(yàn)菌核的萌發(fā)時間比較發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)皿培養(yǎng)的菌核萌發(fā)所需時間均超過28 d，JH003菌核萌發(fā)時間為32.67 d；野外采集的菌核需連續(xù)培養(yǎng)近20 d才開始萌發(fā)；馬鈴薯胡蘿卜培養(yǎng)基繁育的菌核萌發(fā)時間為16.33～19.67 d（圖2）。

結(jié)合萌發(fā)時間及萌發(fā)率試驗(yàn)結(jié)果可知，PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)形成菌落后菌核所需萌發(fā)時間較長，相同培養(yǎng)時間菌核的萌發(fā)率最低，且在試驗(yàn)中觀察到菌核在培養(yǎng)過程中未形成子囊柄及子囊盤，而是形成菌絲，菌核呈菌絲型萌發(fā)。野外采集菌核的萌發(fā)時間及萌發(fā)率次之，推測戶外的自然環(huán)境影響了菌核本身的水分含量，采集的菌核均十分干燥，萌發(fā)需要較長時間。馬鈴薯胡蘿卜培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌核萌發(fā)時間最短、萌發(fā)率最高，是比較穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)室繁育菌核的方法。

2.2 培養(yǎng)時間對菌核萌發(fā)的影響

按照試驗(yàn)方法培養(yǎng)菌核，觀察記錄其萌發(fā)時間。由表1可知，萌發(fā)時間在15～20 d，不同培養(yǎng)時間的菌核萌發(fā)天數(shù)相差較小，PDA平板培養(yǎng)15 d得到菌核，需平均培養(yǎng)16.22 d后逐個萌發(fā)。JH002所需培養(yǎng)時間最長為17.33 d，較其他2組相對時間較短；對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，培養(yǎng)30和45 d菌核萌發(fā)時間差異不顯著。培養(yǎng)15 d的菌核萌發(fā)時間最短，培養(yǎng)超過30 d的菌核萌發(fā)時間需要18 d以上。

2.3 菌齡對菌核萌發(fā)的影響

菌核的萌發(fā)率和萌發(fā)時間見表2。由表2可知，一代分離菌株菌核平均需要19.00 d，萌發(fā)率可達(dá)49.33%；第二代菌株形成菌核萌發(fā)平均需要18.89 d，與首次分離得到菌株菌核萌發(fā)時間無顯著差異，萌發(fā)率為50.67%，略高于首次分離菌株菌核；第三代繁育的菌核萌發(fā)率為50.78%，萌發(fā)時間為18.22 d，菌齡不同形成的菌核在培養(yǎng)時間及萌發(fā)率方面差異不顯著。

2.4 保存狀態(tài)對菌核萌發(fā)的影響

選擇3種實(shí)驗(yàn)室常見保存方式的菌核進(jìn)行試驗(yàn)，干燥30 d后的菌核需要培養(yǎng)22 d以上萌發(fā)；繁育菌核直接取出培養(yǎng)只需6 d左右即可萌發(fā)；陰干7 d的菌核所需萌發(fā)時間在10～11 d（圖3）。剛剛培養(yǎng)得到的新鮮菌核，沒有干燥過程直接培養(yǎng)萌發(fā)僅需6 d，隨著干燥時間延長，再次萌發(fā)培養(yǎng)時間延長，干燥儲存時間越長，菌核萌發(fā)所需時間越長。

3 討論

該試驗(yàn)結(jié)果表明，通過馬鈴薯胡蘿卜培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌核，直接取出清洗，立即進(jìn)行萌發(fā)培養(yǎng)，菌核萌發(fā)速度快，萌發(fā)率較高；野外采集的菌核和人工繁育存儲時間較長的菌核萌發(fā)時間較長，間接證明菌核內(nèi)部含水量與菌核的萌發(fā)有十分重要的關(guān)系［5-7］。馬鈴薯胡蘿卜培養(yǎng)基繁育的菌核，萌發(fā)時間與菌核儲存時間［8］及干燥程度有直接關(guān)系，剛剛繁育的菌核萌發(fā)所需時間僅為6～7 d。PDA平板上形成的菌核較小，萌發(fā)時間較長，且部分菌核不形成子囊柄，多數(shù)菌核繼續(xù)菌絲型萌發(fā)［9-10］。用于繁育菌核的菌株與形成菌核的萌發(fā)時間無明顯相關(guān)性，不同傳代菌株形成的菌核不影響其萌發(fā)。

綜上所述，PDA平板培養(yǎng)的菌核形狀均勻，萌發(fā)時間長，還受到形成數(shù)量和體積偏小限制，不利于在后續(xù)培養(yǎng)中形成子囊柄及子囊盤；馬鈴薯胡蘿卜培養(yǎng)基更適合大量繁育菌核，培養(yǎng)得到菌核數(shù)量充足、體積較大，干燥條件封閉保存，提前預(yù)留出培養(yǎng)時間，可以保證后續(xù)試驗(yàn)順利進(jìn)行，是實(shí)驗(yàn)室內(nèi)較為理想的繁育菌核方法。

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