淺談熒光檢測(cè)分析儀器中的光學(xué)濾光片

關(guān)鍵詞：熒光；光學(xué)濾光片；檢測(cè)分析儀器；光學(xué)薄膜

中圖分類號(hào)：O 436；TB 43 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

引言

熒光檢測(cè)技術(shù)是20世紀(jì)七八十年代逐漸成熟起來(lái)的一種新型檢測(cè)技術(shù)[1-2]，其優(yōu)勢(shì)在于靈敏度高，抗干擾能力強(qiáng)。隨著該技術(shù)的不斷完善，它被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)、食品安全、水質(zhì)檢測(cè)、藥物學(xué)以及材料學(xué)等領(lǐng)域中[3-10]。典型的熒光檢測(cè)分析儀器包括熒光聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀、熒光顯微鏡、基因測(cè)序儀、流式細(xì)胞儀等。

在眾多熒光檢測(cè)分析儀器內(nèi)部，往往需要使用一組或多組光學(xué)濾光片（以下簡(jiǎn)稱“濾光片”），用于提取熒光信號(hào)和濾除光路系統(tǒng)中的干擾光。濾光片性能的高低直接決定著儀器的檢測(cè)精度和可靠性，是儀器中的核心光學(xué)元件。隨著檢測(cè)分析儀器逐漸向著檢測(cè)速度更快，檢測(cè)精度更高，檢測(cè)性能更穩(wěn)定，結(jié)構(gòu)更加精巧的方向發(fā)展，人們對(duì)濾光片的性能要求還在不斷提升。本文將從濾光片的工作原理、設(shè)計(jì)理念、設(shè)計(jì)技術(shù)、制備技術(shù)以及發(fā)展新趨勢(shì)等方面，分析論述熒光檢測(cè)分析儀器中的濾光片。

1濾光片的工作原理

熒光檢測(cè)分析儀器是基于熒光發(fā)光原理設(shè)計(jì)的。所謂“熒光”，是物質(zhì)的電子吸收激發(fā)光能量躍遷至激發(fā)態(tài)，在其返回基態(tài)過(guò)程中發(fā)射出的光。熒光物質(zhì)發(fā)射的熒光波長(zhǎng)通常大于其激發(fā)光譜的波長(zhǎng)（如圖1所示），其波長(zhǎng)差值稱為“斯托克斯位移”[11]。根據(jù)這種“斯托克斯位移”現(xiàn)象，再利用光學(xué)濾光片的濾光、分光等光譜特性，能夠?qū)⒓ぐl(fā)光與熒光分離出來(lái)，進(jìn)而對(duì)獲得的熒光信號(hào)進(jìn)行后續(xù)處理。

對(duì)應(yīng)1種熒光試劑，通常以“激發(fā)濾光片”、“發(fā)射濾光片”和“分色鏡”的組合來(lái)完成儀器所需的光學(xué)功能，它們稱為1個(gè)“濾光片組”。其在儀器內(nèi)部的典型工作過(guò)程如圖2所示：光源發(fā)出的寬譜段混合光，通過(guò)“激發(fā)濾光片”后形成準(zhǔn)單色激發(fā)光；該激發(fā)光被“分色鏡”反射后入射到樣本上，激發(fā)樣本中的熒光試劑發(fā)出熒光；熒光經(jīng)“分色鏡”透射后到達(dá)“發(fā)射濾光片”，同時(shí)到達(dá)的還有少量激發(fā)光和環(huán)境雜散光等；“發(fā)射濾光片”濾除各種干擾光因素，使最終所需的熒光信號(hào)進(jìn)入光電接收系統(tǒng)。

2濾光片的設(shè)計(jì)理念

2.1與熒光試劑匹配

應(yīng)用于熒光檢測(cè)分析儀器中的濾光片，在設(shè)計(jì)時(shí)必須考慮其光譜特性與所使用熒光試劑的對(duì)應(yīng)關(guān)系。

激發(fā)濾光片的作用是選擇透射特定波段的激發(fā)光。在熒光試劑的激發(fā)光譜中，譜線所涵蓋的光譜波段都能夠激發(fā)出熒光，并且越靠近譜線峰值的光，其熒光激發(fā)效率越高，因此激發(fā)濾光片在設(shè)計(jì)時(shí)應(yīng)盡量包含激發(fā)光譜峰值附近的波段?？紤]到激發(fā)濾光片與發(fā)射濾光片的光譜不能重疊，激發(fā)濾光片的光譜類型可以分為如圖3所示的“短波通型”和“帶通型”。

發(fā)射濾光片的作用是選擇透射特定波段的熒光發(fā)射光。在熒光試劑的發(fā)射光譜中，譜線所涵蓋的光譜波段都是可用的熒光波段，并且越靠近譜線峰值的光，受激發(fā)射的熒光能量越強(qiáng)，因此發(fā)射濾光片在設(shè)計(jì)時(shí)應(yīng)盡量包含熒光發(fā)射光譜峰值附近的波段?？紤]到發(fā)射濾光片與激發(fā)濾光片的光譜不能重疊，發(fā)射濾光片的光譜類型可以分為如圖4所示的“長(zhǎng)波通型”和“帶通型”。

很多熒光檢測(cè)分析儀器不限于一個(gè)檢測(cè)通道，以熒光PCR儀為例，4～6個(gè)檢測(cè)通道已成為該類儀器的主流。在多通道熒光檢測(cè)分析儀器中，被測(cè)樣本中同時(shí)包含多種熒光試劑（每個(gè)檢測(cè)通道對(duì)應(yīng)一種熒光試劑），為降低通道之間的信號(hào)干擾，激發(fā)濾光片和發(fā)射濾光片均以“帶通型”更為常見。

分色鏡的作用是利用透射和反射將激發(fā)光和熒光的傳播方向分離開，通常傾斜45°使用。根據(jù)不同的光路系統(tǒng)設(shè)計(jì)，分色鏡的光譜類型可以是反射激發(fā)光、透射熒光的“長(zhǎng)波通型”，或者透射激發(fā)光、反射熒光的“短波通型”（如圖5所示），最常見的是“長(zhǎng)波通型”。

2.2熒光與激發(fā)光相互隔離

熒光試劑受激發(fā)射的熒光非常微弱，其能量?jī)H相當(dāng)于激發(fā)光的10?3～10?4[12-14]。為了有效檢測(cè)到熒光信號(hào)，必須保證熒光與激發(fā)光之間相互隔離。因此，激發(fā)濾光片與發(fā)射濾光片之間要求有足夠的截止深度。

描述濾光片截止區(qū)域?qū)獾慕刂钩潭?，?jīng)常使用光密度（optical density，OD）參數(shù)，其值D是對(duì)濾光片的透射率取常用對(duì)數(shù)值[15]

D（λ）=-lg[T（λ）] （1）

式中，T（λ）表示在λ波長(zhǎng)位置時(shí)濾光片的透射率。

為了獲得基本的熒光信號(hào)，激發(fā)濾光片與發(fā)射濾光片在整個(gè)工作波段（通常為200～1100nm）的隔離程度應(yīng)在OD4以上。為了保障檢測(cè)儀器的測(cè)試精度和準(zhǔn)確性，大多數(shù)熒光檢測(cè)儀器要求激發(fā)濾光片和發(fā)射濾光片的這種隔離程度應(yīng)達(dá)到OD5～OD6，特別是要確保激發(fā)濾光片在發(fā)射濾光片的透射區(qū)波段具有OD6以上的截止深度，相應(yīng)的，發(fā)射濾光片在激發(fā)濾光片的透射區(qū)波段也應(yīng)具有OD6以上的截止深度（如圖6所示）。

3濾光片的設(shè)計(jì)和制造

3.1設(shè)計(jì)技術(shù)

濾光片的光譜特性是基于光學(xué)薄膜技術(shù)來(lái)設(shè)計(jì)的。所謂光學(xué)薄膜技術(shù)，是指利用光學(xué)干涉原理，優(yōu)化設(shè)計(jì)光學(xué)薄膜系統(tǒng)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)光學(xué)元件基底表面光譜特性精準(zhǔn)調(diào)控的技術(shù)。如圖7所示，光學(xué)元件基底表面鍍有多層納米級(jí)光學(xué)薄膜，每一層薄膜的膜厚均經(jīng)過(guò)精準(zhǔn)設(shè)計(jì)。入射光在每個(gè)膜層表面發(fā)生多次的反射和透射，這些光彼此之間產(chǎn)生了干涉效應(yīng)，最終使光學(xué)元件實(shí)現(xiàn)既定的濾光或分色等光學(xué)效果[16-18]。

在設(shè)計(jì)熒光檢測(cè)分析儀器用濾光片時(shí)，首先堆疊足夠的膜堆，使濾光片截止區(qū)域的寬度和深度滿足技術(shù)指標(biāo)要求并留有一定的余量，然后綜合采用單純形法、共軛梯度法、針式法等多種優(yōu)化方法，降低濾光片透射區(qū)域的波紋。在優(yōu)化過(guò)程中，濾光片截止區(qū)域的寬度和深度都會(huì)變差，因此初始膜系在截止寬度和深度方面所留的余量要足夠，如有必要，可對(duì)某些關(guān)鍵區(qū)域的背景（如激發(fā)濾光片與發(fā)射濾光片彼此相鄰的區(qū)域）鎖定后再進(jìn)行優(yōu)化。增加初始膜系的層數(shù)，有利于提高濾光片的性能，但制造難度和制造成本也會(huì)顯著提升，因此優(yōu)秀的濾光片設(shè)計(jì)，往往追求降低設(shè)計(jì)冗余，即采用盡可能少的光學(xué)膜層來(lái)達(dá)到所需的光譜特性要求。

3.2制造技術(shù)

濾光片的制造通常采用物理氣相沉積（physical vapor deposition，PVD）方法，即在真空技術(shù)條件下，采用物理方法將薄膜材料表面氣化為原子或分子，或者部分電離成離子，通過(guò)低壓氣體過(guò)程在基底表面沉積為薄膜。制造熒光檢測(cè)分析儀器用濾光片，行業(yè)上普遍采用以下3類鍍膜設(shè)備，結(jié)合各設(shè)備的特點(diǎn)加以介紹。

（1）蒸發(fā)鍍膜設(shè)備。其優(yōu)點(diǎn)是：膜層沉積速率高，單次鍍膜產(chǎn)量大，成本低。其主要缺點(diǎn)是：最大鍍膜層數(shù)較少（100層左右），膜厚控制精度較低（控制誤差為0.5%左右）。要實(shí)現(xiàn)彼此隔離達(dá)到OD6的激發(fā)濾光片和發(fā)射濾光片，每個(gè)濾光片都需要鍍制4～5個(gè)子片，膠合在一起才能實(shí)現(xiàn)。

（2）磁控濺射設(shè)備。與蒸發(fā)鍍膜設(shè)備相比，該類設(shè)備成膜的膜層均勻性好，膜厚控制精度較高（控制誤差為0.2%左右），最大鍍膜層數(shù)較多（200層左右）。而相對(duì)的缺點(diǎn)是：?jiǎn)未五兡ぎa(chǎn)量較少，鍍膜成本較高。采用該設(shè)備制造彼此隔離達(dá)到OD6的激發(fā)濾光片和發(fā)射濾光片，可考慮使用在一個(gè)基底的兩個(gè)表面分別鍍膜的方案。

（3）離子束濺射設(shè)備。該類設(shè)備成膜的均勻性更好，膜厚控制精度更高（控制誤差為0.1%左右），鍍膜層數(shù)可超過(guò)500層。而相對(duì)缺點(diǎn)是：膜層沉積速率低，單次鍍膜產(chǎn)量更小，鍍膜成本更高。采用該設(shè)備制造彼此隔離達(dá)到OD6的激發(fā)濾光片和發(fā)射濾光片，在一個(gè)基底上單面鍍膜就可實(shí)現(xiàn)。

采用磁控濺射設(shè)備或離子束濺射設(shè)備制造濾光片，由于單次鍍膜的層數(shù)較多，必須選擇表面光潔度高的優(yōu)質(zhì)基底，否則可能出現(xiàn)濾光片表面發(fā)霧等現(xiàn)象，影響其光學(xué)性能；另一方面，必須開發(fā)更好的膜層監(jiān)控工藝方案，充分降低膜厚誤差，否則可能出現(xiàn)實(shí)際鍍制的濾光片光譜與設(shè)計(jì)光譜相差甚遠(yuǎn)的現(xiàn)象?？傊?，以上3類鍍膜設(shè)備各有特點(diǎn)，在實(shí)際應(yīng)用中應(yīng)結(jié)合濾光片的光譜特性要求，綜合考慮制造難度和制造成本，選擇適合的鍍膜設(shè)備和工藝實(shí)現(xiàn)方案。

4濾光片的發(fā)展趨勢(shì)

隨著熒光檢測(cè)分析儀器的不斷發(fā)展，濾光片正在經(jīng)歷著一些變化?？偟膩?lái)說(shuō)，濾光片的發(fā)展趨勢(shì)包括以下幾個(gè)方面。

4.1單片集成化

傳統(tǒng)的濾光片為多片膠合結(jié)構(gòu)，即通過(guò)多個(gè)子片共同實(shí)現(xiàn)一種所需的光譜特性，如圖8（a）所示，每個(gè)子片均采用蒸發(fā)鍍膜設(shè)備生產(chǎn)。而隨著即時(shí)檢驗(yàn)（point-of-caretesting，POCT）等小型化設(shè)備的出現(xiàn)和普及，人們對(duì)單片集成化鍍膜的需求激增，即僅使用1片基底來(lái)實(shí)現(xiàn)所需的光譜特性，見圖8（b）。實(shí)現(xiàn)單片集成化鍍膜，要求每次鍍膜層數(shù)更多，膜厚控制更加精準(zhǔn)，往往需要使用磁控濺射設(shè)備或離子束濺射設(shè)備來(lái)實(shí)現(xiàn)。

對(duì)于濾光片的單片集成化鍍膜，歐美等國(guó)家具有明顯的優(yōu)勢(shì)，在膜系設(shè)計(jì)方法、工藝控制手段和鍍膜設(shè)備性能等方面都代表著國(guó)際領(lǐng)先水平[19-20]，已經(jīng)形成了成熟的標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)品和相當(dāng)?shù)漠a(chǎn)業(yè)規(guī)模。國(guó)內(nèi)目前在該領(lǐng)域處于快速發(fā)展期，近5年來(lái)，國(guó)內(nèi)一些優(yōu)秀的鍍膜企業(yè)逐步推出了自己的單片集成化鍍膜產(chǎn)品，從一定程度上實(shí)現(xiàn)了進(jìn)口替代，但生產(chǎn)這些濾光片的鍍膜設(shè)備仍以德國(guó)和美國(guó)的進(jìn)口設(shè)備為主。

4.2光譜復(fù)雜化

為了優(yōu)化光路，降低成本，滿足設(shè)備微型化、集成化的應(yīng)用需求，越來(lái)越多的熒光檢測(cè)分析儀器采用雙通帶或多通帶濾光片，即在1片濾光片中含有兩個(gè)或多個(gè)光譜通帶區(qū)域。與之相對(duì)應(yīng)，分色鏡也不再是簡(jiǎn)單的“長(zhǎng)波通型”或“短波通型”，而是更趨向于一種綜合類型。圖9給出了一種典型的雙通帶濾光片組光譜示意圖。

多通帶激發(fā)濾光片和發(fā)射濾光片，其設(shè)計(jì)難點(diǎn)在于同時(shí)滿足多個(gè)通帶的位置、帶寬以及所需的截止深度要求。多通帶分色鏡的設(shè)計(jì)難點(diǎn)在于，光線45°傾斜入射時(shí)，在多個(gè)透射帶和反射帶之間實(shí)現(xiàn)高陡度消偏振效果。不同廠商對(duì)這些濾光片的設(shè)計(jì)方法不盡相同，相關(guān)報(bào)道包括“一維晶體缺陷層模型”、“雙對(duì)稱結(jié)構(gòu)”、“循環(huán)嵌套模型”等[21-25]。

目前，國(guó)內(nèi)在雙通帶濾光片和分色鏡的設(shè)計(jì)和制造方面進(jìn)步較快，部分國(guó)產(chǎn)產(chǎn)品的光學(xué)性能與國(guó)際先進(jìn)水平相差無(wú)幾，然而對(duì)于3通帶以上的濾光片和分色鏡產(chǎn)品，國(guó)內(nèi)還鮮有廠商穩(wěn)定量產(chǎn)，而美國(guó)的Semrock、Chroma等公司，其標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)品中就包含多種5通帶濾光片及配套分色鏡。因此，國(guó)內(nèi)光學(xué)薄膜行業(yè)在復(fù)雜光譜的設(shè)計(jì)和制造方面還有很大的進(jìn)步空間。

4.3低波前畸變

有些熒光檢測(cè)分析儀器對(duì)成像品質(zhì)有高質(zhì)量需求（如基因測(cè)序儀），有些熒光檢測(cè)分析儀器需要對(duì)多個(gè)激發(fā)光源進(jìn)行精準(zhǔn)合束（如流式細(xì)胞儀），此時(shí)往往要求濾光片能夠?qū)Σㄇ盎冞M(jìn)行有效抑制。

波前畸變包含“透射波前畸變”和“反射波前畸變”兩類，是指入射光經(jīng)濾光片作用后，其透射光或反射光的波前（波面）相對(duì)于理想波前（波面）的改變程度，如圖10所示。波前畸變通常用“xλ@檢測(cè)波長(zhǎng)”的形式表示，其中“檢測(cè)波長(zhǎng)”通常取632.8nm，而“x”為具體的數(shù)值，其值越小代表波前畸變程度越低。

影響濾光片波前畸變的主要因素有兩個(gè)：

（1）基底質(zhì)量。當(dāng)基底的材質(zhì)均勻，表面光潔度高，表面形變量小時(shí)，采用該基底制備濾光片才具備擁有低波前畸變的可能，特別是濾光片的“透射波前畸變”特性幾乎完全由基底質(zhì)量決定。我國(guó)當(dāng)前量產(chǎn)化的光學(xué)玻璃基底，波前畸變能夠達(dá)到優(yōu)于0.25λ@632.8nm的行業(yè)水平，而國(guó)際先進(jìn)水平可以優(yōu)于0.1λ@632.8nm。

（2）膜層應(yīng)力。鍍制在基底上的膜層會(huì)產(chǎn)生“張應(yīng)力”或“壓應(yīng)力”效果，進(jìn)而拉彎基底的表面形狀（如圖11所示），嚴(yán)重影響濾光片的“反射波前畸變”特性。針對(duì)這一現(xiàn)象，光學(xué)薄膜制造企業(yè)往往通過(guò)“優(yōu)化膜料選擇和膜系設(shè)計(jì)”、“雙面應(yīng)力匹配鍍膜”、“鍍膜后退火處理”等手段進(jìn)行改善。通過(guò)多手段結(jié)合，膜層應(yīng)力的影響效果會(huì)顯著降低。

我國(guó)當(dāng)前商業(yè)化的低波前畸變?yōu)V光片的透射波前畸變可優(yōu)于0.25λ@632.8nm，反射波前畸變可達(dá)到（0.25～0.50）λ@632.8nm的水平，滿足大多數(shù)中高端儀器的應(yīng)用需求。應(yīng)用于更高端儀器的濾光片往往要求透射和反射波前畸變優(yōu)于0.1λ@632.8nm。目前僅美國(guó)等少數(shù)國(guó)家具有相對(duì)成熟的制備工藝，一個(gè)濾光片的價(jià)格可高達(dá)上千美元，仍處于行業(yè)壟斷狀態(tài)。

4.4更深更銳截止

為了進(jìn)一步提升熒光檢測(cè)分析儀器的性能，人們期望借助濾光片使儀器的光學(xué)系統(tǒng)獲得更優(yōu)異的信噪比，這推動(dòng)著濾光片的截止背景向著更深更銳的方向發(fā)展。

（1）更深截止。提高濾光片的截止深度，能夠使熒光與激發(fā)光之間實(shí)現(xiàn)更有效的隔離，便于更好地提取熒光信號(hào)、抑制干擾光，從而使信噪比得到提升。對(duì)于某些使用高功率激光器作為激發(fā)光源的儀器而言，濾光片OD6的截止深度已經(jīng)不能完全滿足應(yīng)用需求，往往需要將截止深度提升到OD7或OD8以上。

（2）更銳截止。濾光片的光譜從透射區(qū)向截止區(qū)變化得更快——即濾光片的截止陡度更高時(shí)，在保障熒光和激發(fā)光有效隔離的前提下，能夠讓濾光片的帶寬做得更寬，從而獲得更高的激發(fā)能量和更強(qiáng)的熒光信號(hào)，進(jìn)而獲得更好的信噪比。對(duì)于某些使用小斯托克斯位移型熒光試劑的儀器而言，提高濾光片的截止陡度是改善系統(tǒng)信噪比非常重要的手段。

提升濾光片截止背景的深度或陡度，除了使產(chǎn)品制造難度增加以外，在產(chǎn)品的性能檢測(cè)方面也提出了更高要求。目前，我國(guó)光學(xué)薄膜行業(yè)對(duì)濾光片截止深度檢測(cè)的普遍精度在OD6～OD7的水平，對(duì)截止陡度的檢測(cè)分辨率為3～4nm；而國(guó)際先進(jìn)水平，截止深度可準(zhǔn)確測(cè)量到OD9以上，截止陡度的檢測(cè)分辨率可達(dá)1nm以內(nèi)。因此，我國(guó)光學(xué)薄膜行業(yè)今后在研究提高濾光片設(shè)計(jì)制造水平的同時(shí)，也應(yīng)同步提升產(chǎn)品檢測(cè)水平。

5結(jié)束語(yǔ)

在濾光片的設(shè)計(jì)和制造等方面，歐美等發(fā)達(dá)國(guó)家具有先發(fā)優(yōu)勢(shì)。但令人欣慰的是，隨著我國(guó)科技水平的不斷進(jìn)步，國(guó)產(chǎn)濾光片的各項(xiàng)性能已呈現(xiàn)出顯著提升的態(tài)勢(shì)，濾光片的國(guó)產(chǎn)化替代進(jìn)程已全面開啟。國(guó)內(nèi)部分廠家采用國(guó)產(chǎn)濾光片制造的“實(shí)時(shí)定量PCR儀”和“基因測(cè)序儀”等熒光檢測(cè)分析儀器，其性能具備了比肩國(guó)際一流企業(yè)產(chǎn)品的能力。相信隨著國(guó)產(chǎn)濾光片設(shè)計(jì)制造等各項(xiàng)水平的不斷提升，今后將有更多優(yōu)秀的國(guó)產(chǎn)熒光檢測(cè)分析儀器脫穎而出。