瓜氨酸對(duì)輻射致小鼠腸道損傷的防護(hù)作用及機(jī)制研究

豐俊東 劉亮 劉雯倩 李騫 田劉欣 何承宇 薄宏宇王維泰 楊穎清

1（南京航空航天大學(xué) 南京 210016）

2（山東省濰坊市人民醫(yī)院 濰坊 261000）

現(xiàn)如今，電離輻射在多個(gè)領(lǐng)域展現(xiàn)出良好的發(fā)展與應(yīng)用前景，尤其是醫(yī)療領(lǐng)域［1］。伴隨著電離輻射的發(fā)展，研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)多個(gè)領(lǐng)域的從業(yè)人員都可能存在潛在危害［2-3］，電離輻射對(duì)人體的不同組織都會(huì)產(chǎn)生損傷，包括生殖器官損傷［4］、脾臟損傷［5］、胃腸道損傷等。由于胃腸道對(duì)電離輻射的敏感性，其導(dǎo)致了復(fù)雜的病理過(guò)程，如吸收不良、細(xì)菌性腸炎、腹瀉等，阻礙治療進(jìn)展，甚至導(dǎo)致死亡［6］，因此，輻射防護(hù)尤為重要。在我們?cè)缙谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)，電離輻射損傷引起的敏感代謝物有瓜氨酸（Citrulline，Cit）、肌酸、脯氨酸和尿酸。瓜氨酸為α氨基酸，主要產(chǎn)生于腸道。由于瓜氨酸與腸道有較為緊密的相關(guān)性，血漿瓜氨酸水平與X射線誘導(dǎo)小腸上皮細(xì)胞損傷和小腸形態(tài)具有密切聯(lián)系，其可能作為評(píng)估電離輻射致小腸損傷最有前途的生物標(biāo)志物之一，具有較好的應(yīng)用前景［7-8］。瓜氨酸對(duì)于急性腸損傷狀態(tài)下的小鼠腸黏膜上皮細(xì)胞形態(tài)及功能有促進(jìn)作用［9］，補(bǔ)充外源性瓜氨酸對(duì)于潰瘍性結(jié)腸炎的腸道炎癥損傷具有保護(hù)作用［10］，也可以抑制膿毒癥早期促炎因子的釋放，減輕心、肝、腎等機(jī)體重要臟器的炎癥反應(yīng)程度［11-12］，減輕腸黏膜組織炎癥反應(yīng)，降低受損腸黏膜的通透性，同時(shí)口服瓜氨酸可以保護(hù)腸道黏膜的破壞和腸道屏障功能［13］。因此，瓜氨酸可能是一種很有潛力針對(duì)輻射致腸道損傷的防護(hù)藥物。

瓜氨酸是精氨酸（Arginine，ARG）的代謝產(chǎn)物［14］。其作為一種有機(jī)補(bǔ)充劑，在恢復(fù)敗血癥危重患者精氨酸代謝方面具有治療潛力［15-16］，補(bǔ)充L-瓜氨酸可通過(guò)促進(jìn)腸道形態(tài)發(fā)育和氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)而產(chǎn)生節(jié)約精氨酸的效果［17］，并且口服瓜氨酸不會(huì)為胃腸道帶來(lái)更多負(fù)擔(dān)［18］。此外，長(zhǎng)期給用瓜氨酸治療尿素循環(huán)缺陷患者沒(méi)有任何副作用［19］?？诜习彼嵩诟纳品蔷凭灾靖巍⒛c道疾病、心血管疾病等方面都有一定的作用［20-21］。一氧化氮（Nitric Oxide，NO）和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible Nitric Oxide Synthase，iNOS）在瓜氨酸代謝循環(huán)中起到了重要作用，黏著斑激酶（Focal Adhesion Kinase，F(xiàn)AK）為腸細(xì)胞遷移的信號(hào)分子，可以促進(jìn)腸道黏膜修復(fù)，Occludin是一種腸道緊密連接蛋白，可以維持腸道屏障功能，我們通過(guò)上述指標(biāo)來(lái)論述瓜氨酸對(duì)腸道的保護(hù)作用。

本文擬利用γ射線對(duì)小鼠進(jìn)行全身照射，構(gòu)建急性輻射致腸道損傷動(dòng)物模型，并通過(guò)補(bǔ)充外源性瓜氨酸，研究瓜氨酸對(duì)輻射致腸道損傷的影響，探討瓜氨酸對(duì)輻射致腸道損傷治療的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：ICR小鼠（Institute of Cancer Research Mouse）起源于美國(guó)的癌癥研究機(jī)構(gòu)，本研究中ICR小鼠（SPF級(jí)）購(gòu)自南京市江寧區(qū)青龍山動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)（江蘇南京）。許可證號(hào)為：SCXK（豫）2020-0001。體重約為20 g，周齡在8～10周，動(dòng)物室籠中飼養(yǎng)1周，動(dòng)物室的條件為：溫度23 ℃左右、濕度55%左右、明暗周期12 h。實(shí)驗(yàn)符合倫理要求，在保證實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蛘＿M(jìn)行的條件下，盡量減少實(shí)驗(yàn)小鼠的使用數(shù)量以及實(shí)驗(yàn)過(guò)程中盡量減輕其痛苦。

材料與試劑：L-瓜氨酸（純度>99%）購(gòu)買(mǎi)于上海Macklin公司；NO測(cè)定試劑盒、iNOS分型試劑盒均購(gòu)自南京建成公司；β-actin一抗、山羊抗兔二抗、兔抗小鼠Occludin多克隆抗體、兔抗小鼠FAK多克隆抗體均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

主要儀器與設(shè)備：γ射線采用南京航空航天大學(xué)輻照中心60Co源，輻射源活度為6.1124×1015Bq，劑量場(chǎng)采用重鉻酸銀劑量計(jì)（量程0.5～5 kGy）測(cè)量，劑量率為1.06 Gy?min-1。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

設(shè)置空白對(duì)照組、單純輻照組（全身照射，Total Body Irradiation，TBI）、輻照+瓜氨酸組，每組15只。瓜氨酸腹腔注射0.15 mL，注射劑量為1 g?kg-1?d-1［22］，輻照后每天注射一次，持續(xù)一周。對(duì)照組給予生理鹽水，腹腔注射0.15 mL，每天一次，其他環(huán)境均相同。輻射劑量為8 Gy、10 Gy和12 Gy，全身照射。記錄各組小鼠體重、毛發(fā)、糞便、生存狀態(tài)和生存期，于輻照后第8天取材，檢測(cè)小鼠腸道組織形態(tài)學(xué)、血漿內(nèi)毒素、腸道NO與iNOS、腸道組織黏著斑激酶和腸道緊密連接蛋白水平開(kāi)展機(jī)制研究。

1.2.2 蘇木精-伊紅染色（Hematoxylin-Eosin staining，HE）觀察腸道組織

在全身輻照后的第8天對(duì)小鼠取材，將取得的小腸組織浸泡至磷酸緩沖鹽溶液（Phosphate Buffer Saline，PBS）溶液中。為保存小腸組織的形態(tài)，將小鼠小腸固定在10%的中性福爾馬林溶液中，隨后在濃度為10%的乙二胺三乙酸微波脫鈣，并進(jìn)行石蠟包埋、連續(xù)切片展片的操作。最后將石蠟切片染色晾干，鏡下觀察。

1.2.3 血漿中內(nèi)毒素(Lipopolysaccharide，LPS)檢測(cè)

眼球取血，迅速于3000 r?min-1的離心機(jī)中離心2 min，吸出富含血小板的血漿上清液，置于2～8 ℃?zhèn)溆?。將血漿和樣本處理液按照1∶9混勻，制成10倍稀釋液備用。將10倍稀釋液于70 ℃水浴鍋中加熱10 min，然后用冰水冷卻3 min。血漿內(nèi)毒素試劑盒具體步驟如下：配置細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，溶解試劑盒中的試劑，將上述稀釋液和空白對(duì)照組（內(nèi)毒素檢查用水）按照試劑盒中的步驟添加混勻和溫育，最后靜置5 min，在酶標(biāo)儀545 nm處讀取吸光度。

1.2.4 腸道組織NO、iNOS檢測(cè)

小鼠麻醉后頸椎脫臼法致死，剪開(kāi)腹部取小鼠腸道組織一段，用冷生理鹽水沖洗掉腸道內(nèi)容物和表面血液，按照重量∶體積=1∶9加入預(yù)冷生理鹽水后低溫研磨，制成10%的腸道組織勻漿，離心，按南京建成生物工程研究所提供的試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.2.5 免疫印跡法檢測(cè)FAK和Occludin

用PBS溶液沖洗腸道組織，裂解，提取蛋白。使用聚氰基丙烯酸正丁酯（Bicinchoninic Acid，BCA）蛋白試劑盒測(cè)定溶液蛋白濃度。蛋白質(zhì)在200 V下分離，在100 V下電泳后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜（Polyvinylidene Fluoride，PVDF）上。用含0.4%Tween20的Tris-HCl緩沖鹽溶液（Tris Buffered Saline，TBST）和5%脫脂牛奶在室溫下封閉膜，分別加入FAK和Occludin的一抗工作液，后加入用TBST按照1∶5000的比例進(jìn)行稀釋的二抗。最后用化學(xué)發(fā)光底物（Enhanced Chemiluminescence，ECL）試劑盒對(duì)整張膜進(jìn)行顯影定型。用ImageJ程序?qū)?shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)量化。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

各組數(shù)據(jù)采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，使用GraphPad Prism 9.0軟件（GraphPad，San Diego，CA，United States）。采用單因素方差分析（One-way variance，ANOVA）和Tukey的多重比較檢驗(yàn)比較兩組間的差異。p＜0.05視為統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠體重和生存時(shí)間變化

對(duì)照組小鼠行為敏捷，反應(yīng)迅速，飲食正常，排便正常。受照射小鼠出現(xiàn)精神萎靡，毛發(fā)凌亂，排便較稀。10 Gy輻照生存時(shí)間如圖1所示（藍(lán)色箭頭表示10 Gy組中位生存期，紅色箭頭表示10 Gy+Cit組的中位生存期），瓜氨酸給藥組的中位生存期為13 d，與單純輻照組相比，中位生存期延長(zhǎng)3 d（p＜0.05）（圖1）。8 Gy與12 Gy輻照小鼠體重如圖2所示（*表示p＜0.05，**表示p＜0.001），輻照后小鼠體重顯著降低，與單純輻照組相比，腹腔注射瓜氨酸能夠顯著增加輻照小鼠的體重。

圖1 瓜氨酸對(duì)輻照小鼠生存時(shí)間的影響（彩圖見(jiàn)網(wǎng)絡(luò)版）Fig.1 The effect of citrulline on the survival time of irradiated mice (color online)

圖2 瓜氨酸對(duì)輻照小鼠體重的影響Fig.2 The effect of citrulline on the body weight of irradiated mice

2.2 腸道組織形態(tài)學(xué)變化與血漿內(nèi)毒素含量

對(duì)照組腸道光滑無(wú)黏連、腸管紅潤(rùn)有光澤，腹腔中無(wú)積液，肉眼可見(jiàn)腸壁完整無(wú)出血點(diǎn)；單純輻照組小鼠的腸道顏色偏深紫色，出現(xiàn)腸黏連，腹腔中有積液，肉眼可見(jiàn)部分腸管狹窄，腸壁出現(xiàn)明顯的出血點(diǎn)，且腸道內(nèi)容物呈水樣便；而瓜氨酸給藥組的腸道顏色較輻照組紫色較淺，腸壁出血點(diǎn)明顯減少。HE染色的結(jié)果如圖3所示，8 Gy輻照后腸黏膜上皮細(xì)胞出現(xiàn)變性，無(wú)明顯壞死，無(wú)潰瘍形成，12 Gy輻照后損傷程度較8 Gy有較為明顯的加重，出現(xiàn)炎細(xì)胞。給予瓜氨酸8 d后的HE染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同劑量輻照組均出現(xiàn)一定程度的損傷修復(fù)。

圖3 輻照組小鼠和瓜氨酸給藥組小鼠的腸道組織HE染色（×200）Fig.3 HE staining of the intestinal tissue from irradiated mice and citrulline-treated mice (×200)

血漿中內(nèi)毒素的含量可以用來(lái)表征腸道屏障的通透性，血漿中內(nèi)毒素的含量檢測(cè)結(jié)果如圖4所示（**表示p＜0.01，****表示p＜0.0001），結(jié)果表明輻照組內(nèi)毒素含量與對(duì)照組相比顯著升高（p＜0.05），腹腔注射瓜氨酸后能顯著降低血漿中內(nèi)毒素的含量（p＜0.05），達(dá)到與對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異（p＞0.05），這一結(jié)果提示，瓜氨酸能夠調(diào)節(jié)輻照小鼠腸道屏障的通透性。

圖4 輻照小鼠和腹腔注射瓜氨酸給藥組小鼠血漿中內(nèi)毒素含量Fig.4 Endotoxin content in the plasma of irradiated mice and the mice treated with intraperitoneal injection of citrulline

2.3 腸道組織NO、iNOS、FAK、Occludin蛋白含量檢測(cè)

檢測(cè)了小鼠腸道中NO和iNOS的表達(dá)情況。結(jié)果如圖5所示（***表示p＜0.001，****表示p＜0.0001），輻照后小鼠腸道的NO和iNOS的表達(dá)上升，而瓜氨酸腹腔注射后顯著降低了NO和iNOS的表達(dá)量，提示補(bǔ)充瓜氨酸使代謝循環(huán)中iNOS依賴(lài)的NO合成正常化。

圖5 輻照小鼠腸道組織中NO和iNOS的含量Fig.5 The content of NO and iNOS in the intestinal tissue of irradiated mice

通過(guò)免疫印跡檢測(cè)了FAK和Occludin在小鼠腸道組織的表達(dá)情況。結(jié)果如圖6所示（**表示p＜0.01，***表示p＜0.001，****表示p＜0.0001），輻照后FAK表達(dá)量出現(xiàn)顯著下降，下降趨勢(shì)有劑量依賴(lài)性，而腹腔注射瓜氨酸后，表達(dá)量出現(xiàn)顯著的上升；輻照后Occludin蛋白表達(dá)量顯著下降，下降趨勢(shì)隨著輻照劑量增大而降低，而瓜氨酸注射后，表達(dá)量出現(xiàn)顯著上升。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，瓜氨酸對(duì)輻射損傷后腸黏膜屏障有修復(fù)和保護(hù)的作用。

圖6 輻照小鼠腸道組織FAK和Occludin表達(dá)量的變化Fig.6 The changes of FAK and Occludin expression in the intestinal tissue of irradiated mice

3 討論

本研究采用γ射線對(duì)小鼠進(jìn)行全身照射，構(gòu)建急性輻射致腸道損傷動(dòng)物模型，補(bǔ)充外源性瓜氨酸，探討瓜氨酸對(duì)輻射致腸道損傷的修復(fù)作用。結(jié)果顯示，輻射加瓜氨酸組與對(duì)照組和單純輻照組相比，瓜氨酸可以顯著提高急性輻射損傷小鼠的存活時(shí)間，并且能夠有效減緩輻照損傷帶來(lái)的體重下降。Villareal等［23］的一項(xiàng)研究表明，口服瓜氨酸15 d可以顯著提高小鼠骨骼肌的重量，增強(qiáng)小鼠的運(yùn)動(dòng)能力。瓜氨酸導(dǎo)致體重增長(zhǎng)的原因可能與瓜氨酸促進(jìn)生長(zhǎng)相關(guān)激素分泌以及瓜氨酸的生理代謝過(guò)程有關(guān)，瓜氨酸能夠促進(jìn)肌肉蛋白質(zhì)合成［23-24］，飼糧中添加不同劑量的瓜氨酸能夠顯著增加肉雞、黃顙魚(yú)幼魚(yú)、小鼠、湖羊母羊及肉兔的體重［25-26］。此外，在結(jié)腸炎小鼠模型中，給予瓜氨酸能夠顯著提高小鼠的存活率［27］，這與我們的研究結(jié)果相近。

腸道損傷會(huì)導(dǎo)致腸道黏膜通透性升高，屏障功能障礙，最終使得腸腔內(nèi)的革蘭氏陰性菌及其產(chǎn)物（內(nèi)毒素）易位入血［28］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，輻照后小鼠腸道受損，血漿中內(nèi)毒素含量增高。瓜氨酸給藥一周后，輻射致腸道損傷得到緩解，血漿內(nèi)毒素含量下降。Sellmann等［29］也報(bào)道了類(lèi)似的結(jié)果，他們采用非酒精性脂肪肝模型，發(fā)現(xiàn)口服瓜氨酸可以保護(hù)腸道黏膜和腸道屏障功能。Batista等［30］在細(xì)菌移位小鼠模型中也證明了瓜氨酸能夠降低小鼠腸道黏膜損傷，且保存了更多的完整絨毛結(jié)構(gòu)。Zoghroban等［31］在蘭氏賈第蟲(chóng)感染的小鼠模型中加入瓜氨酸發(fā)現(xiàn)腸道刷狀緣恢復(fù)，炎癥浸潤(rùn)減少。5-氟尿嘧啶致腸黏膜炎模型的小鼠中，瓜氨酸保護(hù)小腸黏膜結(jié)構(gòu)完整性，降低腸道通透［32］。FAK為腸細(xì)胞遷移的信號(hào)分子，可以促進(jìn)腸道黏膜修復(fù)；Occludin是一種腸道緊密連接蛋白，可以維持腸道屏障功能。在Ho等［33］的研究中，富含L-瓜氨酸的發(fā)酵乳與瑞士乳桿菌可恢復(fù)右旋糖酐硫酸誘導(dǎo)的Occludin在內(nèi)的腸道緊密連接蛋白水平下降。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，輻照后FAK、Occludin表達(dá)量顯著下降，腹腔注射瓜氨酸后，表達(dá)量出現(xiàn)顯著的上升，進(jìn)一步提示瓜氨酸對(duì)輻射損傷后腸黏膜屏障具有修復(fù)作用。

一方面瓜氨酸參與精氨酸合成，另一方面精氨酸可以在iNOS的誘導(dǎo)下，生成瓜氨酸，同時(shí)伴有大量NO的生成。電離輻射損傷可通過(guò)自由基介導(dǎo)，此外有研究表明，電離輻射可以增強(qiáng)體內(nèi)精氨酸參與的iNOS對(duì)NO的生物合成［34-35］。NO能與氧自由基快速反應(yīng)形成過(guò)氧亞硝酸根離子，這是一種強(qiáng)細(xì)胞毒性氧化劑，可以攻擊DNA、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)等成分，導(dǎo)致細(xì)胞功能受損同時(shí)增強(qiáng)炎癥反應(yīng)［36］。已有研究提出，ROS是啟動(dòng)子，NO是響應(yīng)電離輻射激活細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的效應(yīng)因子之一［37］?；诠习彼岬拇x循環(huán)通路以及輻射損傷的特點(diǎn)，我們研究了瓜氨酸對(duì)iNOS和NO的表達(dá)量的影響。結(jié)果顯示，電離輻射引起小鼠iNOS和NO表達(dá)大量升高，瓜氨酸能夠顯著降低iNOS和NO的表達(dá)，從而減弱過(guò)量NO介導(dǎo)的細(xì)胞毒性。有研究證實(shí)，瓜氨酸可以促進(jìn)肝臟、大腦等器官iNOS和NO合成正常化［38］，Rajcic等［39］證明給予非酒精性脂肪肝小鼠瓜氨酸，同樣也能夠使小鼠小腸中亞硝酸鹽和iNOS的含量降低，這與我們的發(fā)現(xiàn)一致。提示瓜氨酸有望起到輻射防護(hù)的作用。

綜上所述，在本實(shí)驗(yàn)的研究條件下，輻照后持續(xù)一周腹腔注射1 g?kg-1?d-1的瓜氨酸，能顯著增加小鼠體重、存活率，降低血漿中內(nèi)毒素、腸道中NO和iNOS的含量，提高FAK和Occludin的表達(dá)，提示我們瓜氨酸可能通過(guò)增強(qiáng)腸道屏障功能、代謝循環(huán)正常化和緩解亞硝化應(yīng)激起到輻射損傷的防護(hù)作用，有望作為一種有效的有潛力針對(duì)輻射腸道損傷的治療藥物。

作者貢獻(xiàn)聲明豐俊東負(fù)責(zé)文章統(tǒng)籌規(guī)劃和審閱；劉亮進(jìn)行文章撰寫(xiě)、實(shí)驗(yàn)；劉雯倩提供文章整體思路及實(shí)驗(yàn)流程；李騫負(fù)責(zé)對(duì)實(shí)驗(yàn)流程審核以及文章的修改；田劉欣、何承宇、薄宏宇、王維泰、楊穎清參與實(shí)驗(yàn)，處理數(shù)據(jù)等。