大蒜多糖通過核因子-κB通路改善代謝相關(guān)脂肪性肝病小鼠肝臟損傷

劉 杰，玉王寧，王成海，李 沙，程立媛，張 偉

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北 保定 071001；2.河北工程大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，河北 邯鄲 056038；3.河北工程大學(xué)醫(yī)學(xué)院，河北 邯鄲 056038；4.河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院，河北省血液凈化應(yīng)用基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 邯鄲 056002；5.河北工程大學(xué)分析測試實(shí)驗(yàn)中心，河北 邯鄲 056038；6.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071001）

代謝相關(guān)脂肪性肝病（metabolic-associated fatty liver disease，MAFLD），曾用名為非酒精性脂肪性肝病，是代謝綜合征的一種肝臟表現(xiàn)，涉及從單純脂肪變性到肝纖維化、肝硬化甚至肝細(xì)胞癌的復(fù)雜進(jìn)展[1-2]。MAFLD全球患病率接近30%，嚴(yán)重危害人類健康并對(duì)社會(huì)造成巨大經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，至今在美國和歐盟尚無藥物獲批用于治療該病。目前，關(guān)于MAFLD的致病機(jī)理有“二次打擊”“多次打擊”等多種理論，其中，曾經(jīng)得到廣泛認(rèn)可的“二次打擊”學(xué)說認(rèn)為，第一次打擊的肥胖、胰島素抵抗等因素引發(fā)了肝細(xì)胞中脂質(zhì)異常沉積，第二次打擊的氧化應(yīng)激、炎癥、線粒體障礙、脂肪因子調(diào)節(jié)紊亂等，引起肝臟損傷及炎癥，甚至肝纖維化等疾病發(fā)生。但是，隨著新的研究領(lǐng)域的拓展和新的研究結(jié)論的提出，“二次打擊”的觀點(diǎn)在用于病理解釋時(shí)出現(xiàn)了局限性。近年來，“多次打擊”理論正在被更多的人接受，該理論認(rèn)為腸道微生物發(fā)揮著重要的作用，強(qiáng)調(diào)通過“腸肝軸”起關(guān)鍵作用，進(jìn)而導(dǎo)致脂肪毒性、氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙和肝細(xì)胞炎癥等。

大蒜（Allium sativum）是一種在中國使用歷史悠久的調(diào)味品和中藥，已被正式批準(zhǔn)為藥食同源的食品原料，可用于治療結(jié)核病、咳嗽、感冒、高血壓、輕微血管疾病、糖尿病、肥胖、腎和肝損傷以及癌癥[3]。大蒜多糖是大蒜干物質(zhì)的主要成分[4]，具有多種生理功能，包括抗腫瘤、提高免疫力、抗氧化和抗凝血作用、保護(hù)肝臟和平衡腸道微生物群[5-6]。大蒜多糖的骨架結(jié)構(gòu)被鑒定為α-D-Glcp-1→(2-β-D-果糖-1)n→（n＝9～10），側(cè)鏈上可能附著有微量巖藻糖[7]，結(jié)構(gòu)與菊粉型果聚糖相似[8]，它是一種潛在的益生元，可能具有增加益生菌多樣性、改善腸黏膜和提高腸道免疫力的作用[9]。已有研究表明，大蒜多糖可以通過改善黏膜屏障、阻斷促炎細(xì)胞因子和調(diào)節(jié)腸道微生物群緩解右旋糖酐硫酸酯鈉誘導(dǎo)的結(jié)腸炎[7]，然而，針對(duì)MAFLD探討大蒜多糖肝保護(hù)作用的研究鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用蛋氨酸膽堿缺乏（methionine-choline deficiency，MCD）飲食誘導(dǎo)小鼠構(gòu)建MAFLD模型，探索大蒜多糖對(duì)MAFLD小鼠肝臟的保護(hù)作用機(jī)理，為以大蒜多糖為原料，具有保肝護(hù)肝功效特色食品的開發(fā)利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

雄性C57BL/6小鼠（6 周齡）購自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司。

大蒜多糖 晨光生物科技集團(tuán)有限公司；蛋氨酸膽堿充足（methionine-choline sufficient，MCS）飼料和MCD飼料 北京華富康生物科技有限公司；EasyPure?RNA純化試劑盒、EasyScript?逆轉(zhuǎn)錄酶和TransStart Top Green定量PCR試劑盒 北京全式金生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

T6新世紀(jì)紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國華電氣有限公司；KZ-II組織破碎儀 武漢塞維爾生物科技有限公司；酶標(biāo)儀、real-time聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國Bio-Rad公司；病理切片掃描儀 德國Leica公司；凝膠成像系統(tǒng)美國冷泉港公司；VERTEX 70v傅里葉變換紅外光譜儀德國Bruker公司。

1.3 方法

1.3.1 大蒜多糖紅外光譜分析

采用溴化鉀壓片法，稱取大蒜多糖樣品10 mg，按照質(zhì)量比1∶200的比例加入溴化鉀，充分研磨，然后放入壓片機(jī)壓片。采用傅里葉變換紅外光譜儀在4000～400 cm-1波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，步長為4 cm-1。

1.3.2 小鼠模型的建立

50 只C57BL/6小鼠在溫度（（22±2）℃）、濕度（55%～65%）和12 h/12 h光/暗循環(huán)的標(biāo)準(zhǔn)條件下飼養(yǎng)，并且允許小鼠在抵達(dá)后適應(yīng)1 周，隨意飲用水和飼料。然后被隨機(jī)分為5 組，分別為正常組（MCS）、模型組（MCD），大蒜多糖低（LGP，250 mg/kgmb）、中（M G P，1000 m g/k gmb）、高（H G P，3000 mg/kgmb）劑量組，每組10 只。開始實(shí)驗(yàn)時(shí)紀(jì)錄各組小鼠體質(zhì)量，并采用斷指（趾）標(biāo)記法對(duì)小鼠進(jìn)行標(biāo)號(hào)，實(shí)驗(yàn)期間記錄小鼠體質(zhì)量變化及飲食、精神狀態(tài)等情況。MCS組食用MCS飼料，灌胃生理鹽水；MCD、LGP、MGP、HGP組食用MCD飼料，分別灌胃生理鹽水，低、中、高濃度大蒜多糖，連續(xù)實(shí)驗(yàn)28 d。

1.3.3 樣本采集

第29天，各組小鼠嚴(yán)格禁食不禁水12 h，期間禁止灌胃大蒜多糖。然后在戊巴比妥鈉麻醉下處死小鼠，記錄體質(zhì)量和肝臟質(zhì)量，處死前從腔靜脈采集血樣，然后離心血清樣本并保存在-80 ℃。一部分浸泡在生理鹽水中的肝臟組織樣本用4%的多聚甲醛溶液固定，然后嵌入石蠟塊中，用于染色鏡檢。第二部分肝臟組織用于在冰水中制備肝勻漿（肝∶生理鹽水＝1∶9，g/mL），以供后續(xù)生理生化指標(biāo)分析。剩余的肝臟組織在液氮中快速冷凍用于后續(xù)mRNA檢測。

1.3.4 肝組織病理形態(tài)染色鏡檢

經(jīng)過石蠟封存的肝臟組織分別采用蘇木精-伊紅（haematoxylin-eosin，H&E）染色和油紅O染色兩種方法處理，用光學(xué)顯微鏡觀察組織學(xué)變化，以評(píng)估肝脂肪變性和炎癥。

1.3.5 生化指標(biāo)測定

甘油三酯（triglycerides，TG）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和丙二醛（malonic dialdehyde，MDA）的水平采用南京建成生物工程研究所的試劑盒測量。

1.3.6 逆轉(zhuǎn)錄定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

使用EasyPure?RNA純化試劑盒提取-80 ℃保存的肝臟組織總RNA，并作為模板利用EasyScript?逆轉(zhuǎn)錄酶將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。最后，通過使用TransStart Top GreenPCR試劑盒分析各種關(guān)鍵功能基因Hmox1、Cat、Gpx1、Tnf、Ccl2、Cxcl2、Cxcl10、IL-1a、IL-1b、Fasn、Cd36、Apob、Acaca、Fabp1、Mttp、Ppara、Ppard、Pparg、Cpt1a、Acox和Gapdh的mRNA表達(dá)。引物序列如表1所示。在以下條件下進(jìn)行40 個(gè)循環(huán)的逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量PCR（reverse transcription quantitative real-time PCR，RT-qPCR）：94 ℃預(yù)變性30 s，94 ℃變性5 s，60 ℃退火并延伸30 s。目標(biāo)基因的表達(dá)以Gapdh的表達(dá)作為內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)，并使用2-ΔΔCt法進(jìn)行mRNA水平的相對(duì)定量。

表1 用于RT-qPCR分析的引物序列Table 1 Primer sequences used for RT-qPCR

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 大蒜多糖的紅外吸收色譜分析

分子結(jié)構(gòu)鑒定是紅外吸收光譜技術(shù)的基本應(yīng)用之一，它主要利用了復(fù)雜分子的化學(xué)基團(tuán)在分子被激發(fā)后所產(chǎn)生的特征振動(dòng)。常見的化學(xué)基團(tuán)在4000～670 cm-1范圍內(nèi)有特征基團(tuán)頻率，大概范圍是：1）X—H伸縮振動(dòng)區(qū)，4000～2500 cm-1，X可以是O、N、C和S原子；2）三鍵和累計(jì)雙鍵區(qū)，2500～2000 cm-1；3）雙鍵伸縮振動(dòng)區(qū)，2000～1500 cm-1，主要包括C＝C、C＝O、C＝N等；4）X—Y伸縮振動(dòng)及X—H變形振動(dòng)區(qū)，1500～400 cm-1[10]。大蒜多糖的紅外吸收光譜如圖1所示，特征吸收峰有：3375.0 cm-1處為—OH伸縮振動(dòng)峰，2935.3 cm-1處為—CH2伸縮振動(dòng)峰，1647.0 cm-1處為—CHO中的C＝O伸縮振動(dòng)峰，1456.1 cm-1處為—CH2變形振動(dòng)峰，1132.1 cm-1和1026.0 cm-1處為吡喃糖環(huán)的C—O—C伸縮振動(dòng)峰，933.4 cm-1處為呋喃果糖環(huán)的對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰，817.7 cm-1處為呋喃果糖亞甲基（C—H）剪切振動(dòng)峰[11-13]。根據(jù)上述紅外光譜數(shù)據(jù)推測本研究所用的大蒜多糖為類菊粉結(jié)構(gòu)的果聚糖。

圖1 大蒜多糖紅外吸收光譜圖Fig.1 Infrared absorption spectrum of garlic polysaccharides

2.2 大蒜多糖對(duì)小鼠肝臟病理形態(tài)的影響

各組肝臟組織切片經(jīng)H&E染色和油紅O染色后（圖2），在100 倍顯微鏡下觀察可見MCS組小鼠肝臟組織形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，無脂肪變性，血管周圍無炎癥細(xì)胞浸潤，無氣球樣變和纖維化改變。而MCD組小鼠肝組織中的肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝束排列欠佳，出現(xiàn)大量脂肪變性，在鏡檢視野內(nèi)可見大量混合型脂滴空泡充滿胞質(zhì)；透過變性脂肪，可見顯著的胞漿腫脹、細(xì)胞核大濃染、肝細(xì)胞壞死的氣球樣變，以及出現(xiàn)肝纖維化；肝小葉及匯管區(qū)周圍出現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤的炎性灶。LGP組小鼠肝組織中的肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝束排列欠佳，可見脂肪變性和胞質(zhì)內(nèi)大量脂滴空泡，相對(duì)于MCD組有所減少；胞漿腫脹、細(xì)胞核大且濃染、肝細(xì)胞壞死的氣球樣變，以及出現(xiàn)肝纖維化略有改善，但炎性灶依然較多。MGP組小鼠肝細(xì)胞中的肝小葉結(jié)構(gòu)和肝束排列基本恢復(fù)正常，仍可見脂肪變性和胞質(zhì)內(nèi)脂滴空泡，相對(duì)于LGP組顯著減少；胞漿腫脹、細(xì)胞核大且濃染、肝細(xì)胞壞死的氣球樣變，以及出現(xiàn)肝纖維化進(jìn)一步減輕，炎性灶幾乎不可見。HGP組小鼠肝細(xì)胞中的肝小葉結(jié)構(gòu)和肝束排列基本回復(fù)正常，可見少量脂肪變性和胞質(zhì)內(nèi)脂滴空泡，相對(duì)于MGP組顯著減少，胞漿腫脹、細(xì)胞核大且濃染、肝細(xì)胞壞死的氣球樣變、肝纖維化、炎性灶等無明顯存在。

圖2 小鼠肝組織H&E和油紅O染色Fig.2 H&E and oil red O staining of liver sections

2.3 大蒜多糖對(duì)小鼠生化指標(biāo)的影響

各組小鼠生化指標(biāo)受大蒜多糖的影響見圖3。相對(duì)于MCS組，MCD組的肝組織TG含量顯著升高，而血清TG含量顯著下降（P＜0.05）；LGP、MGP、HGP組的肝組織TG逐漸降低，MGP和HGP組相對(duì)于MCD組顯著降低（P＜0.05），未降低到MCS組水平；LGP、MGP、HGP組的血清TG逐漸升高，MGP和HGP組相對(duì)于MCD組顯著升高（P＜0.05），均達(dá)到MCS組水平。相對(duì)于MCS組，MCD組血清ALT和AST含量均顯著升高（P＜0.05），而大蒜多糖的作用又使得LGP、MGP、HGP組血清ALT和AST均顯著下降（P＜0.05），但均未下降到MCS組水平。肝組織MDA的含量在MCD組中相對(duì)于MCS組顯著升高（P＜0.05），在大蒜多糖干預(yù)后，MGP、HGP組顯著降低（P＜0.05），趨近于MCS組水平；肝組織SOD的含量在MCD組中相對(duì)于MCS組顯著降低（P＜0.05），在大蒜多糖干預(yù)后，LGP、MGP、HGP各組顯著升高（P＜0.05），均達(dá)到MCS組水平。

圖3 大蒜多糖對(duì)小鼠生化指標(biāo)的影響Fig.3 Effect of garlic polysaccharides on biochemical indexes in mice

2.4 大蒜多糖對(duì)肝臟氧化應(yīng)激相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響

大蒜多糖對(duì)肝臟氧化應(yīng)激相關(guān)基因（包括Hmox1、Cat和Gpx1）mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響如圖4所示。相對(duì)于MCS組，MCD組Hmox1基因表達(dá)量顯著升高，而Cat和Gpx1基因的表達(dá)量則顯著降低（P＜0.05）。與MCD組相比，大蒜多糖的干預(yù)緩解了Hmox1和Cat基因的表達(dá)量受MCD飲食誘導(dǎo)的影響；隨著大蒜多糖飼喂量的增加，Hmox1基因表達(dá)量在LGP組中變化不顯著（P＞0.05），在MGP、HGP組中逐漸降低；Cat基因表達(dá)量只在MGP和HGP組中有所提高。與MCD組相比，大蒜多糖的干預(yù)對(duì)Gpx1基因的表達(dá)量無顯著影響（P＞0.05）。

圖4 大蒜多糖對(duì)肝臟氧化應(yīng)激相關(guān)基因mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響Fig.4 Effect of garlic polysaccharides on relative expression of hepatic oxidative stress-related genes

2.5 大蒜多糖對(duì)肝臟炎癥反應(yīng)相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響

大蒜多糖對(duì)肝臟炎癥反應(yīng)相關(guān)基因（包括Tnf、Ccl2、Cxcl2、Cxcl10、IL-1a和IL-1b）mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響如圖5所示。除了IL-1a和IL-1b外，Tnf、Ccl2、Cxcl2和Cxcl10基因的表達(dá)量在MCD飲食誘導(dǎo)和不同飼喂量大蒜多糖干預(yù)的情況下，表現(xiàn)出了相似的變化規(guī)律，即都在MCD飲食誘導(dǎo)下表達(dá)量顯著增加，在大蒜多糖干預(yù)后表達(dá)量顯著降低（P＜0.05），且飼喂量越大降低越顯著，除了LGP組的Ccl2基因出現(xiàn)了表達(dá)量的反向波動(dòng)。這些結(jié)果預(yù)示著大蒜多糖在消除炎癥反應(yīng)中可能發(fā)揮著重要作用，其作用效果和飼喂量存在一定的劑量效應(yīng)關(guān)系。

圖5 大蒜多糖對(duì)肝臟炎癥反應(yīng)相關(guān)基因mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響Fig.5 Effect of garlic polysaccharides on relative expression of hepatic inflammation-related genes

2.6 大蒜多糖對(duì)肝臟脂質(zhì)沉積相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響

大蒜多糖對(duì)肝臟脂質(zhì)沉積相關(guān)基因（包括Fasn、Acaca、Cpt1a、Acox、Cd36、Fabp1、Apob和Mttp）mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響如圖6所示。Fasn基因和Mttp基因的表達(dá)量在MCD飲食誘導(dǎo)后顯著降低（P＜0.05），且不受飼喂大蒜多糖的影響。Acaca基因和Apob基因的表達(dá)量在MCD飲食誘導(dǎo)后沒有發(fā)生顯著變化（P＞0.05）。Cpt1a基因表達(dá)量在MCD飲食誘導(dǎo)后顯著降低（P＜0.05），飼喂大蒜多糖使Cpt1a基因的表達(dá)量在LGP和HGP組無顯著變化（P＞0.05），在MGP組顯著升高（P＜0.05）。Acox基因表達(dá)量在MCD飲食誘導(dǎo)后顯著降低（P＜0.05），飼喂大蒜多糖使Acox基因的表達(dá)量在LGP組有所升高，在MGP和HGP組顯著升高（P＜0.05）。Cd36基因表達(dá)量在MCD飲食誘導(dǎo)后顯著升高（P＜0.05），且不受飼喂大蒜多糖的影響。Fabp1基因表達(dá)量受MCD飲食誘導(dǎo)顯著降低（P＜0.05），各組大蒜多糖干預(yù)并沒有對(duì)該基因的表達(dá)產(chǎn)生顯著影響（P＞0.05）。

圖6 大蒜多糖對(duì)肝臟脂質(zhì)沉積相關(guān)基因mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響Fig.6 Effect of garlic polysaccharides on relative expression of hepatic lipid accumulation-related genes

3 討論

MAFLD作為多系統(tǒng)代謝功能紊亂的肝臟表現(xiàn)，其發(fā)病機(jī)制、臨床表現(xiàn)及病理改變均存在一定異質(zhì)性[2]。脂肪在肝臟細(xì)胞中的非正常沉積是MAFLD形成的初始條件，主要是肝臟脂質(zhì)代謝紊亂所致，如果脂肪酸的攝取、脂肪酸內(nèi)部合成、脂肪分解、脂肪酸β-氧化等過程無法維持動(dòng)態(tài)平衡，則會(huì)造成紊亂產(chǎn)生脂質(zhì)沉積[14]，隨著病變加重，肝細(xì)胞功能逐漸喪失，炎癥反應(yīng)起關(guān)鍵作用，貫穿MAFLD的整個(gè)過程[15-16]。本研究用MCD飲食誘導(dǎo)的小鼠構(gòu)建MAFLD模型，通過比較大蒜多糖干預(yù)與否情況下的小鼠肝組織病理形態(tài)、血清和肝組織生化指標(biāo)、病理相關(guān)功能基因轉(zhuǎn)錄水平等，結(jié)果表明大蒜多糖對(duì)于MCD飲食誘導(dǎo)的MAFLD有著比較明顯的緩解作用，其中，MGP組效果比較顯著，添加量適中。

經(jīng)過MCD飲食誘導(dǎo)的小鼠肝臟組織表現(xiàn)出肝損傷、炎癥和纖維化，以及大泡性脂肪變性[17-19]，其中，肝損傷、炎癥和纖維化由蛋氨酸缺失導(dǎo)致，大泡性脂肪變性由膽堿缺失導(dǎo)致。蛋氨酸和膽堿都是肝磷脂酰膽堿（phosphatidylcholine，PC）的基本前體，這種飲食引起的肝脂肪性肝炎可能部分是由于PC合成受損導(dǎo)致的[20]。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)模型組肝臟組織切片經(jīng)H&E染色和油紅O染色后鏡檢觀察，發(fā)現(xiàn)非常明顯的肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝束排列欠佳，出現(xiàn)大量脂肪變性和混合型脂滴空泡，可見顯著的胞漿腫脹、細(xì)胞核大且濃染、肝細(xì)胞壞死的氣球樣變，以及出現(xiàn)肝纖維化和炎性灶，表明實(shí)驗(yàn)造模成功[21]。隨著實(shí)驗(yàn)組大蒜多糖灌胃量的增多，小鼠肝組織病理形態(tài)分別得到不同程度的改善。在中劑量的大蒜多糖灌胃組中，已經(jīng)幾乎觀察不到到炎性灶。在高劑量的大蒜多糖灌胃組中，小鼠肝組織的病理變化基本回復(fù)到正常狀態(tài)。與上述變化最直接的聯(lián)系，可能是肝組織脂質(zhì)異常積累導(dǎo)致的氧自由基帶來的損傷。

已知以體內(nèi)活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）水平升高為特征的氧化應(yīng)激是肝損傷的一個(gè)確定原因，肝臟即是ROS產(chǎn)生的主要場所，也是ROS攻擊的主要靶器官[22]。如H2O2等一些ROS可以發(fā)揮信號(hào)分子的作用，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)過程，進(jìn)而影響許多病理狀態(tài)下一些基因的表達(dá)[23-24]，ROS也可直接或通過某些轉(zhuǎn)錄因子（transcription factors，TFs）激活各種凋亡誘導(dǎo)物，進(jìn)而導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化[25]。本研究的MCD組中，TG在肝組織異常沉積，MDA顯著增多，SOD卻顯著降低（P＜0.05）。MDA是細(xì)胞膜脂質(zhì)在ROS的作用下發(fā)生過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物，該物質(zhì)過量積累會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)一步受到損害，所以MDA的含量能夠直接反映細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化水平。研究表明，在MAFLD病理狀態(tài)下，肝細(xì)胞、線粒體、微粒體膜的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量明顯增高，并且與肝組織酯化、纖維化、炎癥及壞死程度相關(guān)[26]。SOD可有效治療或緩解因ROS作用而導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)，當(dāng)SOD缺乏時(shí)，機(jī)體的抗氧化能力降低，氧化還原穩(wěn)態(tài)失衡，出現(xiàn)氧化應(yīng)激。SOD基因上游的TATA盒和CCAAT盒構(gòu)成轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)（transcription factor binding sites，TFBSs），能與相應(yīng)的TFs結(jié)合，調(diào)控SOD的表達(dá)[27]。這些TFs包括：特異性蛋白1（specificity protein 1，Sp1）發(fā)揮激活作用[28]；激活蛋白1（activator protein 1，AP-1或JUN）可作為阻遏物隔離必需的共激活因子以抑制SOD轉(zhuǎn)錄[29]；神經(jīng)元型一氧化氮合酶（neural nitric oxide synthase，nNOS或NOS1）也能直接結(jié)合Sp1而抑制Sp1與Sod基因啟動(dòng)子結(jié)合[30]；腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，Tnf）可激活JNK/AP1通路下調(diào)SOD啟動(dòng)子活性[31]；CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α、β（CCAAT/enhancer binding protein α,β，C/EBPα、C/EBPβ）通過結(jié)合SOD啟動(dòng)子CCAAT盒直接增強(qiáng)SOD表達(dá)[32-33]。本研究在MCD模型中灌胃大蒜多糖后，隨著添加劑量的增加，肝組織TG逐步減少，MDA也逐漸回復(fù)到接近正常水平，SOD在各個(gè)劑量的大蒜多糖添加后均顯著回復(fù)到正常水平。表明大蒜多糖對(duì)于MAFLD模型中肝組織氧化應(yīng)激的損害作用有可能是依賴于SOD的表達(dá)調(diào)控。

在ROS對(duì)肝組織氧化應(yīng)激的損害同時(shí)，炎癥反應(yīng)也隨即發(fā)生。本研究中，基因Hmox1、Tnf、Ccl2、Cxcl2、Cxcl10在MCD飲食誘導(dǎo)之后表達(dá)量顯著升高（P＜0.05），在大蒜多糖干預(yù)后表達(dá)量又得到顯著回復(fù)（P＜0.05）。其中，Hmox1的表達(dá)產(chǎn)物為血紅素加氧酶1（heme oxygenase 1，HMOX1或HO1），是血紅素分解代謝過程限速酶的氧應(yīng)激誘導(dǎo)型；Tnf的表達(dá)產(chǎn)物為腫瘤壞死因子-α，是兼具誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)等作用的一種促炎細(xì)胞因子，在MAFLD發(fā)生發(fā)展中，腫瘤壞死因子-α主要由肝臟激活的Kupffer細(xì)胞產(chǎn)生，并發(fā)揮主要炎癥因子的作用[14-15,34]；Ccl2的表達(dá)產(chǎn)物為趨化因子（C-C）配體2（CCL2或MCP-1），主要由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞分泌，可促進(jìn)免疫細(xì)胞到組織損傷或感染引起的炎癥位點(diǎn)，參與炎癥反應(yīng)[35-36]；Cxcl2的表達(dá)產(chǎn)物為趨化因子（C-X-C）配體2（CXCL2或MIP-2），能激活粒細(xì)胞，誘導(dǎo)自然殺傷細(xì)胞增殖與活化；Cxcl10的表達(dá)產(chǎn)物為趨化因子（C-X-C）配體10（CXCL10），主要介導(dǎo)Th型炎癥反應(yīng)，在不同類型肝病中普遍表達(dá)降低，且在疾病的發(fā)生、發(fā)展、治療和預(yù)后過程中發(fā)生顯著變化[37]。上述基因不僅表達(dá)量變化一致，還同時(shí)受到核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）信號(hào)通路的調(diào)控。NF-κB蛋白家族可以選擇性地結(jié)合在B細(xì)胞κ-輕鏈增強(qiáng)子上，進(jìn)而調(diào)控許多基因的表達(dá)。在細(xì)胞的炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答等過程中NF-κB起到關(guān)鍵性作用?？梢姡贛AFLD的發(fā)生發(fā)展過程中，炎癥反應(yīng)的出現(xiàn)及受大蒜多糖干預(yù)而恢復(fù)，可能是通過NF-κB信號(hào)通路進(jìn)行調(diào)節(jié)的。

本研究對(duì)影響肝臟脂質(zhì)代謝主要基因的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行了定量研究，包括脂肪酸合成酶基因（Fasn）和乙酰輔酶A羧化酶1基因（Acaca）可轉(zhuǎn)錄表達(dá)肝臟脂質(zhì)合成的關(guān)鍵酶，肉堿脂酰轉(zhuǎn)移酶1α基因（Cpt1a）和酰基輔酶A氧化酶基因（Acox）分別可轉(zhuǎn)錄表達(dá)肝臟線粒體β-氧化關(guān)鍵酶和過氧化物酶體β-氧化關(guān)鍵酶，肝臟脂肪轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因（Cd36）和肝臟脂肪酸結(jié)合蛋白基因（Fabp1）可轉(zhuǎn)錄表達(dá)肝臟攝取游離脂肪酸功能的關(guān)鍵蛋白，載脂蛋白B基因（ApoB）和微粒體甘油三酯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因（Mttp）可轉(zhuǎn)錄表達(dá)參與肝臟脂分泌代謝的關(guān)鍵蛋白。本研究結(jié)果顯示，MCD飲食誘導(dǎo)后，F(xiàn)asn、Cpt1a、Acox、Fabp1和Mttp的表達(dá)量顯著降低（P＜0.05），Cd36的表達(dá)量大幅度提高（P＜0.05），但在大蒜多糖干預(yù)之后只有Cpt1a和Acox兩個(gè)基因的變化得到顯著回復(fù)（P＜0.05），表明在MCD飲食誘導(dǎo)后，肝組織攝入的脂肪量大幅增加且不受大蒜多糖影響，大蒜多糖對(duì)肝組織脂質(zhì)沉積的改善可能是由于對(duì)肝臟脂肪酸β-氧化的促進(jìn)作用。

總體來講，MCD飲食誘導(dǎo)后，小鼠肝細(xì)胞在缺失蛋氨酸和膽堿的情況下無法合成肝磷脂酰膽堿，胞內(nèi)脂質(zhì)不足的錯(cuò)誤信號(hào)導(dǎo)致大量表達(dá)Cd36，進(jìn)而大幅提高了脂質(zhì)攝入量，從而出現(xiàn)了脂質(zhì)在肝細(xì)胞的異常沉積。肝臟脂質(zhì)沉積后代謝主要發(fā)生在肝細(xì)胞線粒體中，而在線粒體氧化磷酸化過程中，O2的不完全還原則會(huì)產(chǎn)生大量ROS，在對(duì)肝細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激損害的同時(shí)，部分ROS發(fā)揮TFs作用與NF-κB抑制蛋白相結(jié)合，激活了NF-κB信號(hào)通路，調(diào)控下游Hmox1、Tnf、Ccl2、Cxcl2、Cxcl10等基因表達(dá)及啟動(dòng)細(xì)胞凋亡進(jìn)程，包括抑制肝細(xì)胞Cpt1a、Acox基因的表達(dá)及脂質(zhì)β-氧化、抑制SOD表達(dá)等作用，大蒜多糖的干預(yù)逆轉(zhuǎn)了上述進(jìn)程。

4 結(jié)論

綜上所述，大蒜多糖的干預(yù)減少或基本消除了MCD飲食導(dǎo)致的肝損傷，MGP組效果比較顯著且添加量適中。具體作用機(jī)制可能是通過NF-κB信號(hào)通路調(diào)控脂質(zhì)代謝和炎性基因表達(dá)，激活了肝細(xì)胞脂質(zhì)β-氧化，減少脂質(zhì)沉積，提高了SOD表達(dá)量，減少了肝細(xì)胞脂質(zhì)過氧化。這些結(jié)論為大蒜多糖在MALFD病情發(fā)展中發(fā)揮改善作用提供了一種潛在的機(jī)制解釋，并表明大蒜多糖作為一種替代功能成分在食品加工領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用潛力。