3,5-二氯水楊醛縮-4-氨基安替比林Cu(II)和Zn(II)配合物的合成、晶體結(jié)構(gòu)及抗腫瘤活性研究

王佳樂,蘇 武,田文豪,張夢瑤,陸飄飄,李文戈

(蚌埠醫(yī)科大學(xué)公共基礎(chǔ)學(xué)院,安徽 蚌埠 233030)

席夫堿是一類穩(wěn)定的亞胺化合物,最初是由德國科學(xué)家雨果·希夫在1864年報道[1],是由羰基和伯胺化合物通過親核加成、重排和脫水反應(yīng)而形成的配位化合物[2]。亞胺或亞甲基在自然界中廣泛地存在,其多存在于各種天然化合物、天然衍生化合物和非天然化合物中。吡唑啉酮類是生物學(xué)、立體化學(xué)、藥理學(xué)、臨床以及分析應(yīng)用的優(yōu)良試劑。4-氨基安替比林是吡唑啉酮一個重要的衍生物[3-4],具有廣泛的生物活性。由于4-氨基安替比林衍生物分子中羰基和亞胺鍵的存在,容易發(fā)生配位,其常被用于配位化學(xué)中,是潛在的優(yōu)良配體,并能夠與金屬離子形配合物[5],從而形成了性能各異的席夫堿金屬配合物,在制藥行業(yè)中已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用[6-7]。

研究表明,4-氨基安替比林衍生物及金屬配合物對細(xì)菌、腫瘤、真菌均有很好的抑制作用[8-10],ROSUNT等[11]報道了4-氨基-2,3-二甲基-1-苯基-3-吡唑啉-5-酮配體的Cu(II)配合物對大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼假桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和念珠菌的生物活性,結(jié)果顯示對大腸桿菌和鮑曼假桿菌表現(xiàn)出高殺菌活性。JOSEYPHUS等[12]研究了咪唑-2-甲醛縮-4-氨基安替比林配體及其Co(II)、Ni(II)、Cu(II)和Zn(II)配合物對HeLa(人類宮頸癌細(xì)胞)和HCT116(結(jié)腸癌細(xì)胞)體外抗腫瘤活性研究,結(jié)果表明對HCT116細(xì)胞和HeLa細(xì)胞表現(xiàn)出有效的抑制作用。張淼[13]利用1-苯基-3-甲基-4-乙?；?5-吡唑啉酮、1-苯基-3-甲基-4-甲酰-5-C1-吡唑和苯甲酰丙酮與4-氨基安替比林席夫堿合成了三種新型芳基吡唑酮縮-4-氨基安替比林希夫堿并研究其對大腸桿菌和枯草芽孢桿菌抗菌活性,結(jié)果顯示其對大腸桿菌和枯草桿菌具有較高抑菌活性。

綜上所述,新型4-氨基安替比林席夫堿配合物具有較好的生物活性,探索抗癌活性好的4-氨基安替比林席夫堿配合物一直是藥物工作者的研究熱點。本文通過采用3,5-二氯水楊醛與4-氨基安替比林合成一個新型的3,5-二氯水楊醛縮-4-氨基安替比林配體,再設(shè)法將3,5-二氯水楊醛縮-4-氨基安替比林配體與金屬離子利用溶劑熱反應(yīng)合成具有一定抗癌活性的3,5-二氯水楊醛縮-4-氨基安替比林金屬配合物,利用X單晶衍射分析配合物的結(jié)構(gòu),并利用MTT法探究3,5-二氯水楊醛縮-4-氨基安替比林配體及金屬配合物在體外抗腫瘤的活性。

1 實驗部分

1.1 試劑及儀器

3,5-二氯水楊醛、4-氨基安替比林(均為化學(xué)純,國藥集團化學(xué)試劑有限公司)、無水乙醇(蘇州嘉鼎化學(xué)科技有限公司)、三乙胺(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)、CuCl2·2H2O、Zn(Ac)2·2H2O(均為蘇州嘉鼎化學(xué)科技有限公司)、DMSO(山東捷世康)均為市售分析純;MTT體外抗腫瘤活性實驗使用的試劑和儀器是順鉑(MCE)、胎牛血清(南京維森特生物技術(shù)有限公司)、MTT(江蘇艾菱菲生物)、6孔和96孔培養(yǎng)板(均為上海一斗生物科技有限公司)、胰蛋白酶(Gibco)、PBS溶液(普諾賽)、人肺癌A549細(xì)胞、人鼻咽癌CNE-2Z細(xì)胞、人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞(均為中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫)。

X射線單晶衍射儀D8 Quest(Bruker Apex Smart Apex II);粉末衍射儀Bruker D8(丹東浩元儀器有限公司);紅外光譜儀Nicolet(Thermo Scientific);熱重分析儀STA449-F5分析儀(Thermo Scientific)。

1.2 配體(HL)、配合物1和2的合成路線

利用3,5-二氯水楊醛與4-氨基安替比林,通過縮合反應(yīng)合成3,5-二氯水楊醛縮-4-氨基安替比林配體,再將3,5-二氯水楊醛縮-4-氨基安替比林配體與金屬Cu(II)、Zn(II)離子利用溶劑熱反應(yīng)合成具有一定抗癌活性的3,5-二氯水楊醛縮-4-氨基安替比林金屬配合物1和配合物2。圖1為配體(HL)、配合物1和配合物2的合成路線。

圖1 配體(HL)、配合物1和2的合成路線

1.3 席夫堿配體(HL)的合成

精確稱取4-氨基安替比林(1.50 g, 7.38 mmol)加入無水乙醇(20 mL)三頸燒瓶(250 mL)中,攪拌溶解,再將精確稱取的3,5-二氯水楊醛(1.41 g, 7.42 mmol)完全溶解于40 mL無水乙醇,將其逐滴加入三頸燒瓶中回流5 h。反應(yīng)完成后,三頸燒瓶底部有黃色沉淀生成,冷卻至室溫,將得到的產(chǎn)物進(jìn)行減壓抽濾得到席夫堿配體粗品,再用無水乙醇洗滌2～3次,常溫下干燥,最終得到淡黃色粉末狀3,5-二氯水楊醛縮-4-氨基安替比林,配體的化學(xué)式為C18H15O2N3Cl2(產(chǎn)率:83 %)。

1.4 配合物[CuL2](配合物1)的合成

精確稱取席夫堿配體3,5-二氯水楊醛縮-4-氨基安替比林(0.01 g, 0.026 6 mmol)和CuCl2·2H2O(0.008 g,0.046 9 mmol)溶解于8 mL無水乙醇液中,最后加入三乙胺調(diào)節(jié)pH為8.7,混合均勻,將溶液轉(zhuǎn)移至體積為20 mL的內(nèi)襯聚四氟乙烯的不銹鋼高壓反應(yīng)釜中,放入烘箱,在67 ℃反應(yīng)72 h后,自然冷卻至室溫,在反應(yīng)瓶底部有墨綠色晶體生成,經(jīng)過濾、洗滌得到墨綠色產(chǎn)品(產(chǎn)率:57%)。

1.5 配合物[ZnL2](配合物2)的合成

Zn(II)配合物的合成方法與Cu(II)合成采用類似的方法,不同的是需溶解于無水乙醇(8 mL),三乙胺調(diào)節(jié)pH為7.2,用Zn(Ac)2·2H2O(0.01 g,0.045 6 mmol)代替了CuCl2·2H2O(0.008 g,0.046 9 mmol),在65 ℃反應(yīng)72 h,得到黃色棒狀晶體(產(chǎn)率:52 %)。

1.6 X-單晶晶體結(jié)構(gòu)分析

選取配體(HL)、配合物1和配合物2,外觀較好、尺寸合適的晶體用于結(jié)構(gòu)解析。單晶的X射線衍射數(shù)據(jù)在160 K和173 K條件下,用經(jīng)過石墨單色器化的MoKα射線(λ=0.710 73 ?)[14],通過單晶X衍射射線測定晶體結(jié)構(gòu),在Siemens Smart CCD衍射儀上收取,并分別使用SHELXS-97[15]和SHELXL-97[16]軟件進(jìn)行結(jié)構(gòu)的求解和細(xì)化。表1列出了配體(HL)、配合物1和配合物2的晶體參數(shù)。

表1 配體(HL)、配合物1和配合物2的晶體學(xué)參數(shù)

1.7 配體HL、配合物1和配合物2的抗腫瘤活性實驗

使用MTT法[17]測定三種人腫瘤細(xì)胞系CNE-2Z、MDA-MB-231和A-549的增殖,將細(xì)胞在37 ℃、5% CO2下,以每孔4×103個細(xì)胞在96孔板中培養(yǎng)24 h,去除培養(yǎng)基,使用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)洗滌細(xì)胞,然后將用DMSO(1%)配制好的席夫堿配體HL、配合物1和配合物2溶液(5 mmol/L),以50、25、12.5、6.25、0 μmol/L的濃度每孔100 μL接種到96孔板,將只含DMSO(1%)不含細(xì)胞的作為對照組,37 ℃、5% CO2下條件下培養(yǎng),72 h后,每孔加入10 μL的MTT溶液(0.5 mg/mL),繼續(xù)培養(yǎng)4 h后,使用微板讀取器在490 nm波長下測量OD值。每樣本濃度重復(fù)5個孔,取平均值計算抑制率和IC50值。

2 結(jié)果與討論

2.1 HL的分子結(jié)構(gòu)

由X射線單晶衍射分析表明,配體3,5-二氯水楊醛縮-4-氨基安替比林(HL)是單斜晶系,屬于P21/n空間群。分子結(jié)構(gòu)如圖2所示,3,5-二氯水楊醛通過亞胺鍵與4-氨基安替比林鍵合,4-氨基安替比林的吡唑環(huán)與3,5-二氯水楊醛的苯環(huán)幾乎共平面。

圖2 HL的分子結(jié)構(gòu)

配體分子堆積如圖3所示,在配體(HL)分子中存在兩種C—H…Π相互作用。配體中4-氨基安替比林苯環(huán)幾乎垂直于另一相鄰的配體的4-氨基安替比林苯環(huán),4-氨基安替比林苯環(huán)上的H17與另一相鄰分子4-氨基安替比林苯環(huán)形成C—H…Π堆積(距離:0.353 69 nm)。配體的3,5-二氯水楊醛苯環(huán)幾乎平行于另一相鄰的4-氨基安替比林吡唑環(huán),3,5-二氯水楊醛苯環(huán)上H2與相鄰吡唑環(huán)形成C—H…Π堆積(距離:0.390 03 nm),最終配體分子通過C—H…Π相互作用堆積形成三維空間結(jié)構(gòu)。

圖3 配體HL的分子通過C—H…Π堆積相互連接(虛線)

2.2 配合物1的晶體結(jié)構(gòu)

配合物1是單核配合物,屬于單斜晶系,空間群為P21/c(表1),圖4是配合物1的分子結(jié)構(gòu)圖,配合物1分子對稱單元由一個Cu(II)原子和兩個分子去質(zhì)子配體(L-)組成。表2和表3分別列出了配合物1的部分鍵長和鍵角。每個Cu(II)離子由兩個O原子(O1,O1′來自配體的3,5-二氯水楊醛羥基O原子)、兩個N原子(N1,N1′來自配體的亞胺鍵的N原子)。中心離子Cu(II)的與配位原子間的鍵角O1—Cu1—N1、O1—Cu1—N1′、O1—Cu1—O′、N1—Cu1—O1′、N1′—Cu1—O1′、N1—Cu1—N1′分別對應(yīng)90.717(9)°、93.640(9)°、154.548(9)°、93.640(9)°、90.717(9)°、160.132(10)°。因此,配合物1的中心離子Cu(II)形成輕微扭曲的四配位的四方形構(gòu)型。

表2 配合物1和配合物2的部分鍵長

表3 配合物1和配合物2的部分鍵角

圖4 配合物1的陽離子分子結(jié)構(gòu)

圖5是配合物1的分子堆積圖,配合物中3,5-二氯水楊醛的苯環(huán)與另一相鄰分子4-氨基安替比林的苯環(huán)幾乎垂直,3,5-二氯水楊醛苯環(huán)上的H6與4-氨基安替比林的苯環(huán)形成C—H…Π堆積(距離:0.342 69 nm)。最終,離散的單體配合物1分子通過C—H…Π相互作用堆積形成三維空間結(jié)構(gòu)。

圖5 配合物1的分子通過C—H…Π堆積相互連接(虛線)

2.3 配合物2的晶體結(jié)構(gòu)

配合物2是單核配合物,屬于單斜晶系,空間群為P21/c(表1),圖6是配合物2的分子結(jié)構(gòu)圖,圖7是配合物2的分子堆積圖。配合物2分子單元由一個Zn(II)原子、兩個去質(zhì)子配體(L-)組成。每個Zn(II)離子由四個O原子配位(O1、O3來自配體的3,5-二氯水楊醛酚羥基O原子,O2、O4來自配體的4-氨基安替比林羰基O原子)和兩個N原子配位(N1、N4來自配體的亞氨基N原子)組成。中心離子Zn(II)的配位原子間的鍵角在84.356(8)°到170.046(10)°之間,因此,配合物2形成了六配位的扭曲的八面體構(gòu)型[18-21]。

圖6 配合物2的陽離子分子結(jié)構(gòu)

圖7 配合物2的分子通過Π…Π堆積相互連接(虛線)

如圖7所示,配體的4-氨基安替比林的苯環(huán)幾乎平行于另一相鄰分子的4-氨基安替比林苯環(huán),形成了面到面的Π…Π堆積(距離:0.384 21 nm),最終,配合物2分子通過Π…Π相互作用堆積形成3D空間結(jié)構(gòu)。

2.4 紅外光譜

由圖8可知,配合物1和配合物2在1 441～1 552 cm-1范圍內(nèi)有吸收峰,主要歸因于亞胺鍵的伸縮振動,相對于配體(HL)而言出現(xiàn)了紅移。配合物1和2在550～581 cm-1范圍內(nèi)有新的吸收峰,主要歸因于N、O原子與金屬形成了配位鍵[22],證實了配體(HL)中的N、O原子分別與金屬形成了配位鍵,結(jié)果表明,紅外分析結(jié)果與配體(HL)、配合物1和配合物2的分子結(jié)構(gòu)一致。

(a)配體HL (b)配合物1 (c)配合物2圖8 化合物的紅外光譜

2.5 X射線粉末衍射圖

在室溫下,采用粉末X射線衍射(PXRD)[23]驗證配合物1、配合物2的結(jié)構(gòu),如圖9所示,合成的配合物1和配合物2樣品的X射線上的衍射數(shù)據(jù)與單晶X射線衍射結(jié)構(gòu)解析數(shù)據(jù)模擬進(jìn)行對比,得到的衍射峰在強度和位置上完全一致,表明合成的配合物的晶體樣品的分子結(jié)構(gòu)與單晶測定的分子結(jié)構(gòu)相同。

(a)配合物1 (b)配合物2圖9 配合物1和配合物2的PXRD圖譜

2.6 熱重分析

對配合物1和配合物2的熱穩(wěn)定性進(jìn)行研究,如圖10所示,TGA分析表明,配合物1具有較高的熱穩(wěn)定性,在260 ℃下質(zhì)量幾乎沒有損失,在260～540 ℃范圍內(nèi)質(zhì)量急劇下降,失重率為44.62%,相當(dāng)于失去一個3,5-二氯水楊醛縮-4-氨基安替比林希夫堿配體分子(計算值為45.98%),700 ℃后整個分子框架持續(xù)分解。配合物2也具有較高的熱穩(wěn)定性,低于265.45 ℃,質(zhì)量幾乎沒有損失,在265.45～550 ℃范圍內(nèi)也出現(xiàn)質(zhì)量急劇下降現(xiàn)象,失重率為44.57%,相當(dāng)于失去一個3,5-二氯水楊醛縮-4-氨基安替比林希夫堿配體分子(計算值:45.87%),高于700 ℃,整個分子框架持續(xù)坍塌。

圖10 化合物的熱重分析TG(A)-DSC(B)

2.7 抗腫瘤活性

使用MTT方法對三種人腫瘤細(xì)胞系CNE-2Z、MDA-MB-231和A-549進(jìn)行體外評估細(xì)胞毒性,檢測其48 h后對三種癌細(xì)胞活性的影響,計算配體(HL)、配合物1和配合物2的IC50值[24]。由表4可以得到,配體(HL)、配合物1和配合物2對三種癌細(xì)胞都具有一定的活性,配合物對癌細(xì)胞的抑制作用普遍比配體好,配合物1對MDA-MB-231細(xì)胞和CNE-2Z細(xì)胞抗增殖活性最好,IC50值分別為(1.215±0.07) μmol/L、(4.417±0.28) μmol/L均低于順鉑的IC50值,說明配合物1對MDA-MB-231癌細(xì)胞和CNE-2Z癌細(xì)胞具有較強的抑制增殖能力。配合物2對A-549細(xì)胞和MDA-MB-231細(xì)胞IC50值分別為(96.37±12.78) μmol/L、(43.26±6.12) μmol/L,也顯示出較好的抑制癌細(xì)胞生長的效果。以上實驗數(shù)據(jù)表明,配合物對癌細(xì)胞的IC50都比配體的IC50低,證明引入Cu(II)、Zn(II)金屬離子增加了配體的抗腫瘤活性,其中配合物1比順鉑更有效地抑制MDA-MB-231和CNE-2Z癌細(xì)胞的增殖。

表4 配體HL、配合物1和配合物2對3種人腫瘤細(xì)胞株體外IC50值

3 結(jié)論

目前GHORAB等[25]研究了利用4-氨基安替比林合成了吡唑、吡咯、嘧啶和吡唑嘧啶的新型氨基安替比林衍生物并對人體乳腺癌細(xì)胞體外抗腫瘤活性研究,結(jié)果表明,具有磺酰胺結(jié)構(gòu)的部分新型吡唑類希夫堿對人體乳腺癌細(xì)胞具有良好的體外抗腫瘤活性,但未明確其準(zhǔn)確的配合物分子結(jié)構(gòu)。本文利用3,5-二氯水楊醛與4-氨基安替比林,通過縮合反應(yīng),合成3,5-二氯水楊醛縮-4-氨基安替比林希夫堿配體(HL),利用溶劑熱反應(yīng)合成了配合物1和配合物2,并用X射線單晶衍射確定配體(HL)、配合物1和配合物2的分子結(jié)構(gòu),其中配合物1是四配位的四方形構(gòu)型的單核配合物,配合物2是六配位的八面體構(gòu)型的單核配合物,通過MTT法測定了配體(HL)、配合物1和配合物2,對3種人腫瘤細(xì)胞株的體外抗腫瘤活性,結(jié)果顯示,配合物1對MDA-MB-231癌細(xì)胞和CNE-2Z癌細(xì)胞具有較強的抑制增殖能力,且IC50值均低于順鉑的IC50值,為抗癌藥物的研發(fā)開辟了新的途徑。