NR／DAPI 共染色－熒光計(jì)數(shù)法測(cè)定自來水中的微塑料

方源， 胡文濤， 汪炎， 梅紅， 宣亮， 王偉， 袁守軍*

（1.合肥工業(yè)大學(xué)土木與水利工程學(xué)院， 合肥 230009； 2.工業(yè)廢水及環(huán)境治理安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 合肥 230088）

微塑料（MPs）一般指尺寸小于5 mm 的塑料顆?；蛩槠?， 廣泛分布于各類環(huán)境中。 MPs 通常具有降解難、 粒徑小、 可吸附有毒物質(zhì)及改變脂質(zhì)和能量代謝等特性［1－2］， 因其對(duì)生態(tài)環(huán)境及人類健康可能產(chǎn)生的負(fù)面影響而備受關(guān)注［3］。 近年來， 有文獻(xiàn)報(bào)道， 在飲用水水源地、 自來水廠及供水管網(wǎng)中檢出MPs， 其豐度范圍通常為每升水中含有幾十個(gè)至數(shù)千個(gè)［4］， 供水行業(yè)中的微塑料污染逐步引起關(guān)注， 精準(zhǔn)了解供水行業(yè)、 特別是管網(wǎng)及水龍頭樣本中MPs 的分布情況有利于供水安全保障工作的有效落實(shí)。

樣品中MPs 的精準(zhǔn)有效測(cè)定是開展相關(guān)研究工作的前提。 盡管對(duì)MPs 的研究已經(jīng)進(jìn)行了多年，但樣品采集、 樣品預(yù)處理、 定量和鑒定的方法還沒有標(biāo)準(zhǔn)化［5］， MPs 的檢測(cè)方法也呈現(xiàn)多樣化， 主要包括目視法［6］、 光譜法［7］（傅里葉紅外光譜和拉曼光譜）以及熒光染色法［8－9］等。 拉曼光譜法是目前公認(rèn)的較為準(zhǔn)確可靠的MPs 檢測(cè)方法， 但由于檢測(cè)時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)及儀器普及性等問題限制了其被廣泛使用。 Shim 等［10］提出了尼羅紅（Nile Red， NR）染色法， 其特點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單、 反應(yīng)迅速， 可以識(shí)別出微米級(jí)粒徑的小尺寸MPs［11］。 但NR 染色法最嚴(yán)重的缺點(diǎn)是對(duì)有機(jī)質(zhì)的染色， 這會(huì)導(dǎo)致MPs 數(shù)量被高估40%～100%［12］。 為了解決這一問題， 研究發(fā)現(xiàn)使用NR 和4′，6－二脒基－2－苯基吲哚（DAPI）共染色能有效去除天然有機(jī)物［13］和微生物衍生的有機(jī)物， 這使得熒光染色法的準(zhǔn)確性得到了提升。 此外， 樣品在檢測(cè)過程中， 各操作環(huán)節(jié)引起的交叉污染也是影響測(cè)定結(jié)果的重要因素， 目前類似研究鮮見報(bào)道。 針對(duì)這一問題， 本研究擬開展對(duì)樣品的預(yù)處理及試驗(yàn)操作條件優(yōu)化研究， 以期降低交叉污染， 提高NR／DAPI 共染色－熒光計(jì)數(shù)法測(cè)定自來水中MPs 的可靠性與準(zhǔn)確度。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

NR（98.0%）、 DAPI（90.0%）、 熒光標(biāo)記聚苯乙烯（PS）顆粒標(biāo)準(zhǔn)品（5 ～100 μm）， 均為市售商品。

玻璃纖維濾膜（GF／F，φ47 mm， 孔徑為0.7 μm）和無機(jī)氧化鋁濾膜（φ25 mm， 孔徑為0.2 μm）， 均為市售商品。

TX73－DP 型研究級(jí)倒置熒光顯微鏡、 Nicolet IS50 iN10 型顯微傅里葉紅外光譜儀、 DHG－9140A型干燥箱、 SX2－8－10N 型馬弗爐。

1.2 自來水樣品采集

（1） 隨機(jī)樣品采集。 2023 年2 ～3 月期間， 在合肥市不同行政區(qū)域內(nèi)采集自來水龍頭樣本， 共計(jì)5 個(gè)采樣點(diǎn)， 記為S1 ～S5， 其中S1、 S3 和S4 為城鎮(zhèn)居民住宅樣本， S2 為高校實(shí)驗(yàn)室樣本， S5 為商業(yè)區(qū)樣本； S2、 S3 和S5 樣本來自同一水源， S1 和S4 分別來自不同水源。 采樣過程中， 先打開自來水龍頭， 收集約100 mL 水樣于1 L 高硼硅廣口瓶（預(yù)先500 ℃灼燒1 h）中， 振蕩潤(rùn)洗10 s， 然后倒掉水樣， 重復(fù)潤(rùn)洗2 次， 再采集約1 000 mL 水樣，加蓋密封， 立即送至實(shí)驗(yàn)室， 24 h 內(nèi)分析水樣中MPs 的濃度及組成情況。

（2） 不同時(shí)刻水樣采集。 為了研究自來水中MPs 時(shí)間分布特征， 在S2 采樣點(diǎn)開展不同時(shí)刻水樣采集及MPs 分析， 分別于早晨（6∶00）、 中午（12∶00）和傍晚（18∶00）采集水樣（n ＝3）， 具體采集方法與隨機(jī)樣品采集方法相同。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 加標(biāo)回收試驗(yàn)

采用加標(biāo)回收的方法， 考察過濾環(huán)節(jié)對(duì)MPs顆粒的收集效率。 選用熒光標(biāo)記的MPs 顆粒作為研究對(duì)象， 試驗(yàn)結(jié)果不受玻璃器皿中殘留的MPs顆粒干擾， 因此， 加標(biāo)回收試驗(yàn)過程中未對(duì)玻璃器皿進(jìn)行灼燒處理。 燒杯內(nèi)倒入250 mL 濾后試驗(yàn)用水， 然后加入熒光標(biāo)記的MPs 顆粒， 由于MPs 粒徑較?。? μm 和20 μm）， 無法做到精確加標(biāo)， 因此在試驗(yàn)中僅控制不同的加標(biāo)濃度梯度， 范圍分別為： ＜100、 100 ～200、 200 ～300、 300 ～400 和400 ～500 個(gè)／L）， 并以60 r／min 攪拌30 min， 使加標(biāo)后的MPs 均勻分布； 然后采用全玻璃過濾裝置（孔徑0.7 μm 玻璃纖維濾膜）過濾收集MPs 顆粒，使用熒光倒置顯微鏡測(cè)定MPs 的濃度， 測(cè)定量與加標(biāo)量的比值即為加標(biāo)回收率。

1.3.2 預(yù)處理對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響

（1） 水樣預(yù)處理。 為了避免有機(jī)微粒對(duì)試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響， 試驗(yàn)中采用30%H2O2對(duì)水樣進(jìn)行預(yù)氧化處理， 主要考察H2O2濃度（VH2O2∶VH2O＝1 ∶2.5、 1 ∶5）和消解時(shí)間（24、 48 h）等參數(shù)對(duì)NR／DAPI 共染色－熒光計(jì)數(shù)法對(duì)MPs 定量結(jié)果的影響。

（2） 試驗(yàn)用水、 器具的處理。 試驗(yàn)用水、 玻璃器皿、 濾膜等材料中的MPs 顆粒可能會(huì)帶入樣品中， 造成測(cè)定結(jié)果被不同程度高估， 因此對(duì)試驗(yàn)用水及器具的預(yù)處理尤為重要。 試驗(yàn)分別考察清洗方法（常規(guī)清洗、 超聲清洗）及干燥（灼燒）條件（300 ～500 ℃， 1 ～3 h）對(duì)NR／DAPI 共染色－熒光計(jì)數(shù)法對(duì)MPs 定量結(jié)果的影響。 試驗(yàn)用水為超純水， 使用前經(jīng)0.7 μm 玻璃纖維濾膜（已經(jīng)500 ℃灼燒1 h 處理）過濾， 經(jīng)測(cè)定， 濾后水中MPs 濃度較低， 對(duì)試驗(yàn)影響較小。

1.3.3 MPs 的定性與定量測(cè)定

采用上述優(yōu)化后的方法， 對(duì)實(shí)際水樣中的MPs進(jìn)行定性和定量分析。

（1） MPs 顆粒定性分析。 水樣先經(jīng)過0.2 μm無機(jī)氧化鋁濾膜過濾， 然后以顯微傅里葉變換紅外光譜儀對(duì)膜上MPs 進(jìn)行定性分析。 通過透射模式（光譜范圍為4 000 ～1 100 cm－1， 掃描步長(zhǎng)為50 μm）對(duì)MPs 粒子進(jìn)行掃描分析（光譜分辨率為4 cm－1， 64次疊加掃描）， 然后將每個(gè)樣品譜與標(biāo)準(zhǔn)參考庫(kù)進(jìn)行比對(duì)定性。

（2） MPs 顆粒定量分析。 取預(yù)處理后的水樣200 mL 倒入全玻璃過濾裝置， 經(jīng)0.7 μm 玻璃纖維濾膜過濾； 然后向?yàn)V杯中加入10 mL 超純水， 并依次加入NR 和DAPI， 使其質(zhì)量濃度分別為10 mg／L和0.5 mg／L。 樣品避光放置30 min 以保證充分染色， 過濾得到染色樣品。 將附有被染色MPs 的濾膜置于玻璃培養(yǎng)皿中， 在45 ℃下干燥12 h。 最終使用熒光倒置顯微鏡對(duì)膜上的MPs 進(jìn)行計(jì)數(shù)定量，使用Image J 確定MPs 顆粒的尺寸。 同時(shí)， 將測(cè)定結(jié)果與拉曼光譜法進(jìn)行比對(duì)， 從而評(píng)價(jià)該測(cè)定方法的準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果與討論

2.1 加標(biāo)回收率

熒光染色法對(duì)不同濃度梯度MPs 的加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果如圖1 所示， 在加標(biāo)濃度梯度范圍內(nèi)， 5 μm 和20 μm 的MPs 加標(biāo)回收率均保持在90% ～96%。 這表明熒光染色法表現(xiàn)出良好的回收效率。共存有機(jī)物的干擾和外界MPs 污染是熒光染色法必須面對(duì)的2 個(gè)挑戰(zhàn)［14］， 而該試驗(yàn)中， 投加的是熒光標(biāo)記的MPs， 故回收率試驗(yàn)不涉及樣品預(yù)處理及試驗(yàn)用品交叉污染等因素。

圖1 熒光染色法對(duì)不同濃度梯度MPs 的回收率Fig.1 Recovery of MPs with different concentration gradients using fluorescence staining method

2.2 預(yù)處理對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響

2.2.1 水樣消解預(yù)處理

取自實(shí)驗(yàn)室的自來水樣經(jīng)不同預(yù)處理?xiàng)l件處理后， 采用NR／DAPI 共染色－熒光計(jì)數(shù)法測(cè)定的MPs濃度， 結(jié)果如圖2 所示。 依據(jù)GB 5749—2022《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》， 自來水中ρ（CODMn）＜3.0 mg／L， 自來水樣品雖然相對(duì)較為清潔， 但水中殘留的少量有機(jī)物（如腐殖質(zhì)、 有機(jī)助凝劑等）仍會(huì)影響熒光染色法對(duì)MPs 的測(cè)定結(jié)果， 相對(duì)于采用H2O2消解處理， 未進(jìn)行消解預(yù)處理樣品中MPs 濃度被顯著高估［15］， 因此， 消解預(yù)處理步驟不可缺少。 不同消解條件對(duì)MPs 的測(cè)定結(jié)果亦存在影響， H2O2濃度增加及消解時(shí)間延長(zhǎng)， 均可能導(dǎo)致水樣中細(xì)小的MPs 被氧化分解， 造成MPs 的測(cè)定結(jié)果被低估。在VH2O2∶VH2O＝1 ∶5， 消解時(shí)間24 h 條件下， 樣品消解后， 采用熒光染色法的測(cè)定結(jié)果與拉曼光譜法接近。 因而， 確定該消解條件作為自來水樣品消解預(yù)處理的最佳條件。

圖2 預(yù)處理方法對(duì)MPs 定量的影響Fig.2 Effect of pretreatment methods on MPs quantification

2.2.2 試驗(yàn)器具預(yù)處理

玻璃纖維濾膜及玻璃器皿中的MPs 污染對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響不可忽視， 采用過濾后的實(shí)驗(yàn)室超純水定期清洗無法有效去除其中的MPs（圖3）， 這可能是因?yàn)镸Ps 具有較高的比表面積、 較強(qiáng)的吸附能力和疏水性， 使其容易附著在玻璃器皿壁上［16］。針對(duì)這一問題， 采用了更劇烈的方法， 即超聲清洗和灼燒， 并對(duì)其效果進(jìn)行了研究。 盡管超聲清洗比常規(guī)清洗表現(xiàn)出更高的去除玻璃器皿中背景MPs 的能力， 但超聲清洗后玻璃器皿中的MPs 濃度仍保持在較高水平。 值得注意的是， 與常規(guī)清洗相比， 玻璃器皿在200 ℃灼燒3 h 后MPs 濃度下降了73%， 在500 ℃灼燒1 h 后MPs 濃度下降了97%。 此外， 粒徑分布分析表明， 玻璃器皿中粒徑小于20 μm 的MPs 在200 ℃灼燒3 h 后的去除效率低于70%， 而玻璃器皿中所有粒徑的MPs 在500 ℃灼燒1 h 后的去除率均保持在95%以上（圖3a）。 這表明在500 ℃下灼燒1 h 可有效消除MPs 污染。 雖然大多數(shù)塑料的熔點(diǎn)低于200 ℃， 但其熱分解溫度大于355 ℃［17］， 200 ℃的灼燒溫度只能使MPs 熔化， 不能在有限時(shí)間內(nèi)完全去除。 當(dāng)溫度達(dá)到高于塑料熱分解點(diǎn)500 ℃時(shí)， MPs 可以快速分解去除［18－19］。 這為500 ℃灼燒1 h 能有效去除背景MPs 污染提供了合理的解釋。

圖3 預(yù)處理前后玻璃纖維濾膜和玻璃器皿中的MPs的尺寸分布Fig.3 Size distribution of MPs in glass fiber filter membrane and glassware before and after pretreatment

實(shí)驗(yàn)室自來水樣品經(jīng)H2O2（VH2O2： VH2O＝1 ∶5）消解24 h， 玻璃器皿及濾膜經(jīng)500 ℃灼燒1 h， 可顯著消除自來水樣品中的有機(jī)物干擾及試驗(yàn)操作引起的污染， 試驗(yàn)結(jié)果如圖4 所示。 水樣采用熒光染色計(jì)數(shù)法（圖4 中預(yù)處理＋NR／DAPI）測(cè)定MPs 的結(jié)果與拉曼光譜法相當(dāng)， 可解決常規(guī)NR／DAPI 方法結(jié)果被顯著高估的問題。

圖4 不同方法對(duì)自來水樣品中MPs 測(cè)定結(jié)果Fig.4 Determination results of MPs in tap water samples by different methods

2.3 自來水中MPs 分布

2.3.1 自來水中MPs 濃度

采用優(yōu)化后的NR／DAPI 共染色－熒光計(jì)數(shù)法對(duì)不同來源的水樣進(jìn)行測(cè)定， MPs 測(cè)定結(jié)果見圖5。

圖5 不同自來水樣本中MPs 的濃度Fig.5 Concentrations of MPs in different tap water samples

合肥市區(qū)5 個(gè)采樣點(diǎn)自來水樣品中， MPs 的平均濃度范圍為350 ～1 250 個(gè)／L； 值得關(guān)注的是，S2、 S3 和S5 采樣點(diǎn)源于同一水源， 但MPs 濃度存在顯著差異。 可見， 自來水樣品中MPs 濃度可能與較多因素相關(guān)， 如地域、 水源、 環(huán)境、 管材種類與老化程度等［20］。

2.3.2 MPs 類型與濃度分析

自來水樣品中的MPs 經(jīng)顯微傅里葉紅外光譜儀定性比對(duì)、 定量計(jì)數(shù)后， 可得出不同類型MPs顆粒的濃度， 由此可統(tǒng)計(jì)出水樣中不同材質(zhì)MPs的比例， 以S3 和S5 水樣為例， 結(jié)果如圖6 所示。水樣S3 和S5 中， PE 占比最高， 這可能與供水管材相關(guān)； 盡管這2 個(gè)水樣均來自同一水源， 但在管網(wǎng)中所處位置及管材老化程度等的不同， 結(jié)果亦存在差異。

圖6 MPs 顆粒的種類統(tǒng)計(jì)Fig.6 Type statistics of MPs particles

2.3.3 MPs 尺寸與形狀分析

自來水樣本中MPs 的尺寸和形狀分布如圖7所示。 尺寸小于10 μm 的MPs 占比較高（36% ～71%）， 可見， 自來水廠過濾等工藝對(duì)較大粒徑MPs 具有較好的截留去除作用。 檢測(cè)到的MPs 大多數(shù)呈碎片狀， 這可能與塑料碎裂的過程有關(guān)， 碎片含量多可能是由于尺寸較大的MPs 隨著水流運(yùn)動(dòng)過程中受到剪切力而被分解成碎片， 另一方面是因?yàn)楣芫W(wǎng)中MPs 的釋放［21］。 纖維狀MPs 主要來源于化纖織物（衣物）， 原水中的塑料纖維經(jīng)凈水廠濾池過濾后被有效去除， 因而出廠水及管網(wǎng)（龍頭）樣本中纖維狀MPs 的比例較低。

圖7 自來水樣品中MPs 的尺寸和形狀分布Fig.7 Particle size and shape distribution of MPs in tap water samples

2.3.4 自來水樣品中MPs 的時(shí)間分布特征

在同一采樣點(diǎn)， 不同時(shí)刻水樣中MPs 的濃度存在差異， 結(jié)果如圖8 所示， 早晨水樣中的MPs濃度明顯高于其他時(shí)間段的水樣， 這是由于在夜間， 用戶對(duì)供水需求低， 管網(wǎng)中的自來水較長(zhǎng)時(shí)間處于靜置狀態(tài)， 水中的MPs 發(fā)生沉降并在緩慢水流推動(dòng)作用下， 向取水口（水龍頭）聚集［21］， 導(dǎo)致早晨初放水中MPs 濃度顯著增高。

圖8 不同時(shí)刻MPs 的分布特征Fig.8 Distribution of MPs at different moments

3 結(jié)論

（1） 自來水中的有機(jī)物及試驗(yàn)過程中的交叉污染均會(huì)導(dǎo)致常規(guī)NR／DAPI 共染色－熒光計(jì)數(shù)法測(cè)定MPs 的結(jié)果被高估， 對(duì)水樣及試驗(yàn)器具進(jìn)行合理預(yù)處理可解決這一問題， 處理方法為： 自來水樣品采用30%H2O2（VH2O2∶VH2O＝1∶5）消解24 h；試驗(yàn)玻璃器皿材料在使用前經(jīng)500 ℃灼燒1 h， 以去除MPs 殘留。

（2） 合肥市不同區(qū)域的5 個(gè)自來水樣本調(diào)研結(jié)果表明， 水樣中的MPs 平均濃度范圍為350 ～1 250個(gè)／L， 且以PE 為主， 小于10 μm 的MPs 占比較高， 碎片狀MPs 占比最大。

（3） 不同時(shí)刻， 同一采樣點(diǎn)的水樣中MPs 濃度存在差異， 早晨樣品中MPs 濃度高于其他時(shí)段。