內(nèi)環(huán)化聚(β-氨基酯)的制備與生物物理性能

雍海洋，李智立，郭 蕊，周德重

（西安交通大學(xué)化學(xué)工程與技術(shù)學(xué)院,西安 710049）

聚合物的性能不僅與化學(xué)組成和分子量有關(guān)，還與聚合物的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)密切相關(guān).除了常見的線性結(jié)構(gòu)，支化、星形、環(huán)狀及刷型結(jié)構(gòu)的聚合物近年來備受關(guān)注［1～9］.環(huán)化聚合物由于其獨(dú)特的環(huán)狀結(jié)構(gòu)而具有較小的回轉(zhuǎn)半徑和流體力學(xué)體積、較低的熔體黏度和較高的熱穩(wěn)定性［10～12］.這類聚合物也逐漸被用于制備熱穩(wěn)定的自組裝膠束及低毒性的基因轉(zhuǎn)染材料等［3，13，14］.目前環(huán)狀聚合物的制備主要有擴(kuò)環(huán)和閉環(huán)兩種方法.然而由于兩種聚合策略均存在局限性，開發(fā)易于合成、反應(yīng)條件溫和的制備環(huán)化聚合物的方法仍然十分迫切.目前，通過調(diào)控聚合反應(yīng)動(dòng)力學(xué)中生長鏈的濃度和生長邊界，已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了采用原子轉(zhuǎn)移自由基聚合（ATRP）和可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移（RAFT）自由基聚合制備內(nèi)環(huán)化的聚丙烯酸類聚合物，它們在基因遞送、抗菌涂料、光子晶體水凝膠等應(yīng)用中展現(xiàn)出優(yōu)異的性能［4，15～21］.但可控聚合反應(yīng)條件相對復(fù)雜、單體轉(zhuǎn)化率低及聚合物不易降解等問題限制了其進(jìn)一步應(yīng)用.

聚（β-氨基酯）由于單體來源廣泛、合成條件溫和、分子結(jié)構(gòu)易調(diào)節(jié)、主鏈易于降解，被認(rèn)為是一種安全高效的生物材料［3，22～27］.目前，雖然支化結(jié)構(gòu)和星形結(jié)構(gòu)的聚（β-氨基酯）因具備優(yōu)異的物化性能而被大量應(yīng)用于基因遞送，但對環(huán)化結(jié)構(gòu)的聚（β-氨基酯）的研究仍然較少.本課題組［3］通過邁克爾加成反應(yīng)和自由基引發(fā)的閉環(huán)策略制備了一種內(nèi)環(huán)化聚（β-氨基酯）（cPBAE）.與線性聚合物相比，環(huán)化聚合物由于具有緊密的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)而具備更強(qiáng)的DNA壓縮能力、較小的納米顆粒尺寸、更高的基因轉(zhuǎn)染效率和較低的細(xì)胞毒性.這種方法需要極稀的單體濃度（1×10-6mol/L）以避免分子間發(fā)生交聯(lián)，存在單體轉(zhuǎn)化率低等問題，限制了該方法的規(guī)?；瘧?yīng)用.本文以三羥甲基丙烷三丙烯酸酯（TMPTA）和4-嗎啉丙胺（MPA）為單體，通過調(diào)控反應(yīng)的投料比和單體濃度等條件制備內(nèi)環(huán)化聚（β-氨基酯），利用凝膠滲透色譜儀（GPC）和核磁共振波譜儀（NMR）對聚合物結(jié)構(gòu)和組成進(jìn)行分析，使用原子力顯微鏡（AFM）、酸堿滴定、凝膠電泳和阿爾瑪藍(lán)染色實(shí)驗(yàn)對聚合物的生物物理性能進(jìn)行分析.結(jié)果表明：隨著環(huán)化度的增加，聚（β-氨基酯）對DNA的壓縮能力增強(qiáng)，降解速率加快，質(zhì)子緩沖能力增加，但對細(xì)胞的毒性也增大.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

三羥甲基丙烷三丙烯酸酯（TMPTA），純度95%，上海邁瑞爾生化科技有限公司；4-嗎啉丙胺（MPA），分析純，上海麥克林生化科技有限公司；支化聚乙烯亞胺（bPEI，Mw=25000），純度99%，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；二甲基亞砜（DMSO），無水級，上海阿拉丁生化股份有限公司；乙醚，分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；二甲基甲酰胺（DMF），色譜級，上海麥克林生化科技有限公司；氘代氯仿（CDCl3），純度99.8%，上海阿達(dá)瑪斯試劑有限公司；瓊脂糖，生物級，長沙艾科瑞生物科技有限公司；醋酸-醋酸鈉緩沖液（HAc-NaAc，pH=5.2，25 mmol/L）、細(xì)胞培養(yǎng)液、胰酶和血清，生物級，以色列BI 公司；阿爾瑪藍(lán)，生物級，上海源葉生物科技有限公司；DNA，生物級，美國Aldevron公司.

JNM-ECZ400S/L1型核磁共振波譜儀（NMR），日本JEOL公司；Agilent 1260 infinity Ⅱ型凝膠滲透色譜儀（GPC），美國安捷倫公司；Cypher ES 型原子力顯微鏡（AFM），英國牛津儀器公司；Synergy Hybrid H1型酶標(biāo)儀，美國Biotek公司；IS128FD型pH儀，上海儀邁儀器科技有限公司.

1.2 實(shí)驗(yàn)過程

1.2.1 內(nèi)環(huán)化聚（β-氨基酯）的制備 通過調(diào)控TMPTA 和MPA 的投料比制備不同拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的聚合物.將0.90 g（6.25 mmol）MPA 和1.48 g（5 mmol）TMPTA 溶解在2.38 g DMSO 中用于制備cPBAE-1；將1.44 g（10 mmol）MPA 和1.48 g（5 mmol）TMPTA 溶解在8.76 g DMSO 中用于制備cPBAE-2.于90 ℃反應(yīng)，待分子量約為8000時(shí)停止反應(yīng)，并將含0.9 g（6.25 mmol）MPA的11 g DMSO加入到反應(yīng)液中進(jìn)行室溫封端24 h.通過使用乙醚進(jìn)行沉淀提純聚合物，于25 ℃真空干燥24 h后放置在-20 ℃冰箱中.

1.2.2 GPC測試 分別取10 mg聚合物樣品溶解在1 mL DMF中，經(jīng)過0.2 μm的濾頭過濾后，使用GPC測試數(shù)均分子量（Mn）、重均分子量（Mw）、分子量分布（PDI）及Mark-Houwink曲線指數(shù)α值.

1.2.3 NMR測試 分別取5 mg聚合物樣品溶解在600 μL CDCl3中，通過NMR測試聚合物組成.

1.2.4 AFM表征 首先將聚合物配制成1 mg/mL的丙酮溶液，然后滴在云母片上，揮發(fā)約12 h后進(jìn)行AFM表征.

1.2.5 降解性能評價(jià) 將聚合物樣品先溶解在DMSO中配制成100 mg/mL的儲備液，然后用醋酸-醋酸鈉緩沖液稀釋到5 mg/mL 并放置在37 ℃的水浴鍋中.分別在4，8 和16 h 取1 mL 溶液，凍干處理后用GPC檢測分子量.降解度定義為：降解聚合物的分子量除以聚合物的原始分子量.

1.2.6 質(zhì)子緩沖能力測試 通過酸堿滴定測試聚合物的質(zhì)子緩沖能力.將50 μL 儲備液（100 mg/mL）稀釋在30 mL 去離子水中，將pH 值調(diào)節(jié)至3.0，然后滴加100 μL 濃度為0.01 mol/L 的NaOH 溶液后記錄pH值.繼續(xù)滴加NaOH溶液，直至pH值為10時(shí)停止.

1.2.7 凝膠電泳實(shí)驗(yàn) 首先將DNA 稀釋在10 μL 的醋酸-醋酸鈉緩沖液中，然后將聚合物儲備液添加到上述溶液中并渦旋15 s后室溫孵育30 min.每個(gè)樣品DNA用量為1 μg，聚合物與DNA的質(zhì)量比分別設(shè)定為5∶1，10∶1和20∶1.將單獨(dú)的DNA設(shè)為陰性對照；bPEI設(shè)為陽性對照，bPEI與DNA的質(zhì)量比設(shè)定為10∶1和20∶1.然后將孵育好的樣品溶液加入到含SYBR Safe DNA染色劑的瓊脂糖凝膠（1%，質(zhì)量分?jǐn)?shù)）孔中，在120 mV電壓下電泳30 min.

1.2.8 細(xì)胞毒性評價(jià) 使用宮頸癌細(xì)胞HeLa進(jìn)行毒性評價(jià).將細(xì)胞以20000個(gè)/孔的密度接種在96孔板上，待細(xì)胞匯合度達(dá)到80%左右時(shí)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn).將100 mg/mL的聚合物樣品儲備液0.1，0.2，0.5和1.0 μL稀釋在100 μL培養(yǎng)基中，得到聚合物濃度為100，200，500和1000 μg/mL的培養(yǎng)基溶液，渦旋10 s后，將含聚合物的培養(yǎng)基添加到孔內(nèi)，在37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后測定細(xì)胞毒性.棄去舊培養(yǎng)基，加入100 μL 用PBS 稀釋的阿爾瑪藍(lán)（質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%）溶液后，繼續(xù)在37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)40 min，然后使用酶標(biāo)儀測試熒光強(qiáng)度（λex/λem=530/590）.沒有經(jīng)過聚合物處理的細(xì)胞熒光強(qiáng)度定義為100%，同時(shí)使用濃度為100，200和500 μg/mL的bPEI作為對照組.

2 結(jié)果與討論

2.1 cPBAE的表征

利用GPC和1H NMR對聚合物的分子量和化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征.圖1為不同條件下制備的cPBAE的GPC 曲線，分子量在6300～8800 之間，cPBAE-2 的分子量分布比cPBAE-1 窄，這是由于cPBAE-1 的分子量相對較大造成的.通過Mark-Houwink 曲線的指數(shù)α值分析聚合物的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，一般線性聚合物的α值介于0.5～1.0之間，而環(huán)化聚合物的α值會(huì)低于0.5［15，24］.從表1 可知，cPBAE-1 的α值為0.29，而cPBAE-2的α值是0.40，所以cPBAE-1 的環(huán)化度大于cPBAE-2.

Table 1 GPC and 1H NMR results of cPBAE-1 and cPBAE-2

Fig.1 GPC trace of cPBAE-1(a) and cPBAE-2(b)

圖2（B）和（C）分別為cPBAE-1和cPBAE-2的1H NMR 譜圖.cPBAE-1中［MPA］/［TMPTA］化學(xué)組成比高于投料比，cPBAE-2 中［MPA］/［TMPTA］化學(xué)組成比低于投料比（表1）.cPBAE-1 中［MPA］/［TMPTA］化學(xué)組成比為1.46，低于cPBAE-2的1.59，說明MPA更多地參與形成環(huán)化結(jié)構(gòu)，而非線性結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步證明cPBAE-1 的環(huán)化度大于cPBAE-2.上述結(jié)果表明，通過控制單體的投料比和濃度可以得到cPBAE.與傳統(tǒng)的“活性/可控”聚合方法制備內(nèi)環(huán)化聚合物主要通過調(diào)控單體與鏈轉(zhuǎn)移劑或者引發(fā)劑投料比以及單體濃度相比［4，15，17，21］，通過一步法邁克爾加成反應(yīng)制備不同環(huán)化度聚合物的條件更加溫和，成本更低，更利于規(guī)?；a(chǎn)，且更易于調(diào)控聚合物的環(huán)化度.

Fig.2 Chemical structure of cPBAE(A) and 1H NMR spectra of cPBAE-1(B) and cPBAE-2(C)

圖3（A）和（B）分別為cPBAE-1和cPBAE-2的AFM圖片.cPBAE-1既有圓形又有橢圓形的顆粒，而且顆粒尺寸分布較寬，這可能是由于兩種聚合物具有不同的親水性，cPBAE-2比cPBAE-1含有更多的MPA組分，因此具有相對更強(qiáng)的親水性，在制備AFM測試樣品干燥過程中，不同分子間更難團(tuán)聚，因而呈現(xiàn)出更加均一的形貌和更小的顆粒尺寸.

Fig.3 AFM images of cPBAE-1(A) and cPBAE-2(B) nanoparticles

2.2 降解性能

由圖4可見，聚合物在醋酸-醋酸鈉緩沖液中可以發(fā)生降解，導(dǎo)致分子量降低.其中cPBAE-1的降解速率更快，4 h后，分子量即降低為原分子量的一半，而cPBAE-2需要8 h分子量才降低為原分子量的一半.16 h后，cPBAE-1和cPBAE-2的分子量分別減少了約80%，表明cPBAE可以在短時(shí)間內(nèi)降解，這將有利于降低聚合物的細(xì)胞毒性.

Fig.4 Degradation profiles of cPBAE-1(a) and cPBAE-2(b) in HAc-NaAc buffer(A) and the corresponding degree of degradation(B)

目前環(huán)化聚合物的主鏈多為碳-碳鍵，降解性能差，引入二硫鍵可以提高聚合物的降解能力［18］.cPBAEs的主鏈結(jié)構(gòu)含有大量酯鍵，能夠在水中通過自發(fā)水解而發(fā)生降解，從而降低聚合物在細(xì)胞體內(nèi)富集而導(dǎo)致的細(xì)胞毒性.因此，該類內(nèi)環(huán)化聚合物不僅合成方法簡單，而且具備潛在的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用價(jià)值.

2.3 質(zhì)子緩沖能力

聚合物的質(zhì)子緩沖能力與聚合物顆粒在溶酶體中的逃逸能力緊密相關(guān)，具有強(qiáng)質(zhì)子緩沖能力的聚合物能夠有效地保護(hù)所遞送的藥物分子，避免被溶酶體降解.由圖5 可見，bPEI 由于有大量的三級氨，其質(zhì)子緩沖能力最強(qiáng).cPBAE-1 的質(zhì)子緩沖能力比cPBAE-2強(qiáng)，這是因?yàn)镸PA更多地參與到成環(huán)過程而形成了大量的三級氨；而環(huán)化度低意味著更多的MPA位于聚合物鏈末端而沒有轉(zhuǎn)化為三級氨.這表明環(huán)化度更高的聚（β-氨基酯）具有更多的三級氨和更高的質(zhì)子緩沖能力，從而具有更強(qiáng)的溶酶體逃逸能力.

Fig.5 Proton buffering capacity of cPBAE-1(a),cPBAE-2(b) and bPEI(c)

2.4 DNA壓縮性能

作為基因遞送的第一步，聚合物對DNA的壓縮能力直接影響其基因負(fù)載量和對基因的保護(hù)能力.圖6（A）示出了cPBAEs和bPEI在不同條件下對DNA的壓縮能力.bPEI在聚合物/DNA質(zhì)量比為10∶1和20∶1 條件下都具有優(yōu)異的DNA 壓縮能力而沒有觀察到明顯的DNA 遷移條帶；與cPBAE-2 相比，cPBAE-1的DNA壓縮能力更強(qiáng)，其中聚合物/DNA質(zhì)量比為20∶1時(shí)的結(jié)果優(yōu)于5∶1時(shí)的，說明增加聚合物的用量可以提高其對DNA的壓縮性能.

Fig.6 DNA condensation capacity of cPBAEs and bPEI at various mass ratios(A) and cell viability of HeLa cells after incubation with cPBAEs and bPEI(B)

2.5 細(xì)胞毒性

由圖6（B）可以看出，在24 h內(nèi)，cPBAEs 對細(xì)胞的毒性較低，而經(jīng)bPEI 培養(yǎng)后細(xì)胞成活率只有不到10%.隨著聚合物濃度增加，cPBAE-2仍然呈現(xiàn)較低的細(xì)胞毒性，即使在1000 μg/mL 的高濃度條件下，細(xì)胞成活率也幾乎沒有受到影響.相反，cPBAE-1隨著聚合物的濃度增加而呈現(xiàn)出一定的毒性，但在500 μg/mL下細(xì)胞成活率仍然保持在90%左右，當(dāng)聚合物濃度為1000 μg/mL時(shí)，細(xì)胞成活率降低至60%，說明環(huán)化度增加會(huì)增加cPBAEs的細(xì)胞毒性.與bPEI相比，cPBAEs只有在極高的濃度下才表現(xiàn)出一定的細(xì)胞毒性，這主要?dú)w因于其良好的自發(fā)水解性能，表明cPBAEs 在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有應(yīng)用潛力.

3 結(jié)論

拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)作為影響聚合物性能的重要參數(shù)之一受到了越來越多的關(guān)注.本文通過調(diào)控聚（β-氨基酯）合成過程中的單體投料比得到環(huán)化結(jié)構(gòu)的聚合物.研究結(jié)果表明：較低的［MPA］/［TMPTA］投料比和較高的單體濃度可制得環(huán)化度高的聚合物cPBAE-1，其Mark-Houwink曲線α值為0.29，聚合物為圓形和橢圓形顆粒，分布較寬；相反，較高的［MPA］/［TMPTA］投料比和較低的單體濃度可制得環(huán)化度較低的聚合物cPBAE-2，其Mark-Houwink曲線α值為0.40，聚合物為圓形顆粒.此外，研究結(jié)果還表明，隨著環(huán)化度的增加，聚（β-氨基酯）對DNA壓縮能力增強(qiáng)，降解速率加快，質(zhì)子緩沖能力增加，但毒性更高.