酶聯(lián)免疫吸附和膠體金技術(shù)對黃曲霉毒素M1檢測的結(jié)合驗證

喬 寬，王路陽，王艷飛，張云鮮，時長旭

蒙牛乳業(yè)（焦作）有限公司，河南焦作 454100

0 引言

黃曲霉毒素（AFT）是黃曲霉和寄生曲霉等某些菌株產(chǎn)生的雙呋喃環(huán)類毒素。其衍生物有約20 種，分別命名為B1、B2、G1、G2、M1、M2、GM、P1、Q1、毒醇等。其中B1的毒性最大，致癌性最強。動物食用黃曲霉毒素污染的飼料后，在肝臟、腎臟、肌肉、血液、乳汁及蛋品中可測出極微量毒素[1]。黃曲霉毒素M1（Aflatoxin M1，AFM1）是動物攝入黃曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1）后在體內(nèi)經(jīng)羥基化形成的代謝產(chǎn)物，毒性僅次于AFB1，WHO將其列為ⅡB類致癌物。AFM1主要存在于動物的乳汁、腎臟、肝臟、蛋、肉和尿中，以乳中最常見。牛乳及其制品是易受黃曲霉毒素污染的食品之一[2，3]。若把發(fā)霉谷物作為飼料飼喂動物，其中的黃曲霉毒素在24 h之后就能進入乳中。黃曲霉毒素被動物食用后，一部分會蓄積在體內(nèi)，另外一部分會轉(zhuǎn)化到乳汁和尿液中，轉(zhuǎn)化率一般為3.45%～11.39%，排出AFM1的量為AFB1攝入量的1%～3%。黃曲霉毒素M1進入人或動物體內(nèi)后，除抑制DNA、RNA合成外，也抑制肝臟蛋白質(zhì)合成，導(dǎo)致人體中毒。其危害主要表現(xiàn)在3 個方面：一是損害組織器官；二是致癌、致畸、致突變，引發(fā)動物及人類的肝癌、腎癌和胃癌等；三是抑制免疫機能。其毒性是氰化鉀的10倍，砒霜的68 倍，主要危害部位是肝臟。我國規(guī)定生牛乳中黃曲霉毒素M1含量不得超過0.5 μg/kg[4]。近年來，由于國內(nèi)外乳品安全問題，作為乳品中廣泛存在的一類劇毒物——黃曲霉毒素越發(fā)引起關(guān)注。黃曲霉毒素具有強烈致癌性、致畸性及誘變性，已被證實可對人和動物健康造成極大傷害，牛乳中以其代謝產(chǎn)物黃曲霉毒素M1最常見。

本文闡述牛乳中黃曲霉毒素M1的來源與危害，并重點介紹2 種檢測方法的對比分析。當(dāng)前，我國檢測機構(gòu)針對生牛乳中AFM1檢測設(shè)備有很多種，涉及檢測原理主要有同位素稀釋液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法、高效液相色譜法、酶聯(lián)免疫吸附篩查法、膠體金法等。在AFM1檢測中根據(jù)不同需求，選擇不同設(shè)備和方法檢測，對檢測效率至關(guān)重要，因此，本文通過試驗對酶聯(lián)免疫吸附篩查法、膠體金法對生牛乳中AFM1的進行對比分析，旨在為乳品企業(yè)選擇牛乳中AFM1檢測方法提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

酶標(biāo)儀ELx800，美國伯騰儀器有限公司生產(chǎn)；膠體金讀數(shù)儀OTplus-Ⅱ，北京陸橋技術(shù)股份有限公司生產(chǎn)；ME204E/02電子天平，梅特勒—托利多儀器（上海）有限公司生產(chǎn)；高速冷凍離心機Neofuge15R，上海力申科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)；振蕩器MS3 basic，德國IKA Works GmbH & Co.KG生產(chǎn)；保鮮柜LSC-600K，浙江星星冷鏈集成股份有限公司生產(chǎn)；黃曲霉毒素M1靈敏檢測試劑盒，丹麥普格生物技術(shù)股份有限公司生產(chǎn)；黃曲霉毒素M1金標(biāo)快速檢測條，北京陸橋技術(shù)股份有限公司生產(chǎn)；去離子水。

1.2 樣品前處理

1.2.1 酶標(biāo)儀

吸取1.0 mL液體生乳樣品于離心管中，2～8 ℃、3 000 r/min離心10 min，去除脂肪層，吸取100 L脫脂牛奶樣品進行檢測。

1.2.2 膠體金讀數(shù)儀

生乳樣品回溫至20～25 ℃。混勻后直接檢測。

1.3 儀器檢測原理對比

1.3.1 酶標(biāo)儀檢測原理

該產(chǎn)品基于競爭性酶聯(lián)免疫吸附測定原理。酶標(biāo)板微孔包被有AFM1特異性抗體。AFM1標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品加入酶標(biāo)微孔中，若AFM1存在，溶液中AFM1會與包被的抗體偶聯(lián)。未偶聯(lián)的AFM1將在洗滌步驟中洗去。之后將AFM1-HRP酶結(jié)合物（檢測溶液）加入酶標(biāo)板微孔中。AFM1-HRP酶結(jié)合物與還未被標(biāo)準(zhǔn)品或樣品中AFM1占據(jù)的抗體結(jié)合部位偶聯(lián)。檢測溶液中所有未偶聯(lián)的AFM1-HRP酶結(jié)合物將在洗滌步驟中洗去。將顯色底物加入微孔中，與檢測出的抗體逐漸形成藍色絡(luò)合物。顯色過程在加入酸后停止，并將生成的最終物質(zhì)變成黃色。450 nm下測定吸光值，有色絡(luò)合物的光強度與樣品、標(biāo)準(zhǔn)品中AFM1濃度間接成比例。

1.3.2 膠體金讀數(shù)儀檢測原理

應(yīng)用競爭性免疫層析檢測原理，通過受檢樣品中AFM1與固定在檢測線上的AFM1競爭結(jié)合標(biāo)記有膠體金顆粒的抗體，達到抑制檢測線顯色效果。

1.4 儀器檢測

1.4.1 酶標(biāo)儀

（1）使用前將所有試劑恢復(fù)至20～25 ℃，將所需數(shù)量的板條固定在微孔板架上，記錄標(biāo)準(zhǔn)品和樣品位置。

（2）將100 μL標(biāo)準(zhǔn)品或樣品加入對應(yīng)微孔中，封板，搖板30 s，室溫下溫育45 min。

（3）將孔內(nèi)液體甩干，在吸水紙上拍干，加入稀釋后的洗滌液250 μL/孔到微孔中，重復(fù)洗滌4 次，每次間隔10 s。如使用自動洗板機，可預(yù)定洗板完成5次周期，用吸水紙拍干（拍干后未清除氣泡可用干凈的槍頭刺破）。

（4）加入100 μL AFM1檢測溶液，封板，搖板30 s后，室溫下溫育15 min。

（5）重復(fù)步驟3，將孔內(nèi)液體甩干，在吸水紙上拍干，加入稀釋后的洗滌液250 μL/孔到微孔中，重復(fù)洗滌4 次，每次間隔10 s。如使用自動洗板機，可預(yù)定洗板完成5 次周期，用吸水紙拍干（拍干后未清除氣泡可用干凈的槍頭刺破）。

（6）加入100 μL TMB基底，封板，搖板30 s后，于室溫下暗處避光溫育15 min。

（7）移去封板膜，在每個微孔中加入100 μL終止液，搖板，設(shè)定酶標(biāo)儀于450 nm處（在5 min內(nèi)讀完數(shù)據(jù)）測定每孔OD值。用spline曲線進行計算。

1.4.2 膠體金讀數(shù)儀

（1）試驗前請將試紙條和待測樣本恢復(fù)至20～25 ℃。

（2）用移液器移取200 μL待測生乳樣品于微孔中，反復(fù)吹打直至微孔中紅色試劑充分溶解混勻后，將其放置于（40±1）℃溫育器上溫育3 min。

（3）將試紙條插入微孔中，（40±1）℃溫育器上繼續(xù)溫育7 min，溫育結(jié)束后取出試紙條，去除下端樣品墊，判讀結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶標(biāo)儀和膠體金讀數(shù)儀的檢測試驗對比

將10 個AFM1定性檢測為陽性的生乳樣本，分別用酶標(biāo)儀和膠體金讀數(shù)儀檢測，其中酶標(biāo)儀檢測采用加標(biāo)回收率方法，膠體金讀數(shù)儀檢測采用陽性質(zhì)控樣方法，按照正常試驗步驟進行前處理和檢測。2 種方法檢測結(jié)果見表1、表2。其中表1的本底樣為不含待檢物質(zhì)的復(fù)原乳，表2的本底樣為不含待檢物質(zhì)的生牛乳。

表1 酶標(biāo)儀檢測樣本數(shù)據(jù)結(jié)果

表2 膠體金讀數(shù)儀檢測樣本數(shù)據(jù)結(jié)果

根據(jù)《牛乳中黃曲霉毒素M1的快速檢測 雙流向酶聯(lián)免疫法》（NY/T 1664—2008）、《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中真菌毒素限量》（GB 2761—2017）、《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中黃曲霉毒素M族的測定》（GB 5009.24—2016）、《商品化食品檢測試劑盒評價方法》（SN/T 2775—2011），以及表1、表2數(shù)據(jù)可知，酶標(biāo)儀檢測和膠體金讀數(shù)儀檢測均滿足檢測要求（其中膠體金讀數(shù)儀的結(jié)果報出只有陰性或陽性的定性結(jié)果），酶標(biāo)儀檢測方法的回收率和膠體金讀數(shù)儀檢測方法精密度均達標(biāo)[5]。

2.2 不同設(shè)備的使用對比分析

對2 種設(shè)備在單位樣品檢驗時間、費用、操作等方面進行綜合比較，結(jié)果見表3。2 種檢測設(shè)備各有優(yōu)劣，檢測機構(gòu)、企業(yè)或檢驗人員可綜合考量自身不同需求和環(huán)境、樣品量等因素，選擇最合適設(shè)備進行檢驗。

表3 酶標(biāo)儀與膠體金讀數(shù)儀檢測結(jié)果比較

3 結(jié)論

本文主要對酶標(biāo)儀、膠體金讀數(shù)儀檢測牛乳中黃曲霉毒素M1的操作過程和檢測結(jié)果對比分析。從操作過程看，酶標(biāo)儀檢測操作過程相對復(fù)雜，所需耗材成本較高，因其試劑較多，操作暴露風(fēng)險較大，有安全隱患，但快速、靈敏、對樣品純度要求不高，特別適用于大批量樣品檢測。由于需要酶標(biāo)儀和熟練操作人員，不適合現(xiàn)場快速檢測[6]。膠體金讀數(shù)儀操作較簡單，所用耗材較少，檢測過程較安全，檢測速度較快，人員水平要求較低。從檢測結(jié)果看，酶標(biāo)儀、膠體金讀數(shù)儀檢測方法均滿足檢測要求。酶標(biāo)儀檢測方法的回收率、膠體金讀數(shù)儀檢測方法精密度均達標(biāo)。酶標(biāo)儀檢測結(jié)果較準(zhǔn)確，適合作為定性初篩陽性樣品的再次定量驗證。膠體金讀數(shù)儀檢測速度較快，但無法定量檢測，較適用于快速定性檢測。實際應(yīng)用中，2 種方法可配合使用，靈活運用設(shè)備優(yōu)勢，高效率完成工作。