磺胺間二甲氧嘧啶納米抗體免疫磁珠的制備及其鑒定

程小容, 趙 琳, 王 迪, 王雅婷, 楊雅勻, 古少鵬, 何金鑫*

(1)山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)系公共衛(wèi)生學(xué)實(shí)驗(yàn)室,山西 太谷 030801;2)南江縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局,四川 南江 635600)

磺胺間二甲氧嘧啶(sulfadimethoxine,SDM)是一種抗菌譜廣的磺胺類藥物,因其在水產(chǎn)和畜牧業(yè)中的過(guò)度使用,對(duì)食品安全和人類健康構(gòu)成潛在威脅[1],因此,對(duì)其殘留量進(jìn)行檢測(cè)是十分有必要的。目前,我國(guó)磺胺類藥物的檢測(cè)方法仍是高效液相色譜法,雖然其檢測(cè)靈敏度高,但是樣品前處理復(fù)雜,利用抗體和磁小體制備免疫磁珠,快速富集樣品中的SDM,對(duì)提高SDM的檢測(cè)效率具有重要意義。

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn),趨磁細(xì)菌(magnetotactic bacterium,MTB)體內(nèi)能夠合成一種稱為磁小體(bacterial magnetic particles,BMPs)的磁性納米顆粒,其粒徑分布范圍窄、磁靶向性低和晶型穩(wěn)定且成分單一[2,3],程等人[4]研究發(fā)現(xiàn),BMPs的性能比常規(guī)磁顆粒優(yōu)良,可作為免疫磁珠的優(yōu)良載體。BMPs表面被一層生物膜包被[5],為其表面功能基團(tuán)偶聯(lián)提供了大量修飾位點(diǎn)。基于BMPs這一特性,許多研究利用酶、抗體、核酸和多肽等對(duì)其進(jìn)行修飾[6]。例如,He等人[7]將納米抗體(nanobody,Nb)定向固定在BMPs上制備免疫磁珠,用于檢測(cè)環(huán)境中的TBBPA。與傳統(tǒng)抗體相比,Nb具有溶解性好、親和力高、穩(wěn)定性強(qiáng)和易表達(dá)等優(yōu)點(diǎn)[8,9],Wu等人[10]將噬菌體庫(kù)淘選出的抗流感弧菌脂多糖Nb用于合成免疫磁珠,結(jié)果發(fā)現(xiàn),免疫磁珠對(duì)流感弧菌的富集高達(dá)90.7%±3.2%。連接肽(linker)是連接2個(gè)或多個(gè)蛋白質(zhì)之間的氨基酸序列,最常用的柔性連接肽是由甘氨酸(Gly)和絲氨酸(Ser)構(gòu)成的一類易彎折的氨基酸序列,常見(jiàn)為(G4S)n重復(fù)序列[11,12]。連接肽最重要的指標(biāo)是氨基酸鏈的長(zhǎng)度,過(guò)長(zhǎng)或過(guò)短的連接肽均會(huì)影響融合物的穩(wěn)定性與活性[13]。基于Nb和BMPs研制的免疫磁珠,具有良好的應(yīng)用前景,然而兩者間的連接肽對(duì)免疫磁珠性能的影響尚不清晰。為了探究連接肽長(zhǎng)度對(duì)免疫磁珠性能的影響,本研究利用基因工程技術(shù),在anti-SDM Nb的C端融合不同長(zhǎng)度的連接肽,將其與BMPs進(jìn)行偶聯(lián),檢測(cè)免疫磁珠的性能差異,為今后選擇具有合適長(zhǎng)度的連接肽提供理論依據(jù),為SDM的殘留檢測(cè)提供物質(zhì)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒 大腸桿菌BL21(DE3)和質(zhì)粒pET28a;質(zhì)粒pH-17和趨磁細(xì)菌(MTB)發(fā)酵產(chǎn)物,分別惠贈(zèng)于中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院王戰(zhàn)輝老師和生物學(xué)院田杰生老師。

1.1.2 試劑 eECL Western Blot Kit高靈敏度化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司;3-(2-吡啶二巰基)丙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithiol)propionate,SPDP)購(gòu)自默克化工技術(shù)(上海)有限公司;限制性內(nèi)切酶EcoR I、XhoI、T4 DNA 連接酶(TaKaRa,北京);蛋白質(zhì)標(biāo)記物(marker)購(gòu)自武漢愛(ài)博泰克生物科技有限公司;D2000 plus DNA Ladder購(gòu)自中科瑞泰生物科技有限公司;小鼠抗6His單克隆抗體(mIgG-HRP)購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司;卡那霉素(Kana)、蛋白質(zhì)上樣緩沖液購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司;PCR Mix、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。其余常用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建與鑒定pET28a-Nb-(G4S)1-Cys、pET28a-Nb-(G4S)4-Cys 2種表達(dá)載體 依據(jù)anti-SDM Nb的基因序列,通過(guò)Primer 5.0軟件分別設(shè)計(jì)PCR引物(F-SDM-(G4S)1-EcoR I:5′-CGAATTCCAGGTGCAGCTCGTGGAG-3′,R-SDM-(G4S)1-XhoI:5′-CCTCGAGTCAGCACGATCCGCCACCGCCAAGC TTCGAGGAGACGGTGACCTGG-3′;F-SDM-(G4S)4-EcoR I:5′-CGAATTCCAGGTGCAGCTCGTGGAG-3′,R-SDM-(G4S)4-XhoI:5′-CCTCGAGTCAGCACGAT CCGCCACCGCCCGATCCGCCACCGCCCGA TCCGCCACCGCCCGATCCGCCACCGCCAAGCTTCG AGGAG ACGGTGACCTG-3′)。以pH-17質(zhì)粒為模板,利用上述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,獲取Nb-(G4S)1-Cys、Nb-(G4S)4-Cys 2種基因片段,將基因片段進(jìn)行膠回收。使用高純度質(zhì)粒小提試劑盒提取BL21(DE3)-pET28a菌液中的pET28a質(zhì)粒,將目的基因和質(zhì)粒使用EcoRⅠ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切,在37 ℃水浴鍋中放置3 h,待酶切完全,將酶切產(chǎn)物置于75 ℃水浴鍋中放置10 min滅活并進(jìn)行膠回收,將膠回收后的pET28a質(zhì)粒分別與Nb-(G4S)1-Cys、Nb-(G4S)4-Cys 2種基因片段連接,構(gòu)建pET28a-Nb-(G4S)1-Cys、pET28a-Nb-(G4S)4-Cys 2種表達(dá)載體。將構(gòu)建的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入BL21(DE3)感受態(tài)中,置于含卡那霉素抗生素的固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng),將長(zhǎng)出的單克隆菌擴(kuò)大培養(yǎng),提取質(zhì)粒,使用EcoRⅠ和XhoⅠ酶對(duì)提取的重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證,將驗(yàn)證成功的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序,若結(jié)果與預(yù)期相符,則表明載體構(gòu)建成功。

1.2.2 制備anti-SDM Nb-(G4S)1-Cys、Nb-(G4S)4-Cys重組蛋白質(zhì) 將測(cè)序正確的2種重組菌劃線培養(yǎng),挑取單菌落過(guò)夜培養(yǎng),吸取1 mL的菌液置于100 mL LB液體培養(yǎng)基中,培養(yǎng)3 h,待菌液OD600為0.4～0.6時(shí),加入0.8 mL 100 mmol/mL的IPTG于BL21(DE3)-pET28a-Nb-(G4S)1-Cys菌液中,加入0.5 mL 100 mmol/mL的IPTG于BL21(DE3)-pET28a-Nb-(G4S)4-Cys菌液中,誘導(dǎo)培養(yǎng)11 h,離心棄上清,加入PBS重懸,離心棄上清,重復(fù)此操作1次,將洗滌后的沉淀溶于10 mL PBS中,在低溫下超聲破碎40 min,9 000 r/min離心20 min,將離心后的沉淀依次用包涵體洗滌液I、II、III、包涵體溶解液進(jìn)行處理,再置于尿素濃度依次為6 ,4 ,2 ,0 mol/L的PBS溶液中進(jìn)行復(fù)性。將得到的2種純化蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE鑒定。

1.2.3 提取BMPs 將MTB置于含PBS的小燒杯中,充分混勻,低溫條件下進(jìn)行細(xì)胞破碎,超聲3 s,間隔5 s,運(yùn)行30 min,將破碎后的MTB置于磁鐵上吸附過(guò)夜,使BMPs沉降,待BMPs全部沉降于燒杯底部,棄去上清,每天反復(fù)3次,直至上清中蛋白質(zhì)濃度小于0.1 ng/mL,將提取的BMPs置于4 ℃保存。

1.2.4 構(gòu)建和優(yōu)化anti-SDM Nb免疫磁珠 稱取2份1 mg的BMPs,置于含PBS的2 mL EP管中,靜置于磁力架上,待固液分離后棄去液體,加入1 mL pH為8.0的PBS,80 W超聲10 min,靜置分層后,棄去上清,重復(fù)上述步驟,反復(fù)3次。將溶解在20 μL DMF中的SPDP加入到EP管中,超聲混勻后,置于220 r/min搖床上孵育2 h,靜置分層,棄去上清,加入1 mL pH為7的PBST,80 W超聲10 min,靜置棄去上清,反復(fù)3次,將1 mg anti-SDM Nb-(G4S)1-Cys和Nb-(G4S)4-Cys分別加入到BMP-SPDP中,超聲并置于搖床上孵育2 h,置于磁力架上靜置分層,棄去上清,加入1 mL pH為8.0的PBST,80 W超聲10 min,靜置后棄去上清,反復(fù)3次,加入1 mL PBS,4 ℃保存?zhèn)溆谩＠霉接?jì)算偶聯(lián)效率:偶聯(lián)效率=(C1-C2)×V/M(C1表示Nb與BMPs反應(yīng)之前的濃度;C2表示Nb與BMPs反應(yīng)后的濃度;V表示與BMPs反應(yīng)時(shí)的溶液體積;M表示參與偶聯(lián)反應(yīng)的BMPs重量)。

將構(gòu)建的2種免疫磁珠各取10 μL,加入5 μL上樣緩沖液處理后,離心取上清,進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳,使用轉(zhuǎn)膜儀將凝膠上的樣品轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,使用小鼠抗6His單克隆抗體(mIgG-HRP)對(duì)膜上的目的蛋白質(zhì)進(jìn)行驗(yàn)證,初步判定免疫磁珠是否構(gòu)建成功。將WB驗(yàn)證成功的免疫磁珠用ddH2O清洗,用透射電鏡和Zeta電位分析儀分析BMPs偶聯(lián)前后水合粒徑、Zeta電位和分散性差異。

為了提高Nb和BMPs的偶聯(lián)效率,設(shè)置了不同的孵育時(shí)間(30、60、90、120、150 min),通過(guò)計(jì)算偶聯(lián)效率選取最佳孵育時(shí)間,在最佳孵育時(shí)間下將BMPs與1 mL不同濃度的SDM Nb(0.1、0.5、1.0、1.5 mg/mL)進(jìn)行孵育,根據(jù)偶聯(lián)效率,選取最佳孵育濃度。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用透射電鏡分析BMPs、BMP-(G4S)1-Nb和BMP-(G4S)4-Nb粒徑,每種磁顆粒置于三種不同視野下,使用GraphPad Prism 8.0對(duì)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)進(jìn)行多組間兩兩比較,采用one-way ANOVA進(jìn)行分析,其中P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。*P<0.05表明差異顯著,**P<0.01和***P<0.001代表差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 pET28a-Nb-(G4S)1-Cys、pET28a-Nb-(G4S)4-Cys表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

以pH-17質(zhì)粒為模板,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,結(jié)果正如Fig.1A所示,anti-SDM Nb-(G4S)1-Cys基因在405 bp處呈現(xiàn),而anti-SDM Nb-(G4S)4-Cys在450 bp處有單一明亮條帶,使用高純度質(zhì)粒小提試劑盒提取過(guò)夜培養(yǎng)的BL21(DE3)-pET28a中的pET28a質(zhì)粒。將驗(yàn)證成功的基因和pET28a質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切,質(zhì)粒呈現(xiàn)出單一條帶(Fig.1B),證明質(zhì)粒酶切成單一的鏈狀結(jié)構(gòu),基因經(jīng)酶切后條帶依然明亮,證明酶切后的基因濃度依然很高,有利于后續(xù)載體的構(gòu)建。將基因和質(zhì)粒過(guò)夜連接,構(gòu)建出pET28a-Nb-(G4S)1-Cys、pET28a-Nb-(G4S)4-Cys 2種表達(dá)載體,對(duì)兩者進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證,結(jié)果正如圖Fig.1C所示,pET28a-Nb-(G4S)1-Cys表達(dá)載體呈現(xiàn)出5 300 bp和405 bp 2條帶,pET28a-Nb-(G4S)4-Cys表達(dá)載體呈現(xiàn)出5 300 bp和450 bp 2條帶,二者均未見(jiàn)明顯雜帶,證明選取的表達(dá)載體初步構(gòu)建成功。

Fig.1 Identification of pET28a-SDM-Nb-(G4S)1-Cys and pET28a-SDM-Nb-(G4S)4-Cys plasmids The pH-17 plasmid containing Nb gene against SDM was used as the template for PCR amplification. The pET28a and anti-SDM gene were double-digested with EcoR I and Xho I. Then, the gene and plasmid were recovered and linked with T4 DNA ligase. (A) Amplification of anti-SDM Nb-(G4S)1-Cys and Nb-(G4S)4-Cys by PCR. Line M: DNA Marker; Line 1: anti-SDM Nb-(G4S)4-Cys fragment; Line 2: anti-SDM Nb-(G4S)1-Cys fragment; (B) Digestion of anti-SDM Nb and pET28a by EcoR I and Xho I. Line M: DNA Marker; Line 1: pET28a; Line 2: anti-SDM Nb-(G4S)1-Cys fragment; Line 3: anti-SDM Nb-(G4S)4-Cys fragment; (C) Digestion of pET28a-SDM-Nb-(G4S)1-Cys and pET28a-SDM-Nb-(G4S)4-Cys by EcoR I and Xho I. Line M: DNA Marker; Line 1: Digestion of pET28a-SDM-Nb-(G4S)4-Cys by EcoR I and Xho I; Line 2: Digestion of pET28a-SDM-Nb-(G4S)1-Cys by EcoR I and Xho I

2.2 Anti-SDM Nb-(G4S)1-Cys、SDM Nb-(G4S)4-Cys重組蛋白質(zhì)的制備

重組菌BL21(DE3)-pET28a-Nb-(G4S)1-Cys在0.8 mmol/mL IPTG濃度下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),重組菌BL21(DE3)-pET28a-Nb-(G4S)4-Cys在0.5 mmol/mL IPTG濃度下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn),二者都以包涵體的形式進(jìn)行表達(dá),對(duì)超聲破碎的沉淀進(jìn)行包涵體蛋白質(zhì)的純化和復(fù)性,取10 μL純化后的蛋白質(zhì),使用上樣緩沖液處理,進(jìn)行SDS-PAGE驗(yàn)證,結(jié)果如Fig.2 所示,anti-SDM Nb-(G4S)1-Cys在12.5 kD處有明顯條帶,anti-SDM Nb-(G4S)4-Cys在14.1 kD處有明顯條帶。純化出的樣品SDS-PAGE圖上都無(wú)明顯雜帶,證明樣品中雜蛋白質(zhì)較少,可以滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)需要。

Fig.2 SDS-PAGE identifies anti-SDM Nb purification results Expression of Nb-(G4S)1-Cys and Nb-(G4S)4-Cys was performed using a final concentration of IPTG at 0.8 and 0.5 mmol/mL, respectively. Line M: protein marker; Line 1: anti-SDM Nb-(G4S)1-Cys; Line 2: anti-SDM Nb-(G4S)4-Cys

2.3 Anti-SDM Nb免疫磁珠的構(gòu)建

用BMPs作為空白對(duì)照,將構(gòu)建的2種免疫磁珠經(jīng)高溫處理,進(jìn)行Western 印跡驗(yàn)證,結(jié)果如Fig.3所示,泳道2無(wú)任何反應(yīng),證明BMPs不影響研究結(jié)果的判斷,而泳道1在12.5 kD呈現(xiàn)出單一條帶,泳道3在14.1 kD處有明顯反應(yīng),二者皆與預(yù)期結(jié)果相符,結(jié)果表明,2種蛋白質(zhì)皆偶聯(lián)到BMPs上,初步判定2種免疫磁珠構(gòu)建成功。

Fig.3 Identification of immunomagnetic beads by Western blotting The samples were separated by SDS-PAGE and transferred to PVDF membrane. The target proteins were then confirmed by respective antibodies. BMPs were used as a blank control. Line M: Protein Marker; Line 1: BMP-(G4S)1-Nb; Line 2: BMPs; Line 3: BMP-(G4S)4-Nb

對(duì)SDM Nb-(G4S)1-Cys的孵育時(shí)間和孵育濃度進(jìn)行優(yōu)化,結(jié)果如圖Fig.4所示,當(dāng)孵育30、60、90 min時(shí),隨著孵育時(shí)間的增加,偶聯(lián)效率增加,當(dāng)孵育時(shí)間達(dá)到120 min時(shí),偶聯(lián)效率達(dá)到最高值,若孵育時(shí)間繼續(xù)增加,偶聯(lián)效率反而降低,所以SDM Nb-(G4S)1-Cys的最佳孵育時(shí)間為120 min。當(dāng)將1 mg的BMPs與不同濃度的Nb-(G4S)1-Cys孵育120 min時(shí),從Fig.4B顯示,當(dāng)SDM Nb-(G4S)1-Cys的濃度為1 mg/mL時(shí),二者偶聯(lián)效率最高,1 mg BMPs可偶聯(lián)726±17 μg SDM Nb-(G4S)1-Cys。當(dāng)BMPs和SDM Nb-(G4S)4-Cys孵育不同時(shí)間時(shí),從Fig.4C中顯示,當(dāng)孵育120 min時(shí),偶聯(lián)效率最高,在最佳孵育時(shí)間下,不同濃度的Nb-(G4S)4-Cys與1 mg BMPs孵育,結(jié)果發(fā)現(xiàn),1 mg Nb-(G4S)4-Cys與1 mg BMPs進(jìn)行孵育時(shí),偶聯(lián)效率最高,1 mg BMPs可與692±15 μg SDM Nb-(G4S)4-Cys偶聯(lián)。

Fig.4 The linking ratios of BMPs and Nb-(G4S)1-Cys/Nb-(G4S)4-Cys (A) The linking ratios of SDM Nb-(G4S)1-Cys and BMPs at different times, with 1 mg SDM Nb-(G4S)1-Cys and 1 mg BMPs being incubated; (B) The linking ratios of Nb-(G4S)1-Cys and BMPs after 2 h incubation; (C) The linking ratios of Nb-(G4S)4-Cys and BMPs at different times, with 1 mg SDM Nb-(G4S)4-Cys and 1 mg BMPs being incubated; (D) The linking of different ratios of SDM Nb-(G4S)4-Cys and BMPs after 2 h incubation

2.4 anti-SDM Nb免疫磁珠的表征

取微量BMPs進(jìn)行透射電鏡分析,先將Nb-(G4S)1-Cys/Nb-(G4S)4-Cys與BMPs進(jìn)行偶聯(lián),再取微量樣品進(jìn)行透射電鏡觀察,結(jié)果顯示,BMP-(G4S)1-Nb和BMP-(G4S)4-Nb顆粒與顆粒之間的空隙較大,幾乎皆是單分散顆粒,與BMPs空白對(duì)照組在形態(tài)上無(wú)明顯區(qū)別(Fig.5A,B,C),BMP-(G4S)1-Nb和BMP-(G4S)4-Nb的粒徑分布均勻,在20 ～ 60 nm之間,粒徑大小為30 ～ 40 nm的居多,將BMP-(G4S)1-Nb和BMP-(G4S)4-Nb粒徑與空白對(duì)照組BMPs粒徑進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,皆無(wú)顯著性差異(Fig.D),說(shuō)明BMPs與SDM Nb偶聯(lián)后,對(duì)BMPs的形態(tài)并未造成影響。

Fig.5 Electron microscopy of magnetic particles After the immunomagnetic beads were cleaned with ddH2O, they were dried under infrared light and observed by transmission electron microscopy. (A) BMPs; (B) BMP-(G4S)1-Nb; (C) BMP-(G4S)4-Nb; (D) The size distribution of BMPs、BMP-(G4S)1-Nb and BMP-(G4S)4-Nb

以BMPs作為空白對(duì)照,用Zeta電位分析儀對(duì)BMPs、BMP-(G4S)1-Nb和BMP-(G4S)4-Nb的水合粒徑、Zeta電位及分散性進(jìn)行分析,結(jié)果如Table 1所示,—30 mV或+30 mV一般作為水相穩(wěn)定的分界線,Zeta電位高于+30 mV或低于-30 mV,則表明所形成的分散體系較穩(wěn)定,BMP-(G4S)1-Nb和BMP-(G4S)4-Nb的Zeta電位皆低于-30 mV,說(shuō)明二者的水相膠體皆比較穩(wěn)定,BMP-(G4S)1-Nb的Zeta電位絕對(duì)值更高,水合粒徑更小,多分散性指數(shù)低,綜上表明,BMP-(G4S)1-Nb在水相體系中膠體穩(wěn)定性更強(qiáng)。

3 討論

磺胺類藥物因具有價(jià)格低廉、抗菌譜廣等優(yōu)點(diǎn),而廣泛應(yīng)用于預(yù)防和治療養(yǎng)殖業(yè)中的疾病,但其會(huì)通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體[14],許多國(guó)家對(duì)食品中磺胺類藥物的殘留做出了相關(guān)規(guī)定。有的國(guó)家甚至對(duì)不同磺胺藥的殘留量進(jìn)行限定,這就對(duì)檢測(cè)磺胺類藥物的免疫分析法提出更高的要求。尋根究底是需要制備兼具高特異性和高親和力的識(shí)別材料。由于磺胺類藥物具有高度相似的結(jié)構(gòu)[15],只制備針對(duì)某一種磺胺類藥物的高特異性多克隆抗體和單克隆抗體非常困難,所以本文選擇利用基因工程技術(shù),制備具有巨大應(yīng)用潛力的Nb,與傳統(tǒng)抗體相比,納米抗體不僅尺寸較小、特異性高和理化性質(zhì)穩(wěn)定,而且利用微生物生產(chǎn)表達(dá)時(shí)無(wú)需翻譯后修飾,可實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn),顯著降低生產(chǎn)成本[9]。

Nb與新型材料的結(jié)合會(huì)提高檢測(cè)的靈敏度,20世紀(jì)70年代,美國(guó)工作者發(fā)現(xiàn)并報(bào)道了MTB[16],BMPs是一種由其在胞內(nèi)合成的生物膜包被的納米磁性材料[17],因?yàn)槠渚哂歇?dú)特的特征,例如順磁性、納米級(jí)尺寸(40～120 nm)和高分散性,且被穩(wěn)定的細(xì)胞質(zhì)膜覆蓋,被認(rèn)為具有良好的生物相容性[18],因此,BMPs能夠輕松地與蛋白質(zhì)和基因結(jié)合,具有各種技術(shù)應(yīng)用的潛力,使用其作為載體不僅高富載,而且復(fù)合物易于從溶液中分離。本文選用BMPs作為載體,Nb作為免疫配基制備免疫磁珠,通過(guò)Western印跡初步驗(yàn)證發(fā)現(xiàn),BMPs上偶聯(lián)有納米抗體,隨后,本文對(duì)孵育時(shí)間和孵育濃度進(jìn)行優(yōu)化,結(jié)果發(fā)現(xiàn),最佳孵育時(shí)間是120 min,最佳孵育濃度為1 mg BMPs分別與1 mg/mL Nb-(G4S)1-Cys、1 mg/mL Nb-(G4S)4-Cys進(jìn)行孵育,在最優(yōu)條件下,1 mg BMPs可與726±17 μg Nb-(G4S)1-Cys偶聯(lián),1 mg BMPs可與692±15 μg SDM Nb-(G4S)4-Cys偶聯(lián),偶聯(lián)效率的不同是因二者之間的連接肽長(zhǎng)度不同,連接肽是基因融合技術(shù)成功實(shí)現(xiàn)的重要技術(shù)手段,借助一段合適的核苷酸序列將目的基因連接起來(lái),其在生物體內(nèi)表達(dá)成為一條單一的肽段[19]。主要分為剛性連接肽和柔性連接肽,柔性連接肽即成柔軟線性的一類易彎折的氨基酸序列,常見(jiàn)為(G4S)n重復(fù)序列,因其柔軟性好和親水性強(qiáng),所以本文選擇在Nb的末端引入柔性連接肽,使Nb更好的展示在BMPs上。

Table 1 Hydration radius, potential and dispersion of immunomagnetic beads

長(zhǎng)度是選擇連接肽時(shí)主要考慮的因素,本文在anti-SDM Nb的C端引入(G4S)1、(G4S)4 2種長(zhǎng)度的柔性連接肽,對(duì)2種抗體構(gòu)建的免疫磁珠偶聯(lián)效率進(jìn)行比較,結(jié)果發(fā)現(xiàn),(G4S)1具有更高的偶聯(lián)效率,免疫磁珠表征發(fā)現(xiàn),BMP-(G4S)1-Nb的Zeta電位絕對(duì)值更高,水合粒徑更小,多分散性指數(shù)低(BMP-(G4S)1-Nb的水合粒徑為275.4±1.089,Zeta電位為-49.74±1.29 mV,分散性為0.0158±0.028;BMP-(G4S)4-Nb的水合粒徑為305.3±2.119,Zeta電位為-43.46±1.73 mV,分散性為0.0245±0.031),BMP-(G4S)1-Nb在水相體系中膠體穩(wěn)定性更強(qiáng)。綜上所述,BMP-(G4S)1-Nb免疫磁珠的性能優(yōu)于BMP-(G4S)4-Nb,本研究制備的2種免疫磁珠皆可用于快速檢測(cè)養(yǎng)殖環(huán)境和動(dòng)物產(chǎn)品中的SDM,為今后選擇具有合適長(zhǎng)度連接肽提供理論依據(jù)。