鐵死亡參與無機(jī)砷致人肝星狀細(xì)胞活化的研究

迪麗娜爾·亞爾麥麥提 黃 菲 丁關(guān)鑫 趙麗君 吳順華

無機(jī)砷(inorganic arsenic,iAs)是存在于環(huán)境中的Ⅰ類致癌物[1]。據(jù)2020年地下水砷污染預(yù)測模型估計(jì),目前全球范圍內(nèi)大約有2200萬人生活在高砷濃度水地區(qū)(砷含量>10μg/L),其中94%分布在亞洲[2]。iAs作為一種潛在環(huán)境致癌物對(duì)機(jī)體多器官、多系統(tǒng)產(chǎn)生不可逆的損害,嚴(yán)重危害身體健康。其中,肝臟是iAs代謝的主要靶器官。長期攝入iAs通過肝纖維化、肝衰竭和肝硬化最終導(dǎo)致肝臟發(fā)生癌變[3]。然而,iAs致肝纖維化的發(fā)病機(jī)制尚不明確。

近年來研究發(fā)現(xiàn),鐵死亡(ferroptosis)是不同于細(xì)胞凋亡、壞死和自噬的由鐵依賴性脂質(zhì)過氧化物大量聚集引起的新型細(xì)胞程序性死亡方式[4]。鐵死亡的典型形態(tài)特征是線粒體結(jié)構(gòu)的改變而引起線粒體功能損傷。溶質(zhì)載體家族7號(hào)成員11(solute carrier family number 7member 11,SLC7A11)作為細(xì)胞內(nèi)谷氨酸和細(xì)胞外胱氨酸交換的閥門在鐵死亡中起重要作用。SLC7A11被抑制引起胱氨酸攝取減少進(jìn)而降低細(xì)胞谷胱甘肽(glutathione,GSH)含量,導(dǎo)致谷胱甘肽過氧化物酶 4 (glutathione peroxidase 4,GPX4) 的功能受損并導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化引起細(xì)胞死亡[5]。越來越多的研究表明,鐵死亡與肝纖維化、癌癥、缺血性再灌注損傷等疾病關(guān)系密切[6～8]。但鐵死亡是否參與iAs致肝纖維化的研究鮮有報(bào)道。因此,本研究以人肝星狀細(xì)胞(LX-2)為觀察對(duì)象,探討亞砷酸鈉(NaAsO2)對(duì)LX-2細(xì)胞鐵死亡水平的影響,繼而從鐵死亡的角度進(jìn)一步探討iAs致LX-2活化的可能機(jī)制。

材料與方法

1.主要試劑與儀器:LX-2細(xì)胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司,NaAsO2購自北京化學(xué)試劑三廠,高糖培養(yǎng)基DMEM、PBS、胰酶、胎牛血清購自美國Gibco公司,FerroOrange熒光探針和CCK-8檢測試劑盒購自日本同仁試劑公司,丙二醛(malondialdehyde,MDA)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所,BCA蛋白定量試劑盒購自美國Thermo Scientific Fisher公司,α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)購自英國Abcam公司,SLC7A11、GPX4、β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)抗體購自美國Proteintech公司,CO2培養(yǎng)箱購自美國Thermo Scientific Fisher公司,低溫離心機(jī)購自美國Sigma 公司,熒光顯微鏡購自德國Leica 公司,多功能酶標(biāo)儀購自美國Thermo Scientific Fisher公司。

2.實(shí)驗(yàn)分組:分為對(duì)照組、5μmol/L NaAsO2組、10μmol/L NaAsO2組和15μmol/L NaAsO2組。

3.細(xì)胞培養(yǎng):在5% CO2和37℃條件下,采用含12%胎牛血清,1%雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞。待細(xì)胞密度達(dá)到80%時(shí),使用0.25%胰酶消化、離心最終收集細(xì)胞。按1∶3進(jìn)行傳代培養(yǎng)。收集處于對(duì)數(shù)生長期且生長狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

4.CCK-8檢測細(xì)胞增殖率:收集對(duì)數(shù)生長期的LX-2細(xì)胞,按5000 個(gè)細(xì)胞/孔,向96孔板每孔加入100μl細(xì)胞懸液,邊緣孔用 PBS填充。在CO2培養(yǎng)箱中孵育。12h后吸棄舊培養(yǎng)基,設(shè)NaAsO2不同濃度梯度(0μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、15μmol/L、20μmol/L、30μmol/L、40μmol/L、50μmol/L、60μmol/L),向每孔中100μl不同濃度NaAsO2溶液,同時(shí)設(shè)立對(duì)照組與空白組,繼續(xù)培養(yǎng)24h。次日,向每孔加入10μl CCK-8溶液,3h后用酶標(biāo)儀測吸光度(A)值,并按公式計(jì)算細(xì)胞增殖率。細(xì)胞增殖率(%)=[A(實(shí)驗(yàn))-A(空白)]/[A(對(duì)照)-A(空白)]×100%。

5.透射電子顯微鏡(transmission electron microscopy,TEM)觀察LX-2細(xì)胞線粒體:NaAsO2處理LX-2細(xì)胞24h后收集細(xì)胞,用PBS沖洗3次,再用1mol/L磷酸緩沖戊二醛固定液固定2h。用磷酸鹽緩沖液漂洗3次,加入1%的四氧化鋨固定1.5h。丙酮梯度脫水,環(huán)氧丙烷包埋細(xì)胞并制作超薄切片。再分別用醋酸鈾、枸櫞酸染色切片,TEM觀察線粒體超微結(jié)構(gòu)。

6.Fe2+檢測:LX-2細(xì)胞以1×104個(gè)/孔的密度接種于6孔板中,不同濃度NaAsO2干預(yù)LX-2細(xì)胞24h。次日用HBSS清洗2次,加入1μmol/L的FerroOrange熒光探針,在培養(yǎng)箱培養(yǎng)30min后用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞熒光強(qiáng)度,用熒光酶標(biāo)儀檢測胞內(nèi)Fe2+的熒光強(qiáng)度,實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

7.MDA含量檢測:按試劑盒說明書, 將不同NaAsO2染毒組細(xì)胞沉淀中加試劑五提取液0.5ml,混勻2min,將細(xì)胞破碎制成懸液,取樣0.1ml于1.5ml離心管中,向空白管、標(biāo)準(zhǔn)管分別加100μl無水乙醇和10nmol/ml標(biāo)準(zhǔn)品,旋渦混勻,95℃金屬浴40min,冷卻后,4000r/min(離心半徑13.5cm)離心10min,吸取0.25ml各管反應(yīng)液加入到新的96孔板中,530nm測定各孔吸光度,并計(jì)算MDA含量,實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。MDA含量(nmol/mg protein)=[A(實(shí)驗(yàn))-A(空白)]/[A(標(biāo)準(zhǔn))-A(空白)]×C標(biāo)準(zhǔn)/Cpr。

8.蛋白免疫印跡(Western blot)法檢測:收集 NaAsO2處理 24h 的細(xì)胞,RIPA 裂解液提取各組細(xì)胞總蛋白,通過BCA法進(jìn)行細(xì)胞蛋白定量,對(duì)蛋白濃度進(jìn)行統(tǒng)一化,取同質(zhì)量蛋白上樣,經(jīng) SDS-PAGE 電泳、電轉(zhuǎn)、封閉、清洗3次、4℃一抗過夜孵育、清洗3次、室溫二抗孵育1h、超敏ECL發(fā)光液顯影。使用Image J軟件測量條帶的灰度值,并計(jì)算和分析每組蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

結(jié) 果

1.NaAsO2對(duì)LX-2細(xì)胞增殖率的影響:不同濃度NaAsO2染毒液處理LX-2細(xì)胞24h,觀察到隨著NaAsO2染毒劑量升高,LX-2細(xì)胞增殖率逐漸下降,IC50為21.44 (18.88～24.22)μmol/L,R2=0.91。當(dāng)60μmol/L NaAsO2干預(yù)LX-2細(xì)胞時(shí),細(xì)胞增殖率為0(圖1)。因此,根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求取5μmol/L、10μmol/L、15μmol/L 為后續(xù)實(shí)驗(yàn)染毒劑量。

圖1 細(xì)胞增殖率曲線

圖2 TEM觀察LX-2細(xì)胞線粒體(×30000)

2.TEM觀察LX-2細(xì)胞線粒體:通過TEM觀察到,對(duì)照組LX-2細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)為雙層膜、光滑閉環(huán)且可清楚觀察到線粒體嵴。然而15μmol/L NaAsO2組LX-2細(xì)胞線粒體數(shù)量減少、線粒體雙層膜破壞、線粒體嵴減少,甚至觀察到線粒體腫大、空泡化線粒體嵴消失現(xiàn)象(圖2)。

3.Fe2+檢測:熒光顯微鏡觀察到不同劑量NaAsO2染毒LX-2 細(xì)胞24h后,Fe2+熒光強(qiáng)度隨著NaAsO2劑量的升高而逐漸升高(圖3)。不同劑量NaAsO2處理LX-2細(xì)胞組Fe2+水平比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=10.77,P<0.05)。與對(duì)照組比較,NaAsO2染毒組Fe2+水平均升高(P均<0.05),且10、15μmol/L NaAsO2組Fe2+水平高于5μmol/L組(P均<0.05,圖4)。

圖3 熒光顯微鏡下LX-2細(xì)胞 Fe2+檢測結(jié)果(×100)

圖4 熒光酶標(biāo)儀檢測Fe2+熒光強(qiáng)度(n=3)

4.MDA含量檢測:不同劑量NaAsO2處理LX-2細(xì)胞組MDA含量比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=7.18,P<0.01)。其中,與對(duì)照組比較,NaAsO2處理導(dǎo)致LX-2細(xì)胞MDA含量升高,5、15μmol/L NaAsO2處理組MDA含量均高于對(duì)照組(P<0.05)。然而10μmol/L NaAsO2組與對(duì)照組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。此外15μmol/L NaAsO2組MDA含量高于10μmol/L 組(P<0.05,圖5)。

圖5 不同組LX-2細(xì)胞MDA含量檢測(n=3)

5.NaAsO2對(duì)LX-2細(xì)胞α-SMA、SLC7A11、GPX4 蛋白水平的影響:在不同 NaAsO2處理組,纖維化指標(biāo)α-SMA蛋白表達(dá)水平比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F分別為782.86,P< 0.001)。其中,與對(duì)照組比較,5、10、15μmol/L NaAsO2組α-SMA蛋白水平均以劑量依賴方式升高(P<0.05)。此外,不同組間鐵死亡指標(biāo)SLC7A11和GPX4 蛋白表達(dá)水平比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F分別為274.03、206.83,P均<0.001),其中,5、10、15μmol/L NaAsO2組SLC7A11和GPX4 蛋白表達(dá)水平均以劑量依賴方式下調(diào)(P<0.05,表1,圖6)。

表1 NaAsO2對(duì)LX-2細(xì)胞α-SMA、SLC7A11、GPX4 蛋白水平的影響

圖6 Western blot法條帶圖(n=3)

討 論

肝纖維化是由病毒、自身免疫性疾病、藥物或毒性化學(xué)物質(zhì)、代謝性或全身性疾病等多種因素引起的彌漫性疾病[9]。從形態(tài)學(xué)上看,肝纖維化的特點(diǎn)是細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)的積聚,隨后形成纖維瘢痕和肝硬化。持續(xù)性肝損傷致肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell,HSC)激活,上調(diào)α-SMA的表達(dá)并產(chǎn)生ECM引起肝纖維化[10]。Tao等[11]研究表明,NaAsO2處理 HSC-T6細(xì)胞24h觀察到細(xì)胞增殖率以劑量依賴性方式降低,然而α-SMA、TGF-β1表達(dá)上調(diào)證明HSC被NaAsO2激活。在本研究中用不同濃度NaAsO2干預(yù)LX-2細(xì)胞24h,發(fā)現(xiàn)隨著NaAsO2濃度的升高LX-2細(xì)胞增殖率逐漸下降。此外,α-SMA蛋白水平以NaAsO2劑量依賴方式上調(diào)。由此可認(rèn)為,體外NaAsO2干預(yù)LX-2活化模型建立成功。

流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn),長期飲用含砷水可引起肝纖維化[12]。從iAs毒性研究進(jìn)展來看,凋亡、氧化應(yīng)激、甲基化、自噬與砷致纖維化機(jī)制相關(guān)[13～15]。然而,iAs如何引起LX-2活化及肝纖維化尚不明了。隨著鐵死亡研究的進(jìn)展,多項(xiàng)研究表明,鐵死亡參與肝纖維化過程。鐵死亡的特點(diǎn)是線粒體結(jié)構(gòu)改變,脂質(zhì)過氧化物的積累和Fe2+水平升高[16]。本研究中,首先采用TEM觀察到NaAsO2處理LX-2細(xì)胞導(dǎo)致線粒體雙層膜完整性破壞、線粒體脊減少,甚至觀察到線粒體腫大和空泡化線粒體脊消失等現(xiàn)象。由此推測,砷可能影響線粒體正常功能,從而導(dǎo)致細(xì)胞呼吸受損。研究表明,2.5μmol/L、5μmol/L、10μmol/L亞砷酸鹽處理小鼠精母細(xì)胞時(shí),細(xì)胞脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量以劑量依賴性方式顯著升高,Fe2+含量也逐漸升高[17]。同樣,本研究結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,隨著NaAsO2染毒濃度的升高細(xì)胞MDA水平逐漸升高。此外,NaAsO2染毒的LX-2細(xì)胞內(nèi)Fe2+水平也顯著升高。因此,iAs致LX-2線粒體損傷而可能引起MDA堆積,Fe2+水平升高,這可能與鐵死亡有關(guān)。

鐵死亡作為一種新型調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡方式,氨基酸代謝、鐵離子代謝、脂質(zhì)過氧化物等多種通路及相關(guān)基因共同調(diào)控鐵死亡的發(fā)生[18]。其中,SLC7A11、GPX4在調(diào)控鐵死亡中起到重要作用。SLC7A11將胱氨酸運(yùn)輸至細(xì)胞內(nèi)并被還原為半胱氨酸合成細(xì)胞內(nèi)主要的抗氧化劑GSH。GSH輔助GPX4還原脂質(zhì)過氧化物為無毒脂質(zhì)醇,發(fā)揮保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)及功能的作用[19]。研究發(fā)現(xiàn),亞砷酸鹽急劇降低了PC-12 細(xì)胞和海馬組織中SLC7A11和GPX4的表達(dá)而觸發(fā)鐵死亡[20]。因此,暴露于iAs可能破壞胱氨酸/谷氨酸逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白系統(tǒng),進(jìn)而抑制GPX4。GPX4 的消耗可導(dǎo)致脂質(zhì)自由基的積累,引起細(xì)胞鐵死亡。Wei等[21]研究發(fā)現(xiàn),NaAsO2誘導(dǎo)的非酒精性脂肪性肝炎中存在鐵死亡,當(dāng)NaAsO2刺激肝細(xì)胞時(shí)可降低GPX4的表達(dá),增加脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物進(jìn)而引起鐵死亡。本研究結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,NaAsO2染毒的LX-2細(xì)胞SLC7A11和GPX4蛋白水平均隨著iAs劑量的升高而降低。提示NaAsO2處理LX-2細(xì)胞可能通過降低SLC7A11、GPX4引起脂質(zhì)氧化物MDA水平升高而引起鐵死亡。

綜上所述,本研究在NaAsO2致LX-2細(xì)胞活化模型中發(fā)現(xiàn),iAs致LX-2細(xì)胞線粒體損傷、鐵離子水平升高并促進(jìn)鐵死亡水平升高。因此,靶向鐵死亡可能成為防治砷致肝纖維化的新方向。然而,本研究檢測指標(biāo)有限,未檢測改變鐵死亡水平后對(duì)纖維化指標(biāo)的影響。為此,需做大量研究工作來揭示iAs致肝纖維化與鐵死亡的關(guān)系。