基于鏈置換擴(kuò)增的電化學(xué)適配體生物傳感器檢測食品中的赭曲霉毒素A

劉 偉，張?zhí)N哲，楊 倩，范少華，田益玲，張 偉，4，5*

（1 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院 河北保定071000 2 河北大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院 河北保定071000 3 河北軟件職業(yè)技術(shù)學(xué)院 河北保定071000 4 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 河北保定071000 5 河北省人畜共患病原微生物分析與防控重點實驗室 河北保定 071000）

赭曲霉毒素A（Ochratoxin A，OTA）主要是由曲霉屬和青霉屬產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，常見于咖啡、小麥粉、葡萄酒、乳制品和水果等日常食品和食品原材料中[1-3]。OTA 理化性質(zhì)較穩(wěn)定，不易清除，對人類的腎、肝和腦等重要器官具有強(qiáng)烈毒性[4-5]。國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（International agency for research on cancer，IARC）于1993 年將OTA歸類為可能的人類致癌物2B 組[6]。

傳統(tǒng)檢測OTA 的方法包括：高效液相色譜法（High performance liquid chromatography，HPLC）[7]、氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用（Gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）[8]和薄層色譜（Thin-layer chromatography，TLC）[9]等色譜方法。其中高效液相色譜法具有高靈敏度，是檢測OTA 的主要方法之一。然而，其存在耗時長，設(shè)備昂貴，需要專業(yè)人員和大量試劑[10]等不足。傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫分析方法（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）具有檢測時間較短的優(yōu)點，然而其存在檢出限較高，所需抗原抗體合成價格昂貴，試劑需要冷藏保存，不適宜運(yùn)輸[11]等不足。而生物傳感器作為一種成本低廉的快速檢測手段，有望完善這些缺點[12]。

在OTA 特異性識別方面，傳統(tǒng)方法將抗體作為分子識別工具[13]，在食品分析中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。這些基于蛋白質(zhì)的抗體通常在動物體內(nèi)產(chǎn)生，導(dǎo)致其相對復(fù)雜的生產(chǎn)過程和昂貴的價格[14]。相比之下核酸適配體的獲取比傳統(tǒng)抗體更方便[15]，顯示出許多優(yōu)點，例如批次間變異低，免疫原性低，易用納米材料或有機(jī)染料分子進(jìn)行修飾等[16-17]。人們開始將核酸適配體作為識別分子來替代抗體的作用[18]。近些年，鏈置換擴(kuò)增（Strand displacement amplification，SDA）技術(shù)成為研究熱點，SDA 不需要精確控制溫度，可以與各種信號分子結(jié)合，增加其使用范圍[1]。同時電化學(xué)生物傳感器技術(shù)是公認(rèn)的應(yīng)用范圍廣、成本低的生物傳感器，其原理是通過生物識別元件與電化學(xué)換能器之間的結(jié)合，通過電分析技術(shù)進(jìn)行最終的信號響應(yīng)和測量[19-20]。電化學(xué)生物傳感器除了表現(xiàn)出生物傳感器本身固有的高特異性外，還結(jié)合了電分析技術(shù)的高靈敏度和低檢出限的優(yōu)點[21]。其樣品制備簡單，可以進(jìn)行現(xiàn)場快速檢測[22]。

目前，關(guān)于應(yīng)用鏈置換擴(kuò)增技術(shù)與電化學(xué)適配體傳感器進(jìn)行OTA 定量檢測鮮見報道。本文利用OTA 適配體的高特異性和鏈置換擴(kuò)增技術(shù)的寬線性檢測范圍，以及電化學(xué)生物傳感器技術(shù)的信號輸出反應(yīng)靈敏等優(yōu)點，將它們相結(jié)合，擬建立一種基于電化學(xué)適配體傳感器的定量檢測OTA的新方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

赭曲霉毒素A、赭曲霉毒素B（Ochratoxin B，OTB）、黃曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1）、玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN）、伏馬毒素B1（Fumonisin B1，F(xiàn)B1），普瑞邦生物工程有限公司提供。

Nb.BsrDI 切刻內(nèi)切酶、Bst DNA 聚合酶，NEB（北京）有限公司；MgSO4，寶生物工程（大連）有限公司；氯金酸，源葉生物有限公司；鐵氰化鉀、亞鐵氰化鉀，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；巰基乙醇（MCH），上海麥克林生化科技有限公司；三-膦鹽酸鹽（TCEP），合肥博美生物科技有限公司；氧化鋁拋光粉、玻碳電極（GCE）、鉑絲電極、Ag/AgCl 參比電極，武漢科斯特儀器股份有限公司；過硫酸銨溶液（AP），北京雷根生物技術(shù)有限公司；甲醇（分析純），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司

1.2 儀器與設(shè)備

場發(fā)射掃描電鏡（TESCAN MIRA LMS），泰思肯（中國）有限公司；CS350H 電化學(xué)工作站，武漢科思特儀器股份有限公司；凝膠成像儀（BINDA 2020D）北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；Step One Plus 熒光定量PCR 儀，新加坡生命科技控股有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 試驗原理 SDA 的電化學(xué)適配體生物傳感器的檢測原理見圖1。首先利用OTA 適配體對OTA 進(jìn)行特異性識別，形成反平行G-四鏈體結(jié)構(gòu)[23]，觸發(fā)SDA 反應(yīng)產(chǎn)生大量目標(biāo)產(chǎn)物（圖1a）。通過Au-S 鍵將發(fā)夾探針修飾在金電極表面，加入MCH 封閉電極表面活性位點，實現(xiàn)電化學(xué)探針的垂直定向，使二茂鐵（Fc）靠近電極表面[24]，此時電流峰值為I0。電極與SDA 產(chǎn)物DNA 反應(yīng)后，探針頸部被打開，F(xiàn)c 與電極表面距離發(fā)生改變，此時電流峰值為I（圖1b）。通過計算得出產(chǎn)物DNA的反應(yīng)生成濃度，即ΔI%=（I0-I）/I0。

圖1 本研究檢測原理圖Fig.1 Schematic diagram of the detection principle in this study

1.3.2 發(fā)卡、引物與電化學(xué)探針設(shè)計 通過NUPACK 設(shè)計發(fā)卡、引物與電化學(xué)探針，其核酸序列見表1。發(fā)卡模板由Wang 等[25]篩選出的OTA 適配體序列、Nb.BsrDI 內(nèi)切酶識別序列以及電化學(xué)探針互補(bǔ)序列組成，發(fā)卡模板序列的3′端修飾spacer。由于Nb.BsrDI 內(nèi)切酶的識別序列為5′-NNCATTGC-3′（N 代表任意G、A、T、C 堿基），因此本試驗在發(fā)卡模板中設(shè)計的序列為該識別序列的反向互補(bǔ)序列5′-GCAATGNN-3′。

表1 試驗所用核酸序列Table 1 The nucleic acid sequences used in this study

1.3.3 電化學(xué)適配體傳感器的方法的建立

1）孵育過程 先將發(fā)卡模板在95 ℃條件下預(yù)變性5 min。將不同濃度的1.0 μL OTA 與1.0 μL 發(fā)卡（10 μmol/L）、1.0 μL 引物（10 μmol/L）、1.0 μL dNTPs（10 mmol/L）、2.0 μL Bst DNA 聚合酶緩沖液（10×）和2.0 μL Cutsmart 緩沖液（10×）混勻，加入蒸餾水（ddH2O），體系共16 μL，在37 ℃下避光孵育30 min。

2）擴(kuò)增過程 在孵育后的體系中加入2.0 μL Bst DNA 聚合酶（8 U/μL）、2.0 μL Nb.BsrDI內(nèi)切酶（10 U/μL），終體系為20 μL。振蕩混勻后65 ℃條件下反應(yīng)30 min。

3）電化學(xué)反應(yīng)過程 將試驗所用玻碳電極用粒徑分別為1.0，0.3，0.05 μm 的Al2O3粉末拋光，再用乙醇和超純水去除殘留的Al2O3粉末。在1%AuNPs 溶液中采用恒電位極化，得到AuNPs 修飾的電極。

將電化學(xué)探針用10 mmol/L 的TCEP 稀釋至100 μmol/L，于37 ℃避光還原1 h。再將電化學(xué)探針稀釋至6 μmol/L，取10 μL 滴加在電極表面，37℃避光孵育4 h。將修飾好的電極浸入10 mmol/L Tris 緩沖液中浸泡30 min。浸入2 mmol/L MCH 中處理30 min 后通過方波伏安法（SWV）測量其初始電信號強(qiáng)度。

將測量初始信號后的電極于37 ℃浸泡在含有擴(kuò)增產(chǎn)物的離心管中80 min，清洗晾干后，通過SWV 方法測量其電信號強(qiáng)度。

1.3.4 聚丙烯酰胺凝膠電泳驗證 將DNA 擴(kuò)增產(chǎn)物與DNA 上樣緩沖液（體積比4∶1）混合后，每個樣品加入新制備的20%聚丙烯酰胺凝膠（Poly acrylamide gel electrophoresis，PAGE）中[26-27]。在1×TBE 緩沖液（pH 8.0）中，電壓120 V 條件下電泳60 min。最終將凝膠在染色液中染色60 min，使用凝膠成像儀成像。

1.3.5 方波伏安法檢測驗證 為驗證本試驗開發(fā)的電化學(xué)適配體傳感器的可行性，分別設(shè)計陽性對照和空白對照試驗。分別浸泡在測試液中通過SWV 方法測量電信號強(qiáng)度，以評估該傳感器的可行性。

1.3.6 電化學(xué)表征 將未修飾的裸電極（玻碳電極）和修飾上AuNps 的金電極用SEM 方法觀察。通過CV 和EIS 電化學(xué)表征方法表征。

1.3.7 電化學(xué)適配體傳感器的靈敏度和檢出限 各取1 μL 的不同濃度的OTA 進(jìn)行電化學(xué)信號檢測，得到的電流變化值ΔI（%）數(shù)據(jù)。以不同濃度的OTA 濃度和電流變化值ΔI（%）為橫、縱坐標(biāo)繪制曲線，得到線性回歸方程，確定靈敏度與檢測限。

1.3.8 電化學(xué)適配體傳感器的特異性、重復(fù)性和穩(wěn)定性 為了驗證本試驗的特異性，選取OTB、FB1、AFB1、ZEN 為對比毒素。在最適反應(yīng)條件下，將1 ng/mL OTA 擴(kuò)增體系與質(zhì)量濃度均為1 ng/mL 的參考毒素（OTB、FB1、AFB1、ZEN）、混合組1（含OTA、OTB、FB1、AFB1、ZEN，質(zhì)量濃度均為1 ng/mL）、混合組2（含OTB、FB1、AFB1、ZEN，質(zhì)量濃度均為1 ng/mL）和空白對照共8 組進(jìn)行特異性驗證。

本試驗同時用8 根電極在相同條件下對于同一質(zhì)量濃度（1 ng/mL）的OTA 毒素進(jìn)行檢測，驗證該方法的重復(fù)性。

此外，為研究本方法的穩(wěn)定性，將數(shù)根修飾電化學(xué)探針的電極存放于4 ℃條件儲存2 周來評估該傳感器的穩(wěn)定性，分別在第1，2，3，5，7，14 天取出與相同擴(kuò)增產(chǎn)物反應(yīng)后，進(jìn)行SWV 方法測量，得到的信號值與初始信號值進(jìn)行對比分析，以驗證該方法的穩(wěn)定性。

1.3.9 人工加標(biāo)試驗 在小麥粉原材料、咖啡和紅酒等食品中進(jìn)行人工污染檢測。為了驗證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，同時使用本方法和商業(yè)ELISA 試劑盒方法的檢測結(jié)果進(jìn)行對比。

將小麥和咖啡固體樣品用粉碎機(jī)粉碎后過20 目的篩。稱取小麥粉樣品5.0 g、咖啡粉樣品2.5 g，分別加入25 mL 60%甲醇溶液，劇烈振蕩5 min，4 000 r/min 離心10 min。取上清液，采用孔徑0.22 μm 的針頭式過濾器過濾，向濾液中加入不同濃度的OTA 標(biāo)準(zhǔn)品。取紅酒樣品1 mL，加入4 mL蒸餾水，再加入不同濃度的OTA 標(biāo)準(zhǔn)品。將處理完畢的樣品同時用電化學(xué)適配體傳感器和商業(yè)ELISA 試劑盒檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗可行性驗證

聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）結(jié)果如圖2a 所示，在泳道1 中，沒有OTA 存在的情況下，在70～80 bp 處產(chǎn)生明亮條帶，表明發(fā)卡結(jié)構(gòu)未打開，無法產(chǎn)生后續(xù)反應(yīng)，在20 bp 處未發(fā)現(xiàn)目標(biāo)長度條帶。泳道2 中，存在OTA 的情況下，發(fā)卡結(jié)構(gòu)打開，引物與發(fā)卡模板結(jié)合并進(jìn)行擴(kuò)增，在接近20 bp 處發(fā)現(xiàn)目標(biāo)長度條帶，表明反應(yīng)正常發(fā)生。這些結(jié)果證實基于發(fā)卡結(jié)構(gòu)的用于檢測OTA 的SDA 擴(kuò)增反應(yīng)成功構(gòu)建。

圖2 可行性分析圖Fig.2 Feasibility analysis diagram

SWV 分析結(jié)果如圖2b 所示，當(dāng)電化學(xué)探針修飾到電極表面時，可以在0.2～0.6 V 點位區(qū)間內(nèi)觀察到二茂鐵（Fc）的電信號。當(dāng)溶液中不存在OTA 時，F(xiàn)c 信號電流值（曲線a）依舊可以保持較強(qiáng)的電信號。當(dāng)溶液中存在OTA 時，電極上修飾的Fc 與電極表面的距離變大，使Fc 信號電流值（曲線b）變小。由可行性試驗結(jié)果可知，所建立的電化學(xué)傳感器可用于檢測OTA。

2.2 修飾電極的表征

2.2.1 修飾電極的掃描電鏡表征分析 用掃描電鏡觀察玻碳電極和鍍金電極的表面，結(jié)果如圖3a所示。改性前，在玻碳電極上未觀察到雜質(zhì)，為后續(xù)的AuNPs 修飾提供了良好的條件。在玻碳電極上電沉積金后，由圖3b 可知，玻碳電極表面形成一層均勻的AuNPs，表明玻碳電極與AuNPs 成功結(jié)合，與文獻(xiàn)[28]報道一致。

圖3 電極表征掃描電鏡圖Fig.3 SEM of electrode characterization of electrode characterization

2.2.2 修飾電極的電化學(xué)表征 通過EIS 和CV對修飾電極進(jìn)行電化學(xué)表征，結(jié)果如圖4 所示。圖4a 為CV 圖，由于AuNPs 導(dǎo)電性較強(qiáng)，修飾AuNPs 電極的氧化-還原峰值（曲線a）較玻碳電極的氧化-還原峰值（曲線b）有明顯的上升。固定電化學(xué)探針后，電極的氧化-還原峰值（曲線c）降低，表明電化學(xué)探針成功固定在電極表面[29]。將電極用MCH 浸泡，電極的氧化-還原峰值（曲線d）降低，表明MCH 成功封閉電極。最后，將電極浸泡在擴(kuò)增反應(yīng)液后，觀察到氧化-還原峰值（曲線e）降低，表明電極表面的電化學(xué)探針與擴(kuò)增反應(yīng)所產(chǎn)生的單鏈產(chǎn)物發(fā)生DNA 互補(bǔ)雜交。

圖4 電化學(xué)傳感器的CV（a）和EIS（b）圖Fig.4 CV（a）and EIS（b）diagrams of the electrochemical sensor

電化學(xué)阻抗譜通常用于研究不同物質(zhì)對電極表面的修飾[30]。EIS 曲線中，半圓半徑與法拉第反應(yīng)電荷轉(zhuǎn)移阻抗（Rct）相關(guān)[31]。圖4b 為EIS 圖，金電極幾乎呈直線（曲線a），與裸電極的半徑（曲線b）相比，有較快的電子轉(zhuǎn)移率，電阻率更低，表明AuNPs 成功修飾。當(dāng)電化學(xué)探針固定在電極上時，觀察到曲線半徑增大（曲線c），Rct 值增加，表明電化學(xué)探針成功修飾。隨后，電極表面被MCH 鈍化，曲線半徑進(jìn)一步增大（曲線d），Rct 值增加。將電極與擴(kuò)增產(chǎn)物單鏈DNA 反應(yīng)后，單鏈DNA 與分子開關(guān)的環(huán)區(qū)完全互補(bǔ)，曲線半徑（曲線e）達(dá)到最大值，Rct 值增大，EIS 結(jié)果與CV 結(jié)果保持一致，表明本研究中傳感器被成功構(gòu)建。

2.3 電化學(xué)適配體傳感器靈敏度和檢出限

在最優(yōu)條件下，通過SDA 擴(kuò)增反應(yīng)，將所制備的電化學(xué)生物傳感器用于檢測不同濃度的OTA。如圖5a 所示，用該方法檢測不同濃度OTA后所對應(yīng)的不同電流信號I，隨著OTA 濃度不斷增大，SWV 檢測的電流值不斷減小。結(jié)果表明，隨著SDA 擴(kuò)增產(chǎn)物單鏈DNA 的不斷增加，與其結(jié)合的電化學(xué)探針不斷增加，電流值不斷降低，呈良好的線性關(guān)系。

圖5 基于鏈置換擴(kuò)增的電化學(xué)生物傳感器的檢測性能Fig.5 The detection performance of an electrochemical biosensor based on strand displacement amplification

如圖5b 所示，ΔI（%）隨OTA 質(zhì)量濃度（0.05 pg/mL～10 ng/mL）的增加而增加，電流峰值的變化量ΔI（%）與OTA 濃度的對數(shù)在0.1 pg/mL～10 ng/mL 范圍內(nèi)保持良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2=0.997，線性回歸方程為y=9.2846lgCOTA+68.9217。OTA 電化學(xué)適配體傳感器方法的檢測限為0.05 pg/mL，綜上表明本研究的方法可用于定量檢測OTA。

2.4 傳感器特異性

電化學(xué)適配體生物傳感器的特異性結(jié)果如圖6 所示。圖6a 為該試驗特異性的PAGE 結(jié)果，膠圖中顯示的OTA 和混合組A 產(chǎn)生擴(kuò)增反應(yīng)，而OTB、AFB1、FB1、ZEN 和混合組B 的條帶與空白對照結(jié)果相同，表明該電化學(xué)適配體傳感器的特異性良好。圖6b 為電流變化比（ΔI）的結(jié)果，OTB、AFB1、FB1、ZEN 和混合組B 的ΔI（%）幾乎與空白對照的ΔI（%）相同，而OTA 與混合組A 的ΔI（%）基本處于較高水平。證實了電化學(xué)生物傳感器的特異性良好，混合類樣品對傳感器的影響較低，在區(qū)分OTA 與其它毒素方面表現(xiàn)出高特異性。

圖6 基于鏈置換擴(kuò)增的電化學(xué)適配體傳感器的特異性檢測Fig.6 Specificity detection of electrochemical biosensor based on strand displacement amplification

2.5 傳感器重復(fù)性及穩(wěn)定性

驗證該電化學(xué)適配體傳感器的重復(fù)性和穩(wěn)定性結(jié)果如圖7 所示。圖7a 表示該方法的重復(fù)性結(jié)果，在相同試驗操作下，本試驗的ΔI（%）的RSD為2.63，表明本方法具有良好的重復(fù)性。圖7b 表示該方法的穩(wěn)定性，第14 天的ΔI（%）仍達(dá)到其初始值（91.51%），反應(yīng)后的電極經(jīng)14 d 保存，其結(jié)果準(zhǔn)確率仍保持在90%以上，表明電化學(xué)適配體傳感器具有高穩(wěn)定性。

圖7 基于鏈置換擴(kuò)增的電化學(xué)適配體傳感器的重復(fù)性和穩(wěn)定性檢測Fig.7 Repeatability detection of electrochemical aptamer sensor based on strand displacement amplification

2.6 方法的回收率

為了研究電化學(xué)適配體傳感器檢測實際樣品的能力，用小麥粉、咖啡和紅酒樣品進(jìn)行回收率測定。在不同處理后的食品樣品中加入終質(zhì)量濃度為5 ng/mL 和10 ng/mL 的OTA 標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行電化學(xué)適配體傳感器和ELISA 檢測，結(jié)果見表2。電化學(xué)適配體傳感器的加標(biāo)回收率在96.60%～99.04%之間，RSD 低于5%，而商業(yè)ELISA 試劑盒的加標(biāo)回收率在94.00%～98.50%之間。表明本試驗開發(fā)的電化學(xué)適配體傳感器具有實際檢測食品中OTA的能力，相較于ELISA 方法具有更高的準(zhǔn)確性。

表2 人工加標(biāo)食品樣品中OTA 含量檢測及與ELISA 方法比較Table 2 The content of OTA in artificially labeled food samples was detected and compared with ELISA

3 結(jié)論

1）構(gòu)建了一種快速檢測食品中OTA 的電化學(xué)生物傳感器，通過電信號快速響應(yīng)，準(zhǔn)確靈敏。

2）開發(fā)的電化學(xué)適配體傳感器，實現(xiàn)了0.1 pg/mL～10 ng/mL 的線性檢測范圍，檢出限為0.05 pg/mL，低于國家標(biāo)準(zhǔn)（GB 5009.96-2016）。與其它檢測OTA 的生物傳感器方法[32-34]相比，本試驗具有良好的線性檢出范圍及檢出限。

3）特異性試驗中，2 組含有OTA 的試驗組呈陽性，6 組不含有OTA 的試驗組呈陰性，表明該方法具有較強(qiáng)的特異性。本試驗的重復(fù)性RSD 為2.63%，穩(wěn)定性結(jié)果：在14 d 內(nèi)信號保持率為91.55%。

4）人工加標(biāo)回收率檢測中，該電化學(xué)適配體傳感器的檢測回收率為96.60%～99.04%，ELISA的加標(biāo)回收率為94.00%～98.50%，表明該方法具有現(xiàn)場快速、準(zhǔn)確檢測食品中OTA 毒素的能力，實用性較高。