大豆7S 蛋白-殼聚糖自組裝核殼納米顆粒的載體性質(zhì)研究

劉玲玲，劉思琪，劉 晨，陳培鑫，班兆軍

（浙江科技學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院 浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室浙江省農(nóng)業(yè)生物資源生化制造協(xié)同創(chuàng)新中心 杭州 310023）

近年來(lái)，姜黃素因其氧化、抑菌、抗炎、抗癌、神經(jīng)保護(hù)和傷口愈合等藥理作用而備受關(guān)注[1]。然而，姜黃素較差的水溶性和化學(xué)不穩(wěn)定性，導(dǎo)致其生物利用度極低[2]。研究表明，具有高載藥量和智能遞送特性的“核-殼”型顆粒，可有效改善難溶活性物質(zhì)的水溶性和穩(wěn)定性。與普通的納米粒子相比，“核-殼”型納米顆粒具有更多的優(yōu)勢(shì)，如更高的分散性、更好的控制釋放特性、更強(qiáng)的消化穩(wěn)定性等[3-5]。目前，已有多種“核-殼”型多糖-蛋白質(zhì)材料被成功制備，作為活性成分的遞送和控釋載體[6-8]。Zhu 等[9]介紹了1 種殼寡糖和酪蛋白磷酸肽“核-殼”型微粒，該顆粒不僅顯著提高了鈣結(jié)合能力，還實(shí)現(xiàn)對(duì)姜黃素的控制釋放。Tan 等[10]利用反相微乳液聚合法制備的多糖-蛋白質(zhì)“核-殼”型納米粒子用于包封花青素，表現(xiàn)出較高的包封效率和抗環(huán)境干擾能力，同時(shí)具有良好的生物相容性和細(xì)胞吸收能力。

通過(guò)一定的誘導(dǎo)手段，具有親水基團(tuán)和疏水基團(tuán)的兩親性聚合物在水溶液中可自發(fā)形成“核-殼”型納米顆粒[11-12]。鑒于此，本文利用大豆7S 蛋白和CS 分子的親水性差異，通過(guò)具有鹽溶效應(yīng)的尿素調(diào)控分子間相互作用力，最終形成具有“核-殼” 型結(jié)構(gòu)的納米輸送載體。利用原子力顯微鏡（AFM）、等溫滴定微量熱儀（ITC）、紅外光譜儀（FTIR）、動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)（DLS）及透射電子顯微鏡（TEM）等儀器表征相關(guān)納米顆粒的形貌及結(jié)構(gòu)，并對(duì)其在模擬胃腸環(huán)境中的釋放特性和抗腫瘤活性進(jìn)行測(cè)定，以期為食品醫(yī)藥領(lǐng)域的實(shí)際應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

大豆7S 蛋白利用脫脂豆粕實(shí)驗(yàn)室自制。殼聚糖（Mw=200 ku，脫乙酰度≥90%），阿拉丁公司。姜黃素（～98%）、豬膽汁提取物（B8631）、胰酶（P1750）、胃蛋白酶（P7000），美國(guó)Sigma 公司，其它化學(xué)品均為分析純級(jí)。

1.2 儀器與設(shè)備

Nano-ZS 型激光動(dòng)態(tài)粒度掃描儀，英國(guó)Malvern 公司；原子力顯微鏡，德國(guó)Bruker 公司；F-7000 型熒光分光光度計(jì)，日本Hitachi 公司；圓二色譜儀，英國(guó)AplliedPhotophysics 有限公司；等溫量熱滴定儀，美國(guó)MicroCal 公司。

1.3 制備方法

大豆7S（d-7S）和殼聚糖（d-CS）的解離：將7S（200 mg）和CS（200 mg）分別溶解在20 mL 解離溶液（0.5%冰醋酸，6 mol/L 尿素）中。完全溶解后，用乙酸將最終pH 值調(diào)至5.5，并在4 ℃下孵育10 h以上以完全解離。

大豆7S-殼聚糖“核-殼”型顆粒（SCP）和負(fù)載姜黃素的大豆7S-殼聚糖 “核殼” 型顆粒（Cur-SCP）的制備：將d-7S 和d-CS 溶液等比例混合，使用分子質(zhì)量為8.0～14 ku 的透析管在4 ℃下用去離子水透析2 d 以去除尿素。將透析完成后的混合液離心（8 000×g，20 min），上清液即為SCP 溶液。制備負(fù)載姜黃素的Cur-SCP 顆粒溶液，需要在與d-CS 溶液混合前，將姜黃素乙醇溶液添加到20 mL d-7S 溶液中。其它步驟同SCP 的制備方法。

1.4 7S 和CS 解離過(guò)程的表征

用乙酸-乙酸鈉緩沖液（10 mmol/L pH 5.5）將待測(cè)樣品稀釋至20 μg/mL，滴加在云母片上，于37 ℃烘箱中干燥30 min 后進(jìn)行AFM 觀察。驅(qū)動(dòng)頻率設(shè)置為300 kHz，掃描速率為1.2 Hz。圖像由Digital Nanoscope 軟件處理。

1.5 顆粒的表征

1.5.1 顆粒的平均粒徑、電位及微觀形貌 根據(jù)動(dòng)態(tài)光散射（DLS）技術(shù)測(cè)量了樣品的平均粒徑及光散射強(qiáng)度。測(cè)量前，溶液用經(jīng)0.22 μmol/L PES水系濾膜過(guò)濾的PBS 溶液（10 mmol/L，pH 7.0）稀釋至1 mg/mL。蛋白顆粒的電位用Nano zs 儀測(cè)定，測(cè)量溫度為25 ℃。顆粒的微觀形貌用TEM 和AFM 進(jìn)行觀察。

1.5.2 CS 和7S 的相互作用 利用低容量納米ITC 儀在25 ℃對(duì)樣品進(jìn)行ITC 測(cè)量，得到大豆7S和CS 復(fù)合過(guò)程的熱力學(xué)性質(zhì)。將300 μL d-7S（1 mg/mL）溶液加入樣品池中，參考池中加入同體積的去離子水，注射器中加入50 μL 質(zhì)量濃度為5 mg/mL 的d-CS。所有樣品在測(cè)試前真空脫氣20 min。校正試驗(yàn)為d-CS 溶液滴定6 mol/L 尿素pH=5.5 乙酸緩沖液。通過(guò)扣除樣品滴定緩沖液的稀釋熱得到相應(yīng)的d-CS 滴定d-7S 的反應(yīng)熱。

SCP 顆粒的結(jié)構(gòu)特性則采用傅里葉變換紅外分析儀測(cè)定，測(cè)定條件為：掃描范圍400～4 000 cm-1，掃描分辨率4 cm-1。

1.5.3 顆粒的載體性質(zhì) 被包封在SCP 納米顆粒中的姜黃素可以通過(guò)以下公式計(jì)算：

未結(jié)合的姜黃素是指透析后離心所得的沉淀物中姜黃素的含量，該沉淀物用乙酸乙酯充分溶解后，離心取上清液，用紫外-分光光度計(jì)測(cè)定在波長(zhǎng)420 nm 處的吸光值并計(jì)算所得。

1.6 釋放特性及抗腫瘤活性

使用體外模擬胃（1 h）、小腸（2 h）消化模型評(píng)估Cur-SCP 中姜黃素的釋放特性[13]。在不同消化時(shí)間點(diǎn)，取0.5 mL 消化液離心（15 000×g，30 min），并測(cè)量上清液中殘留的姜黃素。

取Caco-2 細(xì)胞懸液接種到96 孔培養(yǎng)板中，置于培養(yǎng)箱中（37 ℃，5%CO2）孵化24 h，丟棄培養(yǎng)介質(zhì)，并用100 μL PBS 清洗。之后，向96 孔培養(yǎng)板中分別加入用培養(yǎng)液稀釋成原濃度0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%（V/V）的SCP、Cur-SCP 和游離姜黃素消化液，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后，使用倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，并用亞甲基藍(lán)法讀取細(xì)胞在波長(zhǎng)570 nm 處的OD 值，按照下述公式計(jì)算消化后結(jié)腸腺癌細(xì)胞Caco-2 對(duì)樣品的存活率。

式中，As——樣品的吸光度；而Ac——空白對(duì)照組的吸光度。

1.7 數(shù)據(jù)分析

除特別說(shuō)明，每次試驗(yàn)進(jìn)行3 次重復(fù)。試驗(yàn)數(shù)據(jù)通過(guò)數(shù)據(jù)分析軟件SPSS 進(jìn)行方差分析，并用Duncan 多重比較分析不同處理間的顯著性差異（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆7S 蛋白和CS 的解離及重組過(guò)程

有機(jī)大分子的簇集和自卷現(xiàn)象是其很重要的性質(zhì)之一。通過(guò)自卷的方式，有機(jī)大分子的疏水基團(tuán)聚集于分子內(nèi)部，而親水基團(tuán)包圍在分子外部，以形成在水相中穩(wěn)定存在的結(jié)構(gòu)。具有鹽溶效應(yīng)的尿素可以降低溶劑的促簇能力（Solvent aggregation power），將包裹在分子內(nèi)部的疏水基團(tuán)徹底暴露出來(lái)，為疏水活性物質(zhì)提供更多的結(jié)合位點(diǎn)[14]。CS 和大豆7S 在低pH 值（4.5～6）下會(huì)形成不溶性凝聚物。從AFM 微觀圖觀察到，單獨(dú)的7S 和CS 在pH=5.5 條件下會(huì)自聚集成較大顆粒（圖1，～93 nm 和187 nm），這與Yuan 等[15]在低pH 條件下觀察的結(jié)果一致。尿素分子可以通過(guò)破壞分子間氫鍵和疏水相互作用力，從而使大分子發(fā)生解離。圖1 顯示，經(jīng)尿素處理的7S 和CS 粒徑大大降低（～16 nm 和41 nm），并由團(tuán)聚的顆粒狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槿犴樀木€條狀或棒狀，說(shuō)明7S 和CS 發(fā)生了解離。

圖1 天然7S（A）、CS（B）和解離7S（d-7S，A′）、CS（d-CS，B′）的AFM 圖像（a）和機(jī)理圖（b）Fig.1 Typical AFM 2D images（a）and mechanograms（b）of particles in nature 7S（A），CS（B）and denatured 7S（A′），CS（B′）

本試驗(yàn)利用ITC 技術(shù)定量分析d-7S 和d-CS混合時(shí)形成復(fù)合物的飽和濃度[16]。如圖2 顯示，熱流量隨著滴定時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，這說(shuō)明在這個(gè)環(huán)境中，兩種滴定物之間存在相互作用，且兩者形成復(fù)合物的過(guò)程是一個(gè)放熱過(guò)程，放熱焓變值為8 kcal/mol。此外，滴定反應(yīng)在CS 與大豆7S 比例達(dá)到0.5 g/g 時(shí)達(dá)到平衡，這說(shuō)明7S-CS 復(fù)合物在這一比例下達(dá)到飽和，這個(gè)現(xiàn)象與其他研究者的報(bào)道乳球蛋白與殼聚糖的結(jié)果類似。因此，當(dāng)體系中CS∶7S 小于0.5 g/g，體系中主要以解離的蛋白亞基和復(fù)合物組成；當(dāng)體系中CS∶7S 大于0.5 g/g，體系中主要以解離的CS 和復(fù)合物組成。

圖2 d-CS 與d-7S 的結(jié)合的ITC 測(cè)定結(jié)果Fig.2 ITC determination of the binding of d-CS to d-7S

2.2 SCP 顆粒的形成與結(jié)構(gòu)表征

為了獲得重組SCP 顆粒，對(duì)7S-CS 解離溶液進(jìn)行緩慢透析，并監(jiān)測(cè)透析過(guò)程中重組顆粒的Dz及光散射強(qiáng)度變化（圖3a）。在0～36 h 的透析過(guò)程中，溶液的Dz值和光散射強(qiáng)度均呈逐漸增加的趨勢(shì)，說(shuō)明顆粒正在發(fā)生重組裝行為。當(dāng)透析時(shí)間進(jìn)一步延長(zhǎng)到48 h，溶液的Dz和光散射強(qiáng)度變化則逐漸平穩(wěn)，這說(shuō)明溶液在透析時(shí)間為48 h 時(shí)，可以形成穩(wěn)定的重組顆粒。經(jīng)DLS 技術(shù)測(cè)定，重組顆粒的平均粒徑為197 nm，微觀圖見(jiàn)圖4。利用粒子表面電荷直接相關(guān)的電位研究7S 蛋白與CS 之間的相互作用，得到圖3b 所示結(jié)果。從圖中可以看出，SCP 顆粒的ζ 電位值在CS 和7S 之間，并且更趨于CS 的ζ 電位值，說(shuō)明CS 和7S 發(fā)生了相互作用，并且重組顆粒的表面更大可能由CS 覆蓋[17]。

圖3 透析時(shí)間對(duì)重組SCP 顆粒的平均粒徑和光散射強(qiáng)度的影響（a）；pH 對(duì)7S、CS 及SCP 顆粒ζ-電位的影響（b）Fig.3 Effect of dialysis on SCP particle size and derived count rate（a）；the ζ-potentials of the 7S，CS and SCP as function of pH（b）

圖4 d-7s/d-cs 復(fù)合物、SCP、Cur-SCP 顆粒的TEM 和AFM 2D 圖像Fig.4 Typical TEM and AFM 2D images of d-7s/d-cs complex，SCP and Cur-SCP

大豆7S 和CS 在共溶劑（6 mol/L 尿素，pH 5.5）中的親水性不同，其中CS 是親溶劑的，7S 因帶有較多疏水氨基酸而具有一定的疏水性。當(dāng)CS∶7S 比例為1∶1 時(shí)（大于0.5 g/g），在透析緩慢去除共溶劑尿素過(guò)程中，復(fù)合物在7S 的疏水牽引下優(yōu)先發(fā)生聚集，而多余的d-CS 則在靜電左右下吸附在復(fù)合物聚集顆粒的附近形成親溶劑的微區(qū)，從而阻止更大聚集體的產(chǎn)生，最終得到以7S 相對(duì)集中的核和以CS 相對(duì)集中的殼的組裝顆粒，其形成機(jī)理如圖4 所示。

2.3 SCP 顆粒的載體性質(zhì)

為了探究SCP 顆粒的載體性質(zhì)，考察了在7S和CS 質(zhì)量濃度均為10 mg/mL 條件下，制備的SCP 對(duì)姜黃素的包封率（EE%）和荷載量（LA）的影響。如圖5 所示，當(dāng)[Cur]=2.0 mg/mL 時(shí)，包封率為91.5%±4.7%，每100 g 7S 可荷載18.3 g 的姜黃素（圖5a）。顯著高于經(jīng)加熱超聲處理的大豆分離蛋白（14.45%）納米復(fù)合物中姜黃素的最大荷載量[18]，以及酪蛋白納米膠囊中姜黃素的最大LA（0.19%）[19]。

圖5 SCP 顆粒中姜黃素的包封率和荷載量（a）及姜黃素在模擬胃腸液中的釋放規(guī)律（b）Fig.5 Encapsulation rate and loading of curcumin in SCP particles（a）and curcumin release pattern in simulated gastrointestinal fluid（b）

通過(guò)評(píng)估姜黃素在體外模擬消化過(guò)程中的釋放速率，來(lái)評(píng)估SCP 顆粒對(duì)姜黃素的生物可及性（圖5b）。如圖所示，游離姜黃素（預(yù)先溶于乙醇中）在消化液中遇水會(huì)發(fā)生結(jié)晶，導(dǎo)致其在整個(gè)消化過(guò)程中的釋放速率低于5%。對(duì)照組包封的姜黃素在消化過(guò)程中快速釋放并達(dá)到最大釋放量，這是因?yàn)镃S 和7S 在模擬胃液中均帶有正電荷，兩者間的作用力由靜電引力變?yōu)殪o電斥力，顆粒完整性遭到破壞，姜黃素被快速釋放[20]。而SCP 顆粒在整個(gè)消化過(guò)程中均勻緩慢釋放，這是因?yàn)镃S 殼層可以保護(hù)7S 內(nèi)核不被胃蛋白酶水解，而在腸消化過(guò)程中，卻能因pH 轉(zhuǎn)變完全有效的水解達(dá)到與對(duì)照樣品同樣的生物可及性。

2.4 消化后姜黃素對(duì)Caco-2 細(xì)胞的增殖抑制活性

用培養(yǎng)液將稀釋后的消化液樣品作用于Caco-2 細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)沒(méi)有添加姜黃素的SCP 消化液對(duì)Caco-2 細(xì)胞沒(méi)有明顯的細(xì)胞毒性，說(shuō)明其具有在功能食品上應(yīng)用的可能性（圖6）。Cur-SCP 和游離姜黃素（溶解于DMSO）消化液對(duì)Caco-2 細(xì)胞的增殖抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系，隨著作用濃度升高細(xì)胞增殖抑制活性增大（圖6），兩者對(duì)Caco-2 細(xì)胞的增殖抑制活性沒(méi)有顯著性差異。通過(guò)對(duì)Caco-2 細(xì)胞形態(tài)的觀察（圖7），發(fā)現(xiàn)在含有SCP培養(yǎng)液的細(xì)胞形態(tài)沒(méi)有發(fā)生明顯變化，而Cur-SCP 和游離姜黃素在姜黃素濃度大于60 μmol/L時(shí)，細(xì)胞均出現(xiàn)更多的邊圓、細(xì)胞核固縮等細(xì)胞凋亡特征。以上結(jié)果說(shuō)明，SCP 的包埋并沒(méi)有損害姜黃素的抗腫瘤活性，利用該組裝方法可以很好的提高姜黃素的溶解性，為開(kāi)發(fā)預(yù)防腫瘤的功能食品或藥品提供良好的途徑。

圖6 SCP、Cur-SCP 和游離姜黃素消化液對(duì)結(jié)腸腺癌細(xì)胞Caco-2 的增殖抑制作用Fig.6 The proliferation inhibition of Caco-2 by SCP，Cur-SCP and free curcumin digests

圖7 用SCP、Cur-SCP 和游離姜黃素消化液孵育的Caco-2 癌細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)Fig.7 Cell morphologies of Caco-2 cancer cells incubated in the digestion juice of SCP，Cur-SCP and free curcumin

3 結(jié)論

本文利用尿素調(diào)控7S 和CS 的解離與重組過(guò)程，提出了1 種簡(jiǎn)單且適用于蛋白質(zhì)和多糖等生物大分子的“核-殼”型納米顆粒的制備方法。通過(guò)對(duì)組裝顆粒的表面性質(zhì)、微觀形態(tài)、結(jié)構(gòu)特性、消化性、體外活性等進(jìn)行表征和分析，發(fā)現(xiàn)該粒子具有較高的包封率和消化穩(wěn)定性。多糖殼層可以保護(hù)大豆7S 內(nèi)核，避免其在消化道過(guò)早水解，同時(shí)減緩姜黃素在小腸中的釋放速率。組裝顆粒對(duì)姜黃素的包埋仍然保留了姜黃素原有的抗腫瘤活性，因此這種特點(diǎn)非常適用于開(kāi)發(fā)以共組裝納米顆粒為輸送載體的口服營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)產(chǎn)品，對(duì)于即載藥物的持續(xù)釋放和藥物的智能輸送有重大借鑒意義。