小貫小綠葉蟬刺吸對青心大冇美人茶香氣和滋味代謝物的影響

李明金，朱艷宇，何春梅，閆佳偉，金 珊

（福建農(nóng)林大學園藝學院，福建 福州 350002）

烏龍茶是一種典型的半發(fā)酵茶，以其獨特的風味和多種保健功效而聞名，廣受國內(nèi)外市場歡迎[1]。美人茶是一種深度發(fā)酵的烏龍茶（60%～80%發(fā)酵），選用被小貫小綠葉蟬Empoasca onukiiMatsuda（以下簡稱葉蟬）吸食的一芽二葉鮮葉加工而成，以其獨特的熟果香、蜂蜜香而受到專家的推崇。

茶葉中具有豐富的次生代謝物，其中包括萜類化合物、生物堿、苯丙烷和相關(guān)苯基化合物等，從而形成茶葉多樣的品質(zhì)風味[2]。葉蟬刺吸可調(diào)節(jié)茶葉中的代謝物組成，進而形成美人茶獨特的滋味和香氣品質(zhì)特征。目前的研究多集中在葉蟬刺吸對茶鮮葉中代謝產(chǎn)物的影響[3-4]，而有關(guān)葉蟬刺吸對美人茶代謝物的影響鮮有報道。前人在一項關(guān)于葉蟬吸食密度對茶葉揮發(fā)性代謝物影響的研究中發(fā)現(xiàn)，茶葉中揮發(fā)性成分的數(shù)量與葉蟬吸食密度有關(guān)[5]。Chien等[6]研究不同葉蟬侵染程度的東方美人茶葉中蛋白質(zhì)表達的差異情況，發(fā)現(xiàn)89 種蛋白質(zhì)表達有顯著差異，這些蛋白質(zhì)可能產(chǎn)生或改變代謝物。這些結(jié)果說明葉蟬刺吸對茶葉中的代謝物有顯著影響。葉蟬刺吸如何改變美人茶中非揮發(fā)性和揮發(fā)性代謝物進而提高美人茶的滋味和香氣品質(zhì)尚不清楚。因此，研究美人茶代謝物變化對美人茶品質(zhì)的影響從而提高烏龍茶產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟效益至關(guān)重要。

代謝組學被認為是一種全面、高效的組學方法，用于分析生物體內(nèi)代謝產(chǎn)物的總量，被廣泛用于研究環(huán)境[7]、茶樹品種[8-9]和制茶工藝[10]對茶代謝產(chǎn)物的影響。本研究采用超高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜（ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole time-offlight mass spectrometry，UPLC-Q-TOF-MS）和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）的非靶向代謝組學方法，結(jié)合感官審評對無葉蟬刺吸和有葉蟬刺吸美人茶的非揮發(fā)性和揮發(fā)性代謝物進行分析。此外，通過氣味活度值（odor activity value，OAV）和多元統(tǒng)計分析，包括主成分分析（principal component analysis，PCA）、層次聚類分析（hierarchical cluster analysis，HCA）和偏最小二乘判別分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）揭示有無葉蟬刺吸的美人茶的代謝物差異，以期為提高美人茶品質(zhì)的提供理論和實踐指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茶鮮葉 福建省敬天茶業(yè)有限公司，在福建大田屏山茶廠加工成美人茶干茶（2021年7月）。

甲醇（≥99.9%）、乙腈（≥99.9%）、甲酸（≥99.0%）（均為色譜級）上海易恩化學技術(shù)有限公司；標品兒茶素（catechin，C）（≥99%）、表兒茶素（epicatechin，EC）（≥99%）、沒食子兒茶素（gallocatechin，GC）（≥98%）、表沒食子兒茶素（epigallocatechin，EGC）（≥98%）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）（≥99%）、表兒茶素沒食子酸酯（epicatechin gallate，ECG）（≥98%）、咖啡因（≥99%）、L-茶氨酸（≥98%）成都曼斯特生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FDU-1200冷凍干燥機 上海愛朗儀器有限公司；TissueLyser II組織破碎儀 上海土森視覺科技有限公司；AR224CN電子秤 奧豪斯儀器（上海）有限公司；VORTEX-5渦旋振蕩器 海門市麒麟貝爾儀器制造有限公司；KQ5200DE數(shù)控超聲機 昆山市超聲儀器有限公司；TGL-16臺式高速冷凍離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；ACQUITY超高效液相色譜儀、Q-TOF高分辨質(zhì)譜儀、Acquity UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）美國Waters公司；7980B-5977A氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、HP-5MS色譜柱美國Agilent公司；Milli-Q A10純水儀 廈門精藝興業(yè)科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 美人茶加工

無葉蟬刺吸和有葉蟬刺吸的青心大冇茶樹品種鮮葉的劃分和界定根據(jù)茶園常見新梢為害癥狀而定，茶樹新梢無葉蟬為害、芽葉長勢良好為無刺吸；蟲害稍重，葉脈變紅，葉面卷曲，帶焦邊為有刺吸。兩種鮮葉按美人茶加工工藝（圖1）分別加工成無刺吸美人茶（control group，CG）和有刺吸美人茶（experimental group，EG）。

圖1 美人茶加工工藝Fig.1 Flow chart of beauty tea processing

1.3.2 感官審評

美人茶參考GB/T 23776—2018《茶葉感官審評方法》[11]進行沖泡。稱取茶樣5 g置于110 mL審評碗中，先用沸水沖泡2 min，快速倒入茶碗中；再用沸水沖泡3 min，快速倒入茶碗中；最后迅速用沸水沖泡5 min，快速倒入茶碗。來自福建農(nóng)林大學的7 名經(jīng)過專業(yè)培訓的感官審評專家（4 女3 男，年齡30～50 歲）進行評價和評分，評價標準參考T/CSTEA 00006—2019《美人茶沖泡與品鑒》[12]。所有專家都有高級審評證書，并有5 a以上的茶葉描述性感官分析經(jīng)驗。

1.3.3 非揮發(fā)性代謝物檢測

1.3.3.1 代謝物提取

使用冷凍干燥機（－44 ℃，30 h）將茶樣凍干，凍干后的茶樣用組織破碎儀研磨成粉（27 Hz，10 min），準確稱取60 mg茶粉移入2 mL帶蓋離心管，加入2 mL 60%甲醇，渦旋混勻（1 min）后超聲（35 ℃，40 min），最后離心（4 ℃，12 000 r/min，10 min）。小心取出上清液移至離心管，放至－80 ℃冰箱保存，使用前稀釋5 倍。稀釋液經(jīng)0.22 μm尼龍66濾膜過濾兩遍后，用于UPLC-QTOF-MS分析。每個樣品4 個生物學重復。

1.3.3.2 色譜條件

UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；進樣體積1 μL；洗脫梯度見表1。

表1 液相色譜流動相條件Table 1 Mobile phase conditions for UPLC

1.3.3.3 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源，正負離子模式分別檢測，質(zhì)量掃描范圍m/z50～1 000，毛細管電壓2.8 kV，錐孔電壓40 V，電離源溫度120 ℃，解溶溫度380 ℃，解溶速率600 L/h，錐孔氣流量50 L/h，全信息串聯(lián)質(zhì)譜碰撞能量20～30 eV。差異代謝物篩選條件：變量重要性（variable importance in projection，VIP）＞1，P＜0.05。比對人類代謝組數(shù)據(jù)庫（Human Metabolome Database，HMDB）、Massbank、京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）等數(shù)據(jù)庫、標準物質(zhì)和相關(guān)文獻對差異代謝物進行鑒定[13-15]。用物質(zhì)的歸一化豐度作為相對含量進行比較分析[16]。

1.3.4 揮發(fā)性代謝物檢測

1.3.4.1 香氣物質(zhì)提取

參考本課題組的實驗方法[9]，稍有改動。具體步驟如下：組裝進樣手柄和萃取頭，老化15 min，準確稱取0.5 g茶粉裝進50 mL頂空瓶，加入20 mL沸水和10 μL內(nèi)標后平衡5 min，推出纖維頭吸附50 min，吸附完成后立即插入GC-MS進樣口解吸附3 min，同時運行儀器。每個樣品3 個生物學重復。

1.3.4.2 GC-MS檢測

GC-MS參數(shù)參考本課題組方法[9]。

定性分析：通過匹配美國國家標準與技術(shù)研究院11（National Institute of Standards and Technology 11，NIST 11）數(shù)據(jù)庫的質(zhì)譜信息和保留指數(shù)確定揮發(fā)性峰。根據(jù)PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）和NIST（https://webbook.nist.gov/chemistry/cas-ser/）確定揮發(fā)性成分的化學結(jié)構(gòu)和名稱，氣味描述通過查閱相關(guān)文獻確定。

定量分析：以內(nèi)標法（癸酸乙酯：二氯甲烷）進行定量分析[9]。

1.3.5 OAV計算

OAV的計算參考Xu Kai等[7]的方法。OAV是通過將揮發(fā)性化合物含量除以其在水中的氣味閾值得到，并用于評估揮發(fā)性化合物對茶葉樣品香氣的貢獻。一般認為，揮發(fā)性化合物的OAV≥1有助于茶葉的風味。OAV計算參考下式：

式中：Ci為揮發(fā)物含量/（μg/kg）；OTi為揮發(fā)物在水中的香氣閾值/（μg/kg）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

用Excel 2016軟件對美人茶感官審評、香氣化合物分析結(jié)果進行整理與分析，用R studio 4.0.5軟件對代謝物進行PCA，用SIMCA-P13.0軟件進行PLS-DA和置換檢驗，用TBtools1.098775軟件對代謝物進行聚類熱圖分析，用SPSS 20.0軟件進行單向方差分析（analysis of variance，ANOVA）與最小顯著差異（least significant difference，LSD）分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 感官審評

對CG和EG進行感官審評，結(jié)果如表2所示?？梢钥闯?，未受葉蟬刺吸和受葉蟬刺吸的青心大冇茶樹鮮葉均能制出高品質(zhì)的美人茶，但葉蟬刺吸的美人茶品質(zhì)更優(yōu)。與CG相比，EG外形色澤更豐富，更符合美人茶五色相間的特征，葉底更加紅亮，湯色較淺，呈淺橙黃（圖2）。在5 項品質(zhì)因子中，除湯色外均以EG的評分較高，尤其是權(quán)重最高的香氣和滋味。香氣上，CG呈花蜜香顯，而EG香氣更加豐富持久，除了明顯的花蜜香，還有果蜜香。滋味上，CG較濃、甜，而EG口感更加甘爽順滑，且花香入水。表明葉蟬刺吸對美人茶的香氣和滋味有明顯促進作用。

表2 美人茶的感官審評Table 2 Sensory evaluation of beauty tea

圖2 美人茶鮮葉和干茶外形和湯色Fig.2 Appearance of fresh and dried tea leaves used for beauty tea processing and beauty tea infusions

2.2 非揮發(fā)物代謝組學差異分析

2.2.1 PCA

為了初步了解CG和EG中非揮發(fā)性代謝物的差異，對兩個樣品進行PCA。如圖3所示，CG和EG樣品明顯聚成2 組，得到了有效區(qū)分。PC1的貢獻率高達84.31%，PC2的貢獻率為8.58%，說明組間非揮發(fā)性成分存在明顯差異。

圖3 PCA得分圖Fig.3 PCA score plot

2.2.2 PLS-DA

為了獲取更加精確的結(jié)果，通過放大組間的差異，縮小組內(nèi)的差異，過濾掉與分類無關(guān)的信息，快速準確地分析組間差異，故采用監(jiān)督分析方法PLS-DA探究CG和EG之間的差異。PLS-DA評分圖（圖4A）顯示，樣本全部處于95%置信區(qū)間內(nèi)，說明該模型的預測能力較好，大部分數(shù)據(jù)都被模擬在內(nèi)。CG和EG樣品分布在置信區(qū)間兩側(cè)，區(qū)分度較明顯，說明CG和EG中非揮發(fā)性成分差異明顯。此外，根據(jù)PLS-DA的置換檢驗圖（圖4B），模型累積預測率Q2＝0.963、＝0.987，Q2回歸線和Y軸截距小于0，且最右邊的原始藍色Q2點均比所有左邊的藍色Q2點位置高，更加說明該評估模型有效。

圖4 PLS-DA得分圖（A）和置換檢驗圖（B）Fig.4 PLS-DA score plot (A) and permutation test plot (B)

2.2.3 差異代謝物的鑒定和分析

共鑒定出差異代謝物85 種，包括兒茶素及其衍生物21 種、黃酮和黃酮醇及其糖苷類19 種、酚酸類8 種、氨基酸類1 種、原花青素類6 種、茶黃素類4 種、糖和糖苷衍生物類10 種、單寧類3 種、脂質(zhì)類10 種和其他物質(zhì)3 種。表明葉蟬刺吸主要影響茶多酚、糖和糖苷衍生物以及脂質(zhì)類代謝物。根據(jù)代謝物的相對含量繪制了聚類熱圖（圖5）。研究結(jié)果表明，與CG相比，EG中黃酮和黃酮醇及其糖苷類、酚酸類、茶黃素類、糖苷衍生物類和單寧類的相對含量升高，氨基酸類、糖類和脂質(zhì)類下降，而兒茶素及其衍生物和原花青素類無明顯變化。雖是同一種原料茶，但因葉蟬刺吸的有無，造成了兩種茶在非揮發(fā)性代謝物含量上的差異，從而形成CG和EG不同的滋味特征。

圖5 差異代謝物的聚類熱圖Fig.5 Hierarchical clustering heatmap of differential metabolites

茶樹會識別各脅迫下的化學信號來調(diào)控自身防御機制，誘導產(chǎn)生各類代謝物以提高抗逆性。研究表明，與非生物脅迫相比，昆蟲為害等生物脅迫對兒茶素含量沒有顯著影響[17]。盡管有兒茶素起到防御作用的觀點，但尚未得到充分證實。在本研究中，兒茶素類總體變化并不明顯，差異代謝物主要為一些二聚兒茶素以及一些兒茶素的O-甲基化衍生物。研究表明，一些二聚兒茶素如theasinensin F isomer 1-2、EC-(4β→8)-EGC-3-Ogallate、EGC-(4β→8)-EC-3-O-gallate與苦澀味有很強的相關(guān)性[14]。高滋味品質(zhì)的茶通常含有較低含量的二聚兒茶素[18-19]。這些結(jié)果表明，過高的二聚兒茶素水平不利于茶葉品質(zhì)，與本研究結(jié)果類似。黃酮及其苷類是一類重要的成分，在植物中能響應各種脅迫而積累。研究表明，類黃酮化合物，如黃酮醇苷、黃酮苷、原花青素二聚體和可水解單寧的含量在昆蟲侵擾期間升高[20]，它們通過改變植物適口性或可能作為毒素保護植物免受害蟲侵害[21]。在本研究中，EG中黃酮及其苷類含量高于CG，表明葉蟬刺吸可能直接影響了黃酮及其苷類物質(zhì)水平，這類物質(zhì)可賦予茶湯絲滑的感覺[22]，這可能為EG的口感更加順滑的原因。茶的發(fā)酵（氧化）是由內(nèi)源性酶誘導的一系列化學反應，產(chǎn)生類黃酮化合物，經(jīng)多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）和過氧化物酶（peroxidase，POD）催化生成兒茶素低聚物或聚合產(chǎn)物[23]。而在內(nèi)源性PPO和POD催化下，兒茶素氧化又會產(chǎn)生茶黃素[17]，其對茶湯的鮮爽度有重要貢獻。研究表明，在非酶促階段，茶黃素類化合物的含量顯著增加[24]。此外，葉蟬刺吸可激活PPO，刺吸式昆蟲的持續(xù)創(chuàng)傷顯著增加茶葉各種茶黃素、茶黃素-3-沒食子酸酯、茶黃素-3’-沒食子酸酯、茶黃素-3,3’-雙沒食子酸酯的含量[17]。在本研究中，EG中茶黃素含量顯著高于CG（P＜0.05），與黃酮及其苷類物質(zhì)趨勢一致，表明葉蟬刺吸可能直接影響茶黃素水平。脂質(zhì)是活細胞的主要結(jié)構(gòu)成分。研究表明，與葉蟬零危害和輕危害程度茶鮮葉相比，重危害程度茶鮮葉中脂質(zhì)的含量顯著下降[16]。脂質(zhì)的生成受細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的脂質(zhì)相關(guān)蛋白（AtLDAP1）和脂質(zhì)互作蛋白（AtLDIP）調(diào)控[25]，表明葉蟬刺吸可能影響這些蛋白表達，進而影響脂質(zhì)水平。此外，研究表明，脂質(zhì)含量的減少與口感和風味的改善成反比[26]，本研究結(jié)果也印證了這一結(jié)論。L-茶氨酸是由乙胺（L-茶氨酸的關(guān)鍵前體）和L-谷氨酸通過L-茶氨酸合酶（theanine synthetase，TS）合成，賦予茶湯的鮮爽味。研究表明，葉蟬攻擊對乙胺影響不大，表明葉蟬刺吸可能通過其他未知因素影響L-茶氨酸含量[17]。在加工過程中，受損傷、高溫等非生物脅迫的影響，氨基酸能通過脫氨和脫羧作用以及與糖類發(fā)生美拉德反應產(chǎn)生揮發(fā)性的香氣物質(zhì)[27]。此外，在本研究中，EG中糖類物質(zhì)含量同L-茶氨酸一樣，均顯著低于CG，這可能導致CG中香氣物質(zhì)含量更高。酚酸也具有很高的生物利用度，它是酯型兒茶素的前體，可以與EGCG協(xié)同作用，對苦味和澀味起到促進或抑制作用[28]。研究發(fā)現(xiàn)，花生中大部分酚酸會響應鱗翅目昆蟲的攻擊而積累[29]。在本研究中，EG中酚酸含量高于CG，表明茶葉中酚酸可能響應葉蟬刺吸而積累。

除了以上主要物質(zhì)外，糖類及糖苷衍生物也是一類重要品質(zhì)成分。糖類是提供能量的重要成分，其中可溶性糖對茶湯的甜醇味有重要貢獻。在本研究中，CG中糖類物質(zhì)包括異麥芽糖等可溶性糖含量高于EG，這可能是CG有甜感的原因。有研究表明，糖苷衍生物的含量與白茶的品質(zhì)呈正相關(guān)[2]，與本實驗研究結(jié)果一致。美人茶屬于重發(fā)酵烏龍茶，在發(fā)酵過程中，茶多酚（tea polyphenols，TPs）轉(zhuǎn)化為多種成分，如兒茶素衍生物、黃酮類及其苷類、酚酸類等[30]。受各種代謝物的相互作用及加工中的各種非生物脅迫的影響，茶葉中的代謝物進一步重組，形成了具有獨特風味的美人茶。

2.3 揮發(fā)物代謝組學分析

2.3.1 PCA

CG和EG的揮發(fā)物PCA得分圖如圖6所示，兩個樣品中的揮發(fā)物在95%置信區(qū)間內(nèi)可以明顯區(qū)分，說明有無葉蟬刺吸的美人茶香氣組成與含量上存在明顯差異。PC1和PC2累計貢獻率分別為81.79%和5.97%，累計貢獻率為87.76%，說明前兩個PC充分反映了有無葉蟬刺吸美人茶中揮發(fā)物的整體數(shù)據(jù)信息。

圖6 PCA得分圖Fig.6 PCA score plot

2.3.2 PLS-DA

為進一步了解揮發(fā)物對區(qū)分不同香氣特征美人茶的作用以及揮發(fā)物的分布差異，對CG和EG中的香氣組分進行PLS-DA。由圖7A可知，樣品可被很好地分布在置信區(qū)間兩側(cè)，表明無刺吸和有刺吸美人茶的揮發(fā)物組成具有明顯差異。圖7B是PLS-DA交叉驗證結(jié)果，左邊的所有藍色Q2值都低于右邊的原始點，Q2點的藍色回歸線與垂直軸（左側(cè)）的截距低于零，表明該評估模型有效。圖7C所示為PLS-DA的VIP圖，VIP值大于1的香氣物質(zhì)對不同香氣特征美人茶的鑒別起作用，由圖可知，共有9 種揮發(fā)性成分對不同刺吸程度美人茶區(qū)分起作用。

圖7 PLS-DA得分圖（A）、置換檢驗圖（B）和VIP得分圖（B）Fig.7 PLS-DA score plot (A),permutation test plot (B) and VIP score plot (C)

2.3.3 不同刺吸程度美人茶揮發(fā)性成分分析

采用GC-MS對CG和EG樣品的揮發(fā)性物質(zhì)進行檢測，共鑒定出71 種揮發(fā)性成分，根據(jù)其化學結(jié)構(gòu)性質(zhì)可分為7 類，包括醇類13 種、醛類7 種、酯類13 種、烯烴類15 種、烷烴類10 種、芳香族化合物9 種、酮類4 種（表3）。在這71 種揮發(fā)性成分中，CG中檢測到53 種，而EG檢測到59 種。其中含量較高的類別為醇類（CG 314.61 μg/kg，EG 203.11 μg/kg）、酯類（CG 287.79 μg/kg，EG 146.81 μg/kg）、烯烴類（CG 181.91 μg/kg，EG 89.35 μg/kg）、醛類（CG 99.82 μg/kg，EG 65.20 μg/kg），而芳香族化合物（CG 93.91 μg/kg，EG 56.10 μg/kg）、酮類（CG 49.26 μg/kg，EG 23.53 μg/kg）、烷烴類（CG 13.47 μg/kg，EG 28.42 μg/kg）的含量相對較低。由此可知，CG中絕大部分香氣物質(zhì)含量高于EG，非揮發(fā)性成分的測定也印證了這一結(jié)果。醇類如芳樟醇和香葉醇是烏龍茶中主要的特征香氣物質(zhì)[31]；醛類也是烏龍茶主要香氣成分，其形成可由游離氨基酸通過脫羧、脫氨和美拉德反應生成，醛也可以轉(zhuǎn)化為相應的醇或有機酸[32]；酯類是影響烏龍茶香型差異重要物質(zhì)之一，在加工過程中的各種非生物脅迫下，其可由脂質(zhì)及氨基酸轉(zhuǎn)變而成[8]。這些結(jié)果表明以上幾類物質(zhì)可能是造成CG和EG不同香氣輪廓的主要成分，除了葉蟬刺吸，加工中的各種非生物脅迫也決定了茶葉香氣特征。

表3 美人茶揮發(fā)性成分及含量Table 3 Contents of volatile compounds in beauty tea

對單個揮發(fā)性成分而言，兩種美人茶樣品中含量最高的均為香葉醇和水楊酸甲酯，除這兩種香氣物質(zhì)外，CG中4-異丙基-1,6-二甲基-1,2,3,4-四氫萘、β-月桂烯、芳樟醇、苯甲醛和二氫芳樟醇含量最高，而EG中二氫芳樟醇、苯甲醛、萘,1,2,3,4-四氫-1,6-二甲基-4-(1-甲基乙基)-,(1S-cis)、芳樟醇和β-月桂烯的含量最高。以上結(jié)果表明，揮發(fā)性成分數(shù)量和含量的差異可能是造成CG和EG不同香氣特征的原因。

2.3.4 不同刺吸程度美人茶關(guān)鍵呈香成分分析

OAV一般用于評價單個揮發(fā)性成分對于整體香氣的貢獻度，一般認為揮發(fā)性成分的OAV≥1有助于香氣風味的形成[7]。由表4可知，OAV≥1的香氣物質(zhì)共有18 種，CG和EG中分別有17 種。其中，OAV較大的香氣物質(zhì)為香葉醇、芳樟醇、β-月桂烯、反式-β-紫羅蘭酮、β-環(huán)檸檬醛、水楊酸甲酯。為了進一步確認揮發(fā)物與香氣特性之間的關(guān)系，選擇VIP＞1和OAV≥1的揮發(fā)物作為特征揮發(fā)物，共鑒定出5 種特征揮發(fā)物，包括香葉醇、芳樟醇、β-月桂烯、水楊酸甲酯和D-檸檬烯，這些成分主要呈花香、果香和甜香，這可能是由于葉蟬刺吸影響這些特征揮發(fā)物的含量發(fā)生變化，進而導致CG和EG香氣品質(zhì)的差異。

表4 OAV大于1的揮發(fā)性成分Table 4 Volatile compounds with OAV ＞ 1

研究表明，葉蟬刺吸使茶鮮葉形成和釋放更多的芳樟醇、香葉醇和β-月桂烯，以間接防御昆蟲[33-35]。然而，在本研究中，CG中這3 種香氣物質(zhì)含量均顯著高于EG（P＜0.05），表明加工工藝對香氣成分的影響很大。芳樟醇的關(guān)鍵前體包括牻牛兒基二磷酸（geranyl pyrophosphate，GPP）和芳樟醇糖苷，研究表明，葉蟬刺吸后茶鮮葉及其干茶中芳樟醇糖苷含量增加[16]，表明葉蟬刺吸可能通過提高芳樟醇糖苷的含量進而提高芳樟醇水平。而香葉醇可能是由昆蟲分泌的萜烯合酶誘導形成[34]。美人茶在加工過程中主要通過磷酸甲基赤蘚醇（methylerythritol phosphate，MEP）途徑合成芳樟醇、香葉醇等單萜[24]。研究表明，在酶反應階段，美人茶中香葉醇豐度增加最多；非酶反應階段，由于高溫使酶失活，大量香氣物質(zhì)蒸發(fā)或降解。酶活性與水分關(guān)系密切，脂質(zhì)的變化會改變細胞膜滲透性，從而改變水含量，推測EG中各香氣組分含量下降可能與加工過程中的失水有關(guān)[24]。水楊酸甲酯是氨基酸的衍生物[8]，其形成可能與游離氨基酸脫羧、脫氨以及美拉德反應有關(guān)。研究表明，相比于健康鐵觀音茶鮮葉加工成的美人茶，葉蟬刺吸過的美人茶中水楊酸甲酯含量下降，但不顯著（P＞0.05）[16]。在本實驗中，EG中水楊酸甲酯含量顯著低于CG（P＜0.05），且CG和EG中氨基酸與水楊酸甲酯變化趨勢一致，表明葉蟬刺吸可能影響鮮葉中氨基酸的含量，進而影響了干茶中水楊酸甲酯的含量，且不同茶樹品種對葉蟬刺吸有不同的響應反應。此外，水楊酸甲酯含量可用于表征茶葉的發(fā)酵程度[36]。在本實驗中，水楊酸甲酯的含量是除香葉醇外最高的，而美人茶又是重發(fā)酵烏龍茶，表明水楊酸甲酯含量可能與茶葉發(fā)酵程度呈正相關(guān)。D-檸檬烯被認為是形成武夷巖茶不同香氣特征的關(guān)鍵揮發(fā)物之一[7]，其前體物異戊烯基焦磷酸/二甲基烯丙基焦磷酸（isopentenyl pyrophosphate/dimethylallyl pyrophosphate，IPP/DMAPP）合成需要大量的腺嘌呤核苷三磷酸和還原型輔酶II（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH），即更依賴于能量代謝即輔酶供應[37]。本研究中，EG中糖類物質(zhì)含量顯著下降（P＜0.05），這可能是EG中D-檸檬烯含量下降的原因之一。

以上物質(zhì)中，已有不少研究關(guān)于其對茶葉香型的貢獻。烏龍茶加工過程中香葉醇對香氣的貢獻最大，是烏龍茶花香形成的首要化合物[38]。此外，香葉醇被認為可能是金觀音中甜味和花香特征的主要貢獻者[39]。芳樟醇是烏龍茶、紅茶和白茶的主要花香貢獻者。β-月桂烯被認為可能是“祁門櫧葉種”紅茶特殊甜花香有別于其他品種紅茶甜香的主要香氣物質(zhì)之一[40]。研究發(fā)現(xiàn)，香葉醇和水楊酸甲酯對紅茶香氣的形成貢獻更大[36,41]，尤其是香葉醇。此外，水楊酸甲酯被認為可能參與了烏龍茶花香特征的形成[8]。以上結(jié)果表明這些特征揮發(fā)物可能是形成有無葉蟬刺吸美人茶不同香氣特征的主要貢獻者。此外，本研究中香葉醇為美人茶香氣的首要貢獻物，與前人的研究一致。

3 結(jié)論

本研究通過感官審評分析了無葉蟬刺吸和有葉蟬刺吸美人茶的品質(zhì)差異，同時采用UPLC-Q-TOF-MS和GC-MS技術(shù)對其非揮發(fā)性和揮發(fā)性成分進行差異性分析。結(jié)果表明，葉蟬刺吸后的茶鮮葉加工成的美人茶品質(zhì)更好，口感更加甘爽順滑、花香入水，香氣更豐富持久。葉蟬刺吸提高了美人茶中黃酮和黃酮醇及其糖苷類、酚酸類、茶黃素類、糖苷衍生物類和單寧類的含量，降低了氨基酸類、糖類和脂質(zhì)類的含量，進而提高美人茶的滋味品質(zhì)。GC-MS分析結(jié)果顯示，共檢測出7 類71 種揮發(fā)性成分，包括醇類、醛類、酯類、烯烴類、烷烴類、芳香族化合物、酮類?；赩IP＞1和OAV≥1確定了香葉醇、芳樟醇、β-月桂烯、水楊酸甲酯和D-檸檬烯5 種特征差異揮發(fā)物，這些香氣化合物可能是形成無葉蟬刺吸和有葉蟬刺吸美人茶不同香氣品質(zhì)的關(guān)鍵。本研究結(jié)果可為美人茶的品質(zhì)研究提供理論和實踐指導，有助于促進其優(yōu)異品質(zhì)的穩(wěn)定化發(fā)展。