基于高通量測序技術(shù)分析不同窖齡窖泥真菌群落多樣性與空間異質(zhì)性

任海偉，李志娟，劉美琪，蔡早寧，孫一帆，郭曉鵬，范文廣，張丙云,*，李彥濤，尉軍強(qiáng)

（1.蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730050；2.西北低碳城鎮(zhèn)支撐技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，甘肅 蘭州 730050；3.甘肅金徽酒股份有限公司，甘肅 隴南 742308）

中國白酒作為世界著名的六大蒸餾酒之一，釀造歷史可追溯上千年，特有的口感和香味深受消費(fèi)者喜愛[1]。中國白酒因釀造工藝、制曲技術(shù)、地理環(huán)境等差異最終形成濃香型、醬香型、清香型和米香型等12 種香型[2]，其中濃香型白酒因其獨(dú)特的發(fā)酵釀造過程和“窖香濃郁、綿柔甘冽、香味協(xié)調(diào)”的酒體風(fēng)格成為中國白酒的典型代表，市場份額超過70%。濃香型白酒以谷物（高粱、小麥、玉米、大米等）為原料經(jīng)發(fā)酵、蒸餾、陳釀、勾兌而成，主要香氣成分包括乙酸乙酯、乳酸乙酯、己酸乙酯等，其品質(zhì)受到地理環(huán)境、釀酒原料、生產(chǎn)工藝、制曲技術(shù)和窖泥質(zhì)量等因素的影響[3-4]。窖泥是一種富含微生物、高含水量、高腐殖質(zhì)和低含氧量的特殊性土壤，是濃香型白酒發(fā)酵釀造的重要場所，其質(zhì)量優(yōu)劣在很大程度上取決于其微生物群落組成及物種多樣性。窖泥中所含的細(xì)菌、古菌和真菌等微生物菌群構(gòu)成了一個(gè)不斷演變的復(fù)合微生態(tài)體系，期間不斷進(jìn)行著各類復(fù)雜的釀酒生化反應(yīng)，產(chǎn)酒的同時(shí)也形成了豐富而獨(dú)特的酒體風(fēng)味物質(zhì)[5-6]。正所謂“窖泥產(chǎn)香”，很多學(xué)者對(duì)不同地區(qū)白酒窖泥微生物研究發(fā)現(xiàn)，窖泥微生物主要以細(xì)菌和古菌為主，如梭菌（Clostridium）是濃香型白酒生產(chǎn)中最重要的功能菌，在厭氧條件下能將有機(jī)物轉(zhuǎn)化為有機(jī)酸，并通過酶催化或非酶催化與醇反應(yīng)生成丁酸乙酯和己酸乙酯[7]；產(chǎn)甲烷菌常與己酸菌共棲互營生長，并通過種間“氫轉(zhuǎn)移”作用提高己酸乙酯含量[8]。這些細(xì)菌和古菌相互作用維持著窖泥微生態(tài)環(huán)境的穩(wěn)定[9-10]。目前，窖泥微生物群落的研究主要集中在原核菌群[11]，而有關(guān)真菌群落的研究相對(duì)較少，主要是由于真菌大多數(shù)為好氧型，而窖泥的特征之一是低含氧量，不利于真菌生存。但也有研究表明，窖泥真菌群落在白酒釀造過程中也發(fā)揮著重要作用，主要負(fù)責(zé)淀粉降解、酒精發(fā)酵和芳香化合物的產(chǎn)生[12-13]。因此，有關(guān)窖泥真菌群落的研究對(duì)明晰白酒風(fēng)味物質(zhì)形成和品質(zhì)保證具有重要意義。

目前，研究窖泥真菌多樣性的方法主要集中在可培養(yǎng)菌的分離篩選、磷酸脂肪酸生物標(biāo)記和變性梯度凝膠電泳技術(shù)[14-15]。高通量測序技術(shù)通常被用于分析窖泥原核菌群[5,10,16]，而對(duì)真菌群落研究較少。王春艷等[17]研究發(fā)現(xiàn)宋河濃香型白酒新老窖泥的優(yōu)勢(shì)真菌屬組成不同，老窖池的真菌物種豐富度高于新窖池，但新老窖泥的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)真菌門均為子囊菌門（Ascomycota）。Liu Maoke等[6]從瀘州老窖窖泥（5 a和100 a）中鑒定到屬于4 個(gè)門的111 個(gè)真菌屬，其中主要是Ascomycota，且窖泥樣品中優(yōu)勢(shì)真菌屬的組成具有明顯差異，100 a窖齡窖泥的真菌群落相對(duì)穩(wěn)定。孟雅靜等[18]發(fā)現(xiàn)新窖池窖泥真菌豐富度高于老窖池，而新老窖池窖壁泥的真菌多樣性和豐富度高于窖底泥，新老窖池窖壁泥的真菌組成接近且比窖底泥更豐富。Cai Weichao等[19]從27 個(gè)新疆濃香型白酒窖泥樣品中鑒定出138 個(gè)真菌屬，隸屬10 個(gè)真菌門，其中復(fù)膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）、曲霉屬（Aspergillus）和Apiotrichum是其核心真菌群落，Aspergillus和Apiotrichum是維持窖泥真菌群落結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的樞紐。綜上所述，不同地區(qū)白酒企業(yè)的窖泥真菌群落多樣性差異較為明顯，針對(duì)特定釀酒企業(yè)開展窖泥真菌研究尤為必要。

金徽酒產(chǎn)于長江上游、西秦嶺南麓的“西部酒鄉(xiāng)”甘肅隴南徽縣境內(nèi)，其生態(tài)釀酒環(huán)境獨(dú)特，于2012年入選為國家地理標(biāo)志保護(hù)產(chǎn)品。歷史傳承形成的低溫入窖、長周期低溫發(fā)酵、緩火蒸餾、低溫陳釀、低溫過濾等釀造工藝造就了金徽酒“只有窖香、沒有泥味”的獨(dú)特品質(zhì)[20]。為詳細(xì)了解甘肅金徽酒股份有限公司不同窖齡窖池窖泥的真菌群落多樣性與空間異質(zhì)性，以該公司10 a和50 a窖齡窖泥為研究對(duì)象，采用Illumina NovaSeq高通量測序技術(shù)分析窖泥真菌群落多樣性，基于冗余分析（redundancy analysis，RDA）探究影響窖泥真菌群落分布的理化因素，利用FUNGuild功能預(yù)測揭示不同窖齡窖池和空間位置窖泥真菌營養(yǎng)類型和功能類群，以期為窖泥馴化、窖泥功能菌篩選和釀酒品質(zhì)提升奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白酒窖泥取自甘肅金徽酒股份有限公司10 a和50 a窖齡的發(fā)酵窖池（長×寬×高＝3 m×2 m×1.9 m）。取樣方法如圖1所示，每個(gè)窖齡窖池分別從窖壁上層、窖壁中層、窖壁下層和窖底層進(jìn)行無菌取樣。在窖壁上層4 面中心點(diǎn)取樣混合，作為窖壁上層樣品（UWPM10和UWPM50）；在窖壁中層4 面中心點(diǎn)取樣混合，作為窖壁中層樣品（MWPM10和MWPM50）；在窖壁下層4 面中心點(diǎn)取樣混合，作為窖壁下層樣品（DWPM10和DWPM50）；窖底層采用五點(diǎn)法（池底4 個(gè)對(duì)稱角和中心點(diǎn)），取樣混合，作為窖底層樣品（BPM10和BPM50），合計(jì)8 個(gè)代表樣品，每個(gè)樣品3 個(gè)平行。將每份窖泥樣本分為2 份，密封在無菌取樣袋中，分別置于－20 ℃冰箱（理化指標(biāo)分析）和－80 ℃冰箱（高通量測序）。

圖1 窖泥的取樣位置Fig.1 Sampling locations of pit mud

鹽酸、硝酸、高氯酸、氫氟酸 成都市科隆化學(xué)品有限公司；氯化鉀、氯化鈣、硼酸 天津市百世化工有限公司；重鉻酸鉀（優(yōu)級(jí)純）天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；所有試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

紫外分光光度計(jì) 北京萊伯泰科儀器股份有限公司；TGL-20M高速冷凍離心機(jī) 上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；PB-10 pH計(jì) 德國Sartorius公司；MP200A精密電子天平 上海良豐儀器儀表有限公司；101-1電熱鼓風(fēng)干燥箱 北京中興偉業(yè)儀器有限公司；DF-1集熱式恒溫磁力攪拌鍋 金壇市中大儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 窖泥理化指標(biāo)測定

1.3.2 窖泥基因組提取及Illumina NovaSeq測序

依據(jù)Omega DNA 試劑盒（D5625）說明書提取窖泥基因組DNA，送深圳微科盟科技集團(tuán)進(jìn)行Illumina NovaSeq高通量測序。轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）擴(kuò)增子引物對(duì)為ITS1-1F-F（5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’）和ITS1-1F-R（5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’），擴(kuò)增區(qū)域?yàn)镮TS1-1F區(qū)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增體系：5×PCR緩沖液4 μL，2 μL 2.5 mmol/L脫氧核糖核苷酸三磷酸，0.8 μL 5 μmol/μL正向引物，0.8 μL 5 μmol/μL反向引物，0.4 μL 5 U/μL DNA聚合酶，10 ng DNA模板，用雙蒸水補(bǔ)充體積至20 μL[19]。PCR條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，30 個(gè)循環(huán)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后構(gòu)建克隆文庫，并進(jìn)行Illumina NovaSeq雙向測序。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

將測序后的下機(jī)數(shù)據(jù)處理得到有效序列，采用QIIME軟件進(jìn)行生物信息學(xué)分析，根據(jù)序列相似度，將其歸為多個(gè)可操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）。采用RDP classifier貝葉斯算法對(duì)97%相似水平的OTU代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析，并在各分類水平下統(tǒng)計(jì)每個(gè)樣品的群落組成。窖泥理化因子數(shù)據(jù)結(jié)果以±s表示，并用SPSS 20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析其顯著性。α多樣性指數(shù)和門屬水平優(yōu)勢(shì)物種相對(duì)豐度顯著水平利用SPSS 20.0軟件進(jìn)行分析，β多樣性顯著水平采用ANOSIM檢驗(yàn)方法分析，并通過Origin 2021軟件繪制α多樣性指數(shù)柱形圖（Shannon指數(shù)和Chao1指數(shù)）和優(yōu)勢(shì)門屬物種顯著性圖，同時(shí)繪制樣品之間的層級(jí)聚類樹。使用微科盟云平臺(tái)繪制主坐標(biāo)分析（principal coordinate analysis，PCoA）圖、門屬水平優(yōu)勢(shì)物種相對(duì)豐度圖、線性判別分析（linear discriminant analysis，LDA）Effect Size（LEfSe）多級(jí)物種層級(jí)樹圖和LDA判別柱形圖、絕對(duì)優(yōu)勢(shì)真菌屬與理化指標(biāo)之間的RDA圖以及相對(duì)豐度位于前30真菌屬之間的同現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)圖。高通量測序結(jié)果采用FUNGuild v1.0軟件分析真菌功能分類，將獲得OTU上傳到FUNGuild分析平臺(tái)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同窖齡窖池和空間位置窖泥的理化指標(biāo)

研究表明，窖泥理化性質(zhì)可以影響白酒釀造過程中微生物群落結(jié)構(gòu)的形成[23]，在一定程度上也可以反映窖泥質(zhì)量，是評(píng)價(jià)窖泥質(zhì)量的重要指標(biāo)。劉梅等[24]認(rèn)為質(zhì)量越好的窖泥，pH值更接近于7。如表1所示，10 a窖齡窖泥的pH值介于3.50～3.90之間，而50 a窖齡窖池的pH值明顯升高，尤其窖壁上層和窖底泥層的pH值更接近7，說明50 a窖齡窖泥質(zhì)量整體上優(yōu)于10 a窖泥，這可能是因?yàn)?0 a窖泥中的乳酸桿菌屬（Lactobacillus）明顯高于50 a窖泥，而Lactobacillus的富集可以導(dǎo)致其代謝物乳酸的積累，進(jìn)而造成窖泥pH值的下降[25]，因此窖泥的pH值可以作為初步判定窖泥質(zhì)量優(yōu)劣的依據(jù)。由表1還可看出，隨著窖池深度的增加，10 a窖齡窖泥的水分、腐殖質(zhì)、Ca2＋含量總體呈現(xiàn)升高的變化趨勢(shì)，窖底泥明顯高于窖壁泥（P＜0.05）；而50 a窖齡窖泥的水分、腐殖質(zhì)、Ca2＋含量呈現(xiàn)先升高后降低趨勢(shì)，窖壁泥明顯高于窖底泥（P＜0.05）。另一方面，隨著窖池窖齡的增加，水分、腐殖質(zhì)、Ca2＋、K＋含量明顯降低，而pH值則顯著升高（P＜0.05），這與張會(huì)敏等[5]報(bào)道的老窖泥pH值高于新窖泥、新窖泥Ca2＋含量高于老窖泥結(jié)果一致，也說明了不同窖齡和空間位置的窖泥與空氣接觸頻次、與黃水接觸程度、持水性和微生物組成等因素密切相關(guān)[5]。與此同時(shí)，腐殖質(zhì)含量的高低也是判斷窖泥質(zhì)量優(yōu)劣的重要指標(biāo)之一，其含量高低直接影響濃香型白酒質(zhì)量[26]?？傊?，不同窖齡窖池和空間位置窖泥的理化性質(zhì)存在一定差異，理化性質(zhì)的差異也進(jìn)一步反映了在白酒釀造過程中需要因時(shí)因勢(shì)不斷改善釀酒工藝或優(yōu)化物質(zhì)配比，從而保障窖泥微生物菌群處于高效穩(wěn)定動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。

表1 金徽酒窖泥的常見理化指標(biāo)Table 1 Common physicochemical indexes of Jinhui Baijiu pit mud

2.2 高通量測序數(shù)據(jù)合理性分析

通過Illumina NovaSeq平臺(tái)對(duì)窖泥真菌群落進(jìn)行測序分析，測序數(shù)據(jù)經(jīng)過barcode拆分后獲得1 286 316 條平均長度為181～237 bp的有效真菌序列。獲得所有樣品的全部原始序列后，對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量控制、去噪、拼接，并且去嵌合體，形成OTU。按照97%的默認(rèn)值對(duì)優(yōu)化真菌序列進(jìn)行分組，共獲得8 415 個(gè)OTU，各窖泥樣本的OTU數(shù)量分布介于255～505。每個(gè)樣本的覆蓋率均大于99%，說明測序數(shù)目足夠，測序序列可以代表窖泥真菌群落組成。

2.3 金徽酒窖泥真菌群落的α多樣性分析

Shannon指數(shù)表示物種的多樣性，Chao1指數(shù)表示物種的豐富度，其中Chao1指數(shù)對(duì)稀有物種更敏感[27]。如圖2所示，從空間位置看，10 a窖池窖泥的多樣性和豐富度隨窖池深度的增加呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，窖壁上層的多樣性和豐富度顯著高于其他位置（P＜0.05），這可能是因?yàn)榻驯谏蠈咏涯嗯c空氣接觸程度較大，氧氣含量越高，有利于好氧型真菌生存，這與孟雅靜等[18]報(bào)道結(jié)果一致。50 a窖池窖泥的多樣性隨著窖池深度的增加整體呈現(xiàn)升高趨勢(shì)，豐富度則呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì)，窖底層多樣性和豐富度均顯著高于其他位置（P＜0.05），因?yàn)?0 a窖池窖底泥的理化環(huán)境有利于真菌菌群生存。另一方面，10 a窖池窖壁層的真菌多樣性和豐富度顯著高于50 a窖泥（P＜0.05），而50 a窖底泥的真菌多樣性和豐富度均顯著高于10 a窖泥（P＜0.05），這是因?yàn)殡S著窖池窖齡的增加會(huì)產(chǎn)生黃水下沉，窖壁泥暴露在空氣中使其水分流失，真菌生存條件變差，進(jìn)而導(dǎo)致真菌多樣性和豐富度下降。另一方面，窖底泥長期處于黃水環(huán)境，黃水中真菌進(jìn)入窖底泥并富集，促使其多樣性和豐富度提高[28]。

圖2 不同窖齡窖池和空間位置窖泥中真菌群落的α多樣性Fig.2 α-Diversity of fungal community in pit muds of different ages and at spatial locations

2.4 金徽酒窖泥真菌群落的β多樣性分析

為進(jìn)一步分析窖泥真菌群落的相似性，對(duì)真菌群落進(jìn)行PCoA和非加權(quán)組平均法（unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA）層級(jí)聚類分析。由圖3a可知，PCoA橫縱坐標(biāo)之和為24.34%，說明真菌群落結(jié)構(gòu)復(fù)雜，2 個(gè)PCo難以在很大程度上對(duì)其進(jìn)行解釋，與Cai Weichao等[19]的研究結(jié)果基本一致。從空間位置看，50 a窖泥MWPM50和DWPM50樣品距離較近，UWPM50和BPM50樣品距離較近，表明50 a窖池窖壁中層和下層窖泥的真菌群落組成相似，50 a窖壁上層和窖底泥的真菌組成相似，而10 a窖池不同位置窖泥樣品距離較遠(yuǎn)，未出現(xiàn)聚類，表明10 a窖齡窖池不同位置窖泥的真菌群落組成有明顯差異。從窖齡角度看，不同窖齡同一位置窖泥樣品距離較遠(yuǎn)，說明其群落組成差異顯著。由圖3 b 可知，所有窖泥樣品共分為3 簇，其中樣品UWPM50和BPM50分別單獨(dú)聚為一簇，其他窖泥樣品聚為另一簇，表明在長期發(fā)酵過程中，窖池窖泥真菌群落存在明顯的空間異質(zhì)性，其中樣品UWPM50和BPM50的真菌群落變化程度快于其他位置窖泥。PCoA和UPGMA聚類的結(jié)果基本一致，說明窖齡和空間位置對(duì)真菌群落組成的相似性和差異性有一定影響。

遠(yuǎn)程教育理念核心在于實(shí)現(xiàn)教學(xué)過程中教師與學(xué)生的時(shí)空分離，此理念在節(jié)省教育資源，促進(jìn)教育公平發(fā)展的同時(shí)，也使得學(xué)習(xí)過程更具自主和靈活，滿足不同水平學(xué)生對(duì)教學(xué)內(nèi)容的充分理解，即契合“掌握學(xué)習(xí)”理論的一般原理。慕課、微課以及雨課堂等迅速成長，成為當(dāng)下教育信息化的重要方式。但簡單地將傳統(tǒng)課堂數(shù)字化網(wǎng)絡(luò)化就能取得績效是不切實(shí)際的。實(shí)現(xiàn)在線教育優(yōu)勢(shì),教師核心素養(yǎng)是保證教學(xué)質(zhì)量，實(shí)現(xiàn)信息化教育有效推進(jìn)的重要因素。

圖3 不同窖齡窖池和空間位置窖泥真菌群落的PCoA分析（a）和UPGMA聚類分析（b）Fig.3 PCoA analysis (a) and UPGMA cluster analysis (b) of fungal communities in pit muds of different ages and at spatial locations

2.5 基于門水平的窖泥真菌群落結(jié)構(gòu)分析

基于OTU注釋共得到21 個(gè)真菌門，平均相對(duì)豐度超過0.1%的有8 個(gè)，其中Ascomycota（62.12%）、Basidiomycota（17.18%）、Mortierellomycota（1.32%）和Rozellomycota（1.01%）是金徽窖泥的優(yōu)勢(shì)真菌門（平均相對(duì)豐度≥1%），此外還含有較低豐度的球囊菌門（Glomeromycota，0.13%）。另外，Ascomycota和Basidiomycota在10 a和50 a窖池不同位置窖泥中均占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，是窖泥的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)真菌門，與Cai Weichao等[19]研究結(jié)果一致。

如圖4 所示，從空間位置看，10 a 和50 a 窖泥Ascomycota相對(duì)豐度隨著窖池深度的增加均呈現(xiàn)先升高后降低趨勢(shì)，窖壁下層Ascomycota相對(duì)豐度極顯著高于其他位置（P＜0.01）。類似地，10 a窖泥Basidiomycota和Mortierellomycota相對(duì)豐度隨著窖池深度的增加呈現(xiàn)先降低后升高趨勢(shì)，Rozellomycota相對(duì)豐度則呈現(xiàn)顯著降低趨勢(shì)，其中窖壁上層Mortierellomycota和Rozellomycota相對(duì)豐度顯著高于其他位置。50 a窖池窖泥Basidiomycota和Mortierellomycota相對(duì)豐度隨窖池深度增加整體呈現(xiàn)升高趨勢(shì)，其中窖壁中層Basidiomycota和Rozellomycota相對(duì)豐度顯著高于其他位置，窖底層Mortierellomycota相對(duì)豐度也顯著高于其他位置。有研究表明，Ascomycota不僅是濃香型白酒窖泥中的優(yōu)勢(shì)真菌門，同時(shí)也是醬香型白酒生產(chǎn)中的主要真菌菌群[29-30]。

圖4 不同窖齡窖池和空間位置窖泥真菌的門水平相對(duì)豐度Fig.4 Relative abundance of fungal phyla in pit muds of different ages and at spatial locations

從窖池窖齡看，窖壁上層和中層Ascomycota相對(duì)豐度隨著窖齡的增加而呈現(xiàn)升高趨勢(shì)，且50 a顯著高于10 a，而窖壁下層和窖底泥Ascomycota相對(duì)豐度則呈現(xiàn)顯著降低趨勢(shì)，且10 a顯著高于50 a，這與王春艷等[17]研究結(jié)果稍有差異。另一方面，窖壁上層、窖壁中層和窖底泥Basidiomycota相對(duì)豐度隨著窖齡的增加呈現(xiàn)顯著降低趨勢(shì)，窖壁下層Basidiomycota相對(duì)豐度則呈現(xiàn)顯著升高趨勢(shì)。再者，窖壁上層Mortierellomycota相對(duì)豐度隨著窖齡的增加呈現(xiàn)顯著降低趨勢(shì)，窖底泥Mortierellomycota相對(duì)豐度則呈現(xiàn)顯著升高趨勢(shì)（P＜0.01），但其他位置Mortierellomycota相對(duì)豐度差異不顯著（P＞0.05）。窖壁中層和窖底層Rozellomycota相對(duì)豐度隨著窖齡的增加均呈現(xiàn)顯著升高趨勢(shì)（P＜0.01）。

總體而言，不同窖齡和空間位置窖泥的優(yōu)勢(shì)真菌門相對(duì)豐度差異顯著，這與孟靜雅等[18]研究結(jié)果有所差異，表明不同窖池窖齡和空間位置窖泥的理化環(huán)境在一定程度上均能夠影響優(yōu)勢(shì)真菌門的結(jié)構(gòu)分布和演替規(guī)律。

2.6 基于屬水平的窖泥真菌群落結(jié)構(gòu)分析

金徽酒窖泥在屬水平上共鑒定出520 個(gè)真菌屬，其中14 個(gè)屬為優(yōu)勢(shì)真菌屬（所有樣品的平均相對(duì)豐度≥1%），其余未知真菌屬和非優(yōu)勢(shì)真菌屬歸為others。14 個(gè)優(yōu)勢(shì)真菌屬分別為枝孢菌屬（Cladosporium）、Aspergillus、紅曲霉屬（Monascus）、嗜熱真菌屬（Thermomyces）、假散囊菌屬（Pseudeurotium）、德克酵母屬（Dekkera）、畢赤酵母屬（Pichia）、哈薩克斯坦酵母屬（Kazachstania）、枝頂孢霉屬（Acremonium）、鐮刀霉屬（Fusarium）、被孢霉屬（Mortierella）、維希尼克氏酵母屬（Vishniacozyma）、Archaeorhizomyces、Neocosmospora，占總豐度的79.24%。窖泥中的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)真菌屬（每個(gè)樣品的相對(duì)豐度≥1%）包括Aspergillus、Monascus、Kazachstania、Fusarium，但不同窖齡窖泥的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)真菌屬有所差異。10 a窖池窖泥中的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)真菌屬分別為Cladosporium、Monascus、Fusarium、Aspergillus、Kazachstania，50 a窖池窖泥中的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)真菌屬為Aspergillus和Kazachstania。

從圖5 空間位置角度分析可知，10 a 窖池窖泥Aspergillus相對(duì)豐度隨窖池深度的增加呈現(xiàn)先降低后升高趨勢(shì)，且窖底層顯著高于其他位置，而Kazachstania相對(duì)豐度變化趨勢(shì)與之相反，且窖壁下層顯著高于其他位置。50 a窖池窖泥Aspergillus和Kazachstania相對(duì)豐度隨著窖池深度的增加呈現(xiàn)先升高后降低趨勢(shì)，且二者在窖壁下層相對(duì)豐度均顯著高于其他位置。就窖泥窖齡而言，除窖壁下層外，其他位置Aspergillus相對(duì)豐度均隨窖池窖齡的增加呈現(xiàn)顯著降低趨勢(shì)。窖壁上層Kazachstania相對(duì)豐度則隨著窖齡的增加呈現(xiàn)升高趨勢(shì)，而其他位置Kazachstania相對(duì)豐度則呈現(xiàn)顯著降低趨勢(shì)（P＜0.01）。原因可能是在白酒釀造過程中開窖和封窖等操作會(huì)使其營養(yǎng)成分和含氧量不斷改變，進(jìn)而使微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生演替[31]。據(jù)報(bào)道Aspergillus能夠產(chǎn)生淀粉酶和蛋白酶等，是白酒釀造過程中淀粉等大分子物質(zhì)分解的主要?jiǎng)恿χ籟31]。Kazachstania等酵母類真菌在大曲樣品中的相對(duì)豐度較高，在白酒發(fā)酵過程中對(duì)乙醇、有機(jī)酸和多類酯等物質(zhì)的產(chǎn)生具有重要作用[32]。

圖5 不同窖齡窖池和空間位置窖泥真菌屬水平相對(duì)豐度Fig.5 Relative abundance of fungal genera in pit muds of different ages and at spatial locations

另外，10 a窖齡窖池不同位置Acremonium、不同窖齡窖壁上層Fusarium和Neocosmospora、不同窖底層Pichia和Mortierella，以及窖壁底層Cladosporium相對(duì)豐度差異均不顯著（P＞0.05），但Aspergillus和Kazachstania等大多數(shù)優(yōu)勢(shì)真菌屬的相對(duì)豐度差異顯著，說明窖池窖齡和空間位置會(huì)影響窖泥真菌群落的分布。另外，未分類真菌屬相對(duì)豐度范圍為40.06%～87.41%，表明窖泥真菌群落結(jié)構(gòu)復(fù)雜，包含多種在現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫中無法識(shí)別或未被識(shí)別的物種。孟雅靜等[18]研究發(fā)現(xiàn)安徽某酒企的新老窖泥真菌組成差異并不明顯，但甘肅金徽酒不同窖齡和不同位置窖泥的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)真菌屬均存在明顯差異，這與肖琴等[33]研究結(jié)果一致。

進(jìn)一步比較不同地區(qū)濃香型白酒窖泥真菌群落組成（表2），發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)白酒窖泥的優(yōu)勢(shì)真菌門和優(yōu)勢(shì)真菌屬組成確有差異，這可能與釀酒企業(yè)所在地理區(qū)域、水文土壤、氣候條件以及窖池理化性質(zhì)有關(guān)。

表2 不同地區(qū)濃香型白酒窖泥的優(yōu)勢(shì)真菌門和優(yōu)勢(shì)真菌屬比較Table 2 Comparison of dominant fungal phyla and genera in Luzhou-flavor Baijiu pit muds from different regions

2.7 不同窖齡窖池和空間位置窖泥的差異真菌分析

為進(jìn)一步分析窖泥真菌菌群的差異性，利用LEfSe分析窖泥樣品之間的差異真菌。LDA柱狀圖顯示窖泥中有顯著差異的真菌，柱的長度代表差異真菌影響值大小，其閾值分?jǐn)?shù)為3.00。由圖6可知，在屬水平上，所有窖泥樣品共檢測出25 種差異真菌，其中，10 a窖泥含有6 種差異真菌，窖壁上層差異真菌為黏頭霉屬（Myxocephala）、假散囊菌屬（Pseudeurotium）和Bifiguratus，窖壁中層無差異真菌，窖壁下層差異真菌為Cephalotheca和Parasarocladium，窖底層差異真菌為枝瑚菌屬（Ramaria）。50 a窖泥中共含有19 種差異真菌，窖壁上層差異真菌為假散囊菌屬（Pseudeurotium），窖壁中層差異真菌為節(jié)菱孢屬（Arthrinium）、絲膜菌屬（Cortinarius）和球腔菌屬（Phaeosphaeria），窖壁下層差異真菌為扇盤衣屬（Thysanothecium），窖底層差異真菌為擬青霉屬（Simplicillium）、栓菌屬（Trametes）、鏈孢霉屬（Neurospora）、珊瑚菌屬（Clavaria）、柄孢殼屬（Zopfiella）、梭鏈孢屬（Fusidium）、褐球菌屬（Phaeococcomyces）、裂褶菌屬（Schizophyllum）、Saccharomycopsis、木拉克酵母屬（Mrakia）、Sagenomella、Ophiosphaerella、Genolevuria，說明不同窖齡窖池和空間位置窖泥的差異物種數(shù)目和種類不同。另外，在25 個(gè)差異真菌中有3 個(gè)差異真菌的LDA值≥4，如科水平的假散囊菌科（Pseudeurotiaceae）、肉座菌科（Hypocreales）以及屬水平的假散囊菌屬（Pseudeurotium），說明它們是對(duì)不同窖齡窖池和空間位置窖泥差異貢獻(xiàn)最大的真菌群落。通過對(duì)窖泥差異真菌的分析，發(fā)現(xiàn)差異真菌均是樣品中相對(duì)豐度較低的一類物種，但也是白酒釀造過程中發(fā)揮重要作用的微生物類群。

圖6 真菌LEfSe多級(jí)物種層級(jí)樹圖（a）和LDA柱形圖（b）Fig.6 Fungal LEfSe multi-level species hierarchical tree diagram (a) and LDA score plot (b)

2.8 金徽酒窖泥理化指標(biāo)與真菌菌群之間的RDA

研究表明，窖池窖泥理化指標(biāo)的差異可能是影響窖泥微生物生長代謝或功能的因素，也是影響微生物群落α及β多樣性的重要因素[34]。利用RDA探究窖泥理化指標(biāo)與絕對(duì)優(yōu)勢(shì)真菌屬之間的相關(guān)性（圖7），箭頭長度代表相關(guān)性，中心點(diǎn)和窖泥真菌之間的連線與箭頭的夾角，銳角表示真菌屬與相應(yīng)的理化因子呈正相關(guān)，鈍角表示呈負(fù)相關(guān)[5]。

圖7 絕對(duì)優(yōu)勢(shì)真菌屬與理化指標(biāo)之間的關(guān)系Fig.7 Relationship between absolute dominant fungal genera and physicochemical indicators

金徽窖泥的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)真菌屬與窖泥理化指標(biāo)之間的關(guān)系如圖7所示，其2 個(gè)主成分的總解釋度為54.88%，按照RDA1和RDA2的劃分，水分含量、腐殖質(zhì)、Ca2＋、K＋集中在同一區(qū)域，pH值單獨(dú)占據(jù)一個(gè)區(qū)域，在同一區(qū)域的理化因子變化趨勢(shì)基本一致，而pH值則與其他理化因子變化趨勢(shì)不同，這與表1分析結(jié)果一致。由圖7還可看出，10 a窖齡的窖泥樣品與水分、腐殖質(zhì)、K＋和Ca2＋含量呈正相關(guān)關(guān)系，且10 a窖池窖泥中存在較多的Ca2＋，這與張會(huì)敏等[5]報(bào)道的“新窖泥中Ca2＋高于老窖泥”結(jié)果一致，然而50 a窖泥樣品與pH值呈正相關(guān)。Fusarium、Kazachstania、Aspergillus、Monascus與水分、腐殖質(zhì)、K＋和Ca2＋含量呈正相關(guān)，與pH值呈負(fù)相關(guān)，而Cladosporium和Vishniacozyma與pH值呈正相關(guān)，與水分、腐殖質(zhì)、K＋和Ca2＋含量呈負(fù)相關(guān)。研究表明，Aspergillus和Monascus等真菌可以產(chǎn)生液化酶（最適pH 6.0）和纖維素酶（最適pH 7.5）等多種功能酶系[35]，低pH值會(huì)抑制這些微生物的生長，從而影響白酒風(fēng)味物質(zhì)的形成和白酒品質(zhì)。由此可見，這些理化指標(biāo)對(duì)窖泥真菌群落的分布影響較大，窖泥真菌群落的結(jié)構(gòu)組成與理化指標(biāo)密切相關(guān)。

2.9 金徽酒窖泥的物種相互作用網(wǎng)絡(luò)分析

樞紐指與一定數(shù)量的其他微生物相關(guān)聯(lián)，是整個(gè)環(huán)境中影響微生物相關(guān)網(wǎng)絡(luò)的重要因素[27]。對(duì)金徽窖泥的真菌群落進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析以探索相對(duì)豐度位于前30的真菌菌屬之間的相互作用關(guān)系。圖8中有30 個(gè)節(jié)點(diǎn)、38 條邊，所有節(jié)點(diǎn)分別隸屬于Ascomycota（19 節(jié)）、Basidiomycota（9 節(jié)）、毛霉菌門（Mucoromycota）（1 節(jié)）和Mortierellomycota（1 節(jié)）4 個(gè)真菌門。窖泥中真菌群落同現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)的中心（邊數(shù)≥5 的真菌屬）為曲霉屬（Aspergillus）、紅菇屬（Russula）、蠟殼耳屬（Sebina）、被孢霉屬（Mortierella）、Archaeorhizomyces。Aspergillus與Monascus、Monilinia、Rhizomucor、Wickerhamomyces呈正相關(guān)，與Archaeorhizomyces、Sebina、Russula呈負(fù)相關(guān)；Russula與Archaeorhizomyces、Mortierella、Sebina、Inocybe呈正相關(guān)，與Aspergillus呈負(fù)相關(guān)；Sebina與Inocybe、Russula、Mortierella、Archaeorhizomyces呈正相關(guān)，與Aspergillus呈負(fù)相關(guān)；Mortierella與Sebina、Inocybe、Russula、Archaeorhizomyces呈正相關(guān)，與Kazachstania呈負(fù)相關(guān)；Archaeorhizomyces與Mortierella、Sebina、Inocybe、Russula呈正相關(guān)，與Aspergillus呈負(fù)相關(guān)。從圖8還可以看出，Aspergillus和Kazachstania相對(duì)豐度顯著高于其他真菌屬，這與圖6結(jié)果一致。同時(shí)，在同現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)中發(fā)現(xiàn)了Scedosporium、Pseudeurotium、Dekkera和Peyronellaea4 個(gè)獨(dú)立的模塊，主要是由于能連接這4 個(gè)模塊的節(jié)點(diǎn)或樞紐含量極少或消失，節(jié)點(diǎn)或樞紐種類和含量的減少導(dǎo)致微生物菌群網(wǎng)絡(luò)碎片化[36-37]，這與Cai Weichao等[19]報(bào)道的同現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)中沒有發(fā)現(xiàn)獨(dú)立的模塊，所有真菌屬都連接在同一個(gè)模塊內(nèi)的研究結(jié)果不同。其中Pseudeurotium是影響微生物菌群網(wǎng)絡(luò)的重要真菌屬之一，與圖6中Pseudeurotium是LDA值≥4的差異真菌，是對(duì)不同窖齡窖池和空間位置窖泥差異貢獻(xiàn)最大的真菌群落研究結(jié)果一致。總之，通過同現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)分析，金徽酒窖泥的真菌群落之間形成相互影響的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，核心真菌菌屬之間直接或間接影響彼此生長和代謝，進(jìn)而影響釀造環(huán)境中微生物體系平衡。

2.10 金徽酒窖泥真菌FUNGuild功能預(yù)測

根據(jù)FUNGuild功能預(yù)測對(duì)不同窖齡窖池和空間位置窖泥真菌群落進(jìn)行分類分析，從而了解和預(yù)測窖泥真菌群落功能。FUNGuild依據(jù)真菌的營養(yǎng)方式將真菌分為3大類：病理營養(yǎng)型、共生營養(yǎng)型和腐生營養(yǎng)型?；谶@3大營養(yǎng)方式，進(jìn)一步細(xì)分為若干個(gè)功能分組：動(dòng)物病原菌、叢枝菌根真菌、外生菌根真菌、杜鵑花類菌根真菌、葉內(nèi)生真菌、地衣寄生真菌、地衣共生真菌、菌寄生真菌、植物病原菌、未定義根內(nèi)生真菌、未定義腐生真菌和木質(zhì)腐生真菌等。

本實(shí)驗(yàn)FUNGuild功能預(yù)測置信水平選用highly probable、probable和possible，以保證預(yù)測的準(zhǔn)確性。圖9a結(jié)果顯示，金徽酒窖泥的真菌主要預(yù)測得到病理營養(yǎng)型、病理-腐生營養(yǎng)型、病理-腐生-共生營養(yǎng)型、病理-共生營養(yǎng)型、腐生營養(yǎng)型、腐生-共生營養(yǎng)型、共生營養(yǎng)型共7 個(gè)不同的營養(yǎng)類型，其中腐生營養(yǎng)型和病理-腐生-共生營養(yǎng)型占比較高，分別為23.63%～61.87%和13.93%～34.13%。不同窖泥樣品真菌的主要營養(yǎng)類型不同，樣品DWPM10、DWPM50、BPM50的真菌以病理-腐生-共生營養(yǎng)型為主，樣品UWPM10的真菌則以共生營養(yǎng)型為主，其他樣品的真菌則以腐生營養(yǎng)型為主。從圖9b可以看出，不同窖泥樣品真菌的主要生態(tài)功能群也存在差異，樣品UWPM10真菌功能類群主要是未定義的腐生菌（20.55%）和外生菌（15.88%），其中未定義腐生菌在屬水平上包括Pseudeurotium、Monascus、Wickerhamomyces等，外生菌在屬水平上包括Inocybe和Russula等。樣品MWPM10和DWPM10真菌功能類群中未定義的腐生菌相對(duì)豐度分別高達(dá)33.20%和30.64%，是樣品MWPM10和DWPM10中最主要的功能類群，在門水平上主要有Ascomycota、Basidiomycota、Mucoromycota；樣品MWPM10和DWPM10中，動(dòng)物病原-內(nèi)生-寄生性真菌-地衣寄生蟲-植物病原-木質(zhì)腐生菌類群也是主要功能類群，相對(duì)豐度分別達(dá)4.61%和4.46%，其在屬水平上包括Nectria和Penicillifer等。樣品BPM10和DWPM50真菌功能類群主要是未定義的腐生菌和植物病原菌，其中植物病原菌在樣品BPM10和DWPM50相對(duì)豐度分別達(dá)11.85%和13.40%。樣品UWPM50和MWPM50主要的功能類群為未定義的腐生菌（相對(duì)豐度分別為56.72%、22.71%）和內(nèi)生植物病原菌（相對(duì)豐度分別為9.79%、22.49%），內(nèi)生植物病原菌在屬水平上的主要真菌屬為Thermomyces等。樣品BPM50中除最主要的功能類群未定義的腐生菌外，動(dòng)物病原-內(nèi)生-寄生性真菌-植物病原-木質(zhì)腐生菌也是主要的功能類群，相對(duì)豐度為17.79%，在屬水平上的真菌屬包括Acremonium和Sodiomyces?？傊鸹站平涯嗟恼婢郝渲饕? 種營養(yǎng)類型和11 個(gè)功能類群，但不同樣品的真菌營養(yǎng)類型和功能類群因其窖齡和空間位置不同而存在差異。

圖9 不同窖齡窖池和空間位置窖泥真菌的營養(yǎng)模式（a）和功能類群（b）Fig.9 Nutritional patterns (a) and functional groups (b) of fungi in pit muds of different ages and at spatial locations

3 結(jié)論

在所有金徽酒窖泥樣本中，Ascomycota、Basidiomycota、Rozellomycota、Mortierellomycota是窖泥的優(yōu)勢(shì)真菌門，Aspergillus、Monascus、Kazachstania等14 個(gè)屬為優(yōu)勢(shì)真菌屬；同時(shí)在屬水平上檢測到25 種差異真菌，且不同窖齡窖池和空間位置窖泥的差異真菌組成存在明顯差異。盡管不同窖齡窖池和空間位置窖泥的真菌多樣性和豐富度變化趨勢(shì)不同，但總體而言50 a窖齡窖泥更趨于穩(wěn)定。RDA結(jié)果表明金徽窖泥的pH值、水分、腐殖質(zhì)、K＋和Ca2＋等理化特性對(duì)真菌群落的分布影響較大，尤其是區(qū)分不同窖齡的窖泥樣品。通過網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)金徽酒窖泥中真菌群落同生網(wǎng)絡(luò)的中心為Aspergillus、Russula、Sebina、Mortierella、Archaeorhizomyces，并且發(fā)現(xiàn)4 個(gè)獨(dú)立的模塊，表明樞紐是影響整個(gè)環(huán)境微生物菌群網(wǎng)絡(luò)的重要因素。FUNGuild功能預(yù)測結(jié)果表明金徽窖泥的真菌群落有7 個(gè)營養(yǎng)類型和11 個(gè)生態(tài)功能類群，且不同窖泥樣品真菌的營養(yǎng)類型和生態(tài)功能類群存在差異?？傊?，通過研究不同窖齡窖泥真菌群落結(jié)構(gòu)多樣性與空間異質(zhì)性，發(fā)現(xiàn)不同窖齡窖池窖泥的優(yōu)勢(shì)真菌屬存在較大差異，也證實(shí)了窖池中窖泥真菌群落具有明顯的空間異質(zhì)性，對(duì)進(jìn)一步探索不同空間位置窖泥真菌群落對(duì)窖泥老化和酒體風(fēng)味物質(zhì)形成的具體貢獻(xiàn)有積極作用。