基于基因組測序分析3 株不同來源副干酪乳酪桿菌的黏附特性及糖代謝途徑

肖路遙，石婷婷，楊 倩，李 偉

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095）

隨著人們對營養(yǎng)健康食品的需求提高，益生菌制品因其健康安全、能夠調(diào)節(jié)腸道平衡、增強免疫力等功能特性廣受關(guān)注。副干酪乳酪桿菌（Lacticaseibacillus paracasei）作為革蘭氏陽性和兼性厭氧發(fā)酵乳酸桿菌，廣泛分布于發(fā)酵乳制品、蔬菜、谷物產(chǎn)品及人類和動物的胃腸道中[1]。L.paracasei已被證實具有多種健康功效，包括抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)以及對腸道微生物群的改善和調(diào)節(jié)作用[2-3]。近年來，高通量測序技術(shù)和生物信息學(xué)高速發(fā)展，越來越多的研究借助基因組測序信息對菌株的功能特性進行預(yù)測分析，對關(guān)鍵基因進行挖掘。

非人源的乳酸菌若要在人體發(fā)揮益生功效，首先需要能穩(wěn)定定植于人體腸道。乳酸菌對胃腸道環(huán)境低pH值、高膽汁酸鹽的耐受能力以及對上皮細胞的黏附是其定植的先決條件之一。乳酸菌對腸上皮細胞的黏附作用有利于菌株與宿主細胞間的信號交流，同時抑制致病菌的生長代謝，增強機體抵抗力[4]。對于乳酸菌黏附機制的研究是目前研究的熱點，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，乳酸菌表面的大分子物質(zhì)成分，如胞壁磷壁酸（wall teichoic acids，WTA）、脂磷壁酸（lipoteichoic acids，LTA）、S-層蛋白（S-layer protein，SLP）以及分泌到胞外處于細胞最外層的胞外多糖（exopolysaccharides，EPS）等成分在乳酸菌對腸上皮細胞的黏附過程中起到一定的作用，因而這些成份也被稱作黏附素[5]。這些黏附素可以與腸道細胞表面的受體進行特異性結(jié)合，而引發(fā)一系列復(fù)雜的生理變化。隨著分子生物學(xué)手段的不斷發(fā)展，基因編輯技術(shù)已被應(yīng)用于乳酸菌的功能機制研究中。Claes等[6]通過dltD基因的敲除證明L.rhamnosusGG菌株的LTA在決定其體內(nèi)治療效果方面發(fā)揮重要作用；植物乳桿菌HC-2的表面伸長因子EF-Tu可以與蝦腸道纖連蛋白結(jié)合，從而抑制細胞凋亡，參與腸道免疫調(diào)節(jié)[7]。Lu Yanmeng等[8]發(fā)現(xiàn)在不同的胃腸道條件下，EPS結(jié)構(gòu)的變化會影響益生菌與黏蛋白的相互作用而增強菌株對黏膜的黏附性。目前，關(guān)于非人源乳酸菌在人體胃腸道的黏附定植機制尚不清楚，對于黏附相關(guān)基因的研究也十分有限。因此，借助于生物信息學(xué)對乳酸菌的黏附相關(guān)基因進行系統(tǒng)挖掘，對其胃腸道定植機制的解析及體內(nèi)遞送的研究具有重要價值。

本研究前期從西藏靈菇分離得到1 株L.paracaseiZY-1，從新疆老酸奶中分離得到L.paracaseiS-NA5和L.paracaseiS-NB，實驗表明這3 株菌生長活力旺盛，安全性評價良好，且發(fā)酵酸奶的凝乳狀態(tài)良好、風味尚佳。本研究進一步對3 株菌株的疏水性、自聚性、耐受胃腸消化特性以及黏附Caco-2細胞能力進行評價。并結(jié)合基因組測序分析影響菌株黏附特性的相關(guān)基因，比較3 株菌株基因組水平的差異，對EPS合成基因簇、LTA合成基因和黏蛋白相關(guān)基因進行全面的預(yù)測分析。并對3 株菌株的糖代謝途徑進行挖掘，以期為L.paracasei的腸上皮黏附和體內(nèi)定植機制的研究奠定遺傳學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

L.paracaseiZY-1分離自西藏靈菇，L.paracaseiS-NA5和L.paracaseiS-NB從新疆傳統(tǒng)發(fā)酵乳中分離，均保存于本實驗室。

MRS培養(yǎng)基 北京陸橋技術(shù)股份有限公司；胃蛋白酶、胰液素、胰蛋白酶、膽汁鹽 美國Sigma公司；Caco-2（結(jié)腸腺癌細胞）中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所；DMEM（Dulbecco’s modified Eagle medium）培養(yǎng)基、血清 美國Gibco公司；0.25%胰酶細胞消化液上海碧云天生物技術(shù)有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒 山東思科捷（Sparkjade）生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

5418高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司；SW-CJ-1F超凈工作臺 蘇州凈化有限公司；二氧化碳培養(yǎng)箱美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株形態(tài)觀察及系統(tǒng)進化樹構(gòu)建

將安瓿管中保藏的菌株劃線至MRS 固體培養(yǎng)基中進行活化，37 ℃培養(yǎng)48 h，挑取單菌落在光學(xué)顯微鏡下觀察菌落形態(tài)。按照細菌基因組DNA提取試劑盒的操作說明提取菌株DNA，以基因組DNA為模板，利用細菌16S rDNA通用引物（27F：5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’和1492R：5’-CGGTTACCTTGTTACGACTT-3’）進行聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴增。PCR產(chǎn)物由北京擎科生物科技有限公司測序，所得序列經(jīng)拼接后在NCBI網(wǎng)站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）進行同源比對，挑選14 株來源于不同種屬的乳酸菌，進行系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建。

1.3.2 表面特性與黏附特性分析

1.3.2.1 疏水性與自聚性分析

采用微生物黏附溶劑法測定菌株的表面疏水性。將活化好的菌株按4%接種量轉(zhuǎn)接至MRS液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)12 h后5 000 r/min離心10 min收集細菌培養(yǎng)物，用無菌磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）重懸菌體至OD600nm為0.60±0.02，記為AH0，將細菌懸液（3 mL）分別與二甲苯和十六烷溶劑（1 mL）混合，37 ℃孵育20 min。等待相分離后，測定水相的OD600nm（AH1），按式（1）計算細胞表面疏水性：

通過監(jiān)測不同時間點（2、4、6、8、12、24 h）細菌懸浮液上層光密度的下降情況，確定其自聚集程度。

1.3.2.2 模擬體外消化的應(yīng)激能力

模擬胃腸液的配制參考Xiao Luyao等[9]的方法，稱取NaCl 2.8 g、KCl 514.4 mg、NaHCO32.1 g、KH2PO4225.0 mg、MgCl2·6 H2O 20.3 mg、(NH4)2CO378.6 mg溶解于1 L蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH 2.5，得到模擬胃緩沖液；稱取NaCl 2.2 g、KCl 507.0 mg、NaHCO37.1 g、KH2PO4108.9 mg、MgCl2·6H2O 67.1 mg溶解于1 L蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH 7.5，得到模擬腸緩沖液。然后分別稱取15 mg胃黏液素和6.25 mg胃蛋白酶溶解于10 mL的模擬胃緩沖液中，置于37 ℃活化20 min，獲得模擬胃消化液；將8.17 mg膽鹽和5.62 mg胰液素分別溶于10 mL模擬腸緩沖液中，于37 ℃活化20 min，獲得模擬腸消化液。將處于對數(shù)生長期的菌液按10%接種量轉(zhuǎn)接至模擬胃消化液中，混勻后置于37 ℃搖床培養(yǎng)1.5 h（180 r/min），測定經(jīng)胃液消化后的存活率。培養(yǎng)結(jié)束后混合均勻，再與模擬腸消化液按體積比1∶9混合均勻，于37 ℃搖床培養(yǎng)3 h（180 r/min）后測定經(jīng)胃腸消化后的存活率。

1.3.2.3 黏附Caco-2細胞能力

將活化后的菌株按4%接種量轉(zhuǎn)接至MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至對數(shù)生長期，5 000 r/min離心10 min，收集菌體沉淀后用無菌PBS清洗2 次，重懸于DMEM至終濃度為1×108CFU/mL。Caco-2細胞以2×105個/mL接種于12 孔細胞培養(yǎng)板中，在37 ℃、5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)至單層，使用無菌PBS清洗2 次后加入菌懸液，同樣環(huán)境條件下培養(yǎng)2 h。緩慢移除上清液，加入無菌PBS清洗以去除未黏附的菌體，加入體積分數(shù)0.05%的Triton X-100溶液裂解細胞，用平板菌落計數(shù)法測定乳酪桿菌的活菌數(shù)量。黏附率按式（2）計算：

1.3.3 全基因組測序分析及功能基因的注釋

參照細菌基因組DNA提取試劑盒步驟對3 株菌的基因組DNA進行提取和純化，使用快速測序試劑盒構(gòu)建測序庫，再通過Nanopore PromethION48和Illumina NovaSeq平臺完成全基因組測序。使用Unicycler v0.4.7軟件進行混合基因組的組裝，CheckM v1.0.18軟件用于對組裝序列進行校正和評估。蛋白編碼序列（coding sequence，CDS）的注釋通過Prokka 1.12軟件（http://www.vicbioinformatics.com/software.prokka.shtml）完成。CDS的功能注釋參考COG（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/）和KEGG（http://www.genome.jp/kegg/）數(shù)據(jù)庫。此外，EPS合成基因簇的預(yù)測基于BLASTx（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）和RAST（https://rast.nmpdr.org/）網(wǎng)站的分析，蛋白家族和結(jié)構(gòu)域的分析借助于Pfam（https://pfam.xfam.org/）數(shù)據(jù)庫。通過Clustal Omega網(wǎng)站（https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/）對黏附蛋白相關(guān)基因進行多序列比對；采用ExPASy（https://web.expasy.org/protparam/）、SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/）和SMART（https://smart.embl.de/）網(wǎng)站對黏附蛋白的一般性質(zhì)和結(jié)構(gòu)進行在線分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用MEGA 6.0軟件進行系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建，使用GraphPad Prism軟件進行圖片繪制和數(shù)據(jù)分析。DNA圖譜和基因簇圖分別使用Proksee（https://proksee.ca）和Chiplot（https://www.chiplot.online）軟件繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落形態(tài)觀察及系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析

經(jīng)顯微鏡觀察，3 株菌株均為桿狀細菌（圖1A），其中菌株ZY-1呈長桿狀，相比之下，菌株S-NA5和S-NB在顯微鏡下為短桿狀。其中，可觀察到菌株S-NB多數(shù)呈現(xiàn)聚集狀態(tài)。將3 株菌的16S rDNA測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫進行BLAST檢索，與已知序列進行同源比對，并與14 株來源于不同種屬的乳酸菌序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹（圖1B）。3 株菌株均與L.paracaseisubsp.paracaseiJCM 8130T處于同一分支，且序列同源性為100%，因此，3 株菌被確定為L.paracasei。

圖1 3 株副干酪乳桿菌的菌落形態(tài)（A）和系統(tǒng)進化樹（B）Fig.1 Colonial morphology (A) and phylogenetic tree (B) of three L.paracasei strains

2.2 菌株表面特性與黏附特性評價

益生菌的疏水性和自聚集等細胞表面特性與其黏附上皮細胞的能力直接相關(guān)。如圖2A、B所示，L.paracaseiZY-1 對二甲苯的黏附能力（（14.29±0.67）%）顯著高于L.paracaseiS-NA5（（11.67±0.41）%，P＜0.01）和L.paracaseiS-NB（（8.97±0.40）%，P＜0.01）。而S-NA5（（20.48±0.74）%）對十六烷的黏附能力高于ZY-1（（19.46±0.92）%）和S-NB（（13.79±1.36）%，P＜0.01）。如圖2C所示，3 株菌的自聚集性隨時間延長的變化趨勢相對一致，ZY-1（（93.53±0.45）%）和S-NB（（94.93±0.25）%）在孵育24 h后的自聚集能力相對高于S-NA5（（92.36±0.60）%）。對低pH值環(huán)境、膽汁鹽和胰液的抗逆性是決定益生菌在胃腸道生存能力的重要因素。

圖2 3 株副干酪乳桿菌的表面特性分析Fig.2 Analysis of surface characteristics of three L.paracasei strains

如圖3A 所示，在模擬胃消化液中培養(yǎng)90 min后，S-NB 的存活率（（42.77±2.80）%）高于ZY-1（（23.65±3.93%）%，P＜0.01）和S-NA5（（34.23±4.52）%），而緊接著在腸消化液刺激3 h后，S-NB的存活率下降至（15.82±1.77）%，依舊高于ZY-1（（10.42±1.15）%，P＜0.01）和S-NA5（（14.99±2.10）%）（圖3B）。3 株菌對Caco-2細胞的黏附能力如圖3C所示，各菌株與Caco-2細胞共培養(yǎng)2 h后，S-NB的黏附能力最強（（21.10±1.98）%），其次為S-NA5（（20.18±1.92）%）和ZY-1（（9.02±1.14）%）。益生菌對腸上皮細胞的黏附有利于其穩(wěn)定定植于人體腸道，抑制致病菌的生長，從而增強機體免疫力，達到預(yù)防疾病的目的[4]。根據(jù)3 株菌的表面特性與黏附能力的評價，菌株ZY-1的疏水性較強，但其對Caco-2細胞的黏附性最差；菌株S-NA5的疏水性由于S-NB，但其黏附Caco-2細胞的能力較差；而S-NB具備最優(yōu)的Caco-2細胞黏附能力，結(jié)果表明菌株的表面疏水性與黏附性并不存在直接關(guān)聯(lián)性。此外，3 株菌對模擬體外胃腸消化后的耐受情況與細胞黏附性呈現(xiàn)顯著正相關(guān)性（數(shù)據(jù)未顯示，R＝1.0，P＜0.05）。同一來源的菌株S-NA5與S-NB的胃腸液耐受能力與黏附性能均較為接近。

圖3 3 株副干酪乳桿菌的模擬胃腸液耐受性及黏附特性分析Fig.3 Analysis of simulated gastrointestinal fluid tolerance and adhesion capacity of three L.paracasei strains

2.3 黏附相關(guān)基因的預(yù)測分析

2.3.1 基因組圈圖及功能注釋

3 株菌的測序結(jié)果經(jīng)評估、組裝、注釋后提交至GenBank數(shù)據(jù)庫，序列號分別為：ZY-1，CP065154.1-CP065158.1；S-NA5，CP068408.1-CP068415.1；S-NB，CP068486.1-CP068487.1。利用預(yù)測得到的基因組信息，如基因組測序深度、GC分布以及結(jié)構(gòu)注釋等進行整合，繪制出基因組圈圖和質(zhì)粒圖譜（圖4）。菌株ZY-1組裝后含1 條染色體，含4 個質(zhì)粒，基因組大小為3 148 894 bp，GC含量為46.38%，包含3 010 個CDS；而S-NA5的組裝結(jié)果顯示組裝后S-NA5含有1 條染色體和7 個內(nèi)源性質(zhì)粒，其基因組大小為3 102 338 bp，GC含量為46.38%，包含2 956 個CDS；S-NB基因組信息與S-NA5很相似，但僅包括1 個質(zhì)粒，其基因組大小為3 103 392 bp，GC含量為46.38%，包括2 958 個CDS?；蚪M分析結(jié)果表明3 株乳酪桿菌在基因組大小、質(zhì)粒數(shù)量上均存在差異。且3 株菌的基因組大小均大于模式菌株干酪乳酪桿菌（L.casei）ATCC 393T（基因組大小為2 952 961 bp）和L.paracaseiJCM 8130T（基因組大小為3 017 804 bp）?；? 株菌株的全基因組信息可對菌株代謝物質(zhì)的合成途徑及通路、不同碳源的代謝差異、潛在的益生功能等進行系統(tǒng)的預(yù)測與分析。

圖4 3 株副干酪乳桿菌的基因組圈圖Fig.4 Circle maps of the genomes and endogenous plasmids of three L.paracasei strains

2.3.2 EPS合成基因簇的分析

乳酸菌的EPS是其在生長代謝過程中分泌的水溶性大分子聚合物，一部分附著在細胞壁上形成莢膜多糖，另外一部分被釋放到細胞壁外至培養(yǎng)基中形成黏液多糖。乳酸菌的EPS已被證實具備多種生物活性，包括抗氧化性、免疫調(diào)節(jié)、降低膽固醇、抗糖尿病等[10]。EPS的功能特性與其分子結(jié)構(gòu)、單糖組成、糖苷鍵構(gòu)型、電荷極性等密切相關(guān)[11]。因此，EPS的生物合成途徑對多糖的空間結(jié)構(gòu)以及生理活性至關(guān)重要。EPS的產(chǎn)生與參與調(diào)節(jié)生物合成途徑的基因簇中關(guān)鍵酶的表達水平密切相關(guān)。通常合成EPS的基因簇位于染色體DNA或質(zhì)粒上，且乳酸菌的EPS合成基因簇數(shù)目為1～4 個不等[12]。多糖的生物合成一般包含5 個步驟：單糖和雙糖的硫酸化或轉(zhuǎn)運、糖核苷酸的產(chǎn)生、重復(fù)單元的合成、重復(fù)單元的轉(zhuǎn)移、糖鏈的聚合和轉(zhuǎn)運[13]。其中涉及的基因簇大多具有菌株特異性，在3 株副干酪乳桿菌中均均預(yù)測到2 個EPS合成基因簇（圖5），ZY-1的EPS合成基因簇1（eps1）中包含了25 個基因片段，而S-NA5和S-NB均只包括了19 個基因；3 株菌株的EPS合成基因簇2（eps2）都涵蓋了18 個基因片段。這3 株菌的EPS合成依賴Wzx/Wzy通路，包含了糖基轉(zhuǎn)移酶、糖核苷酸合成相關(guān)基因、Wzx和翻轉(zhuǎn)酶、聚合酶等。eps1中的LtyR蛋白與假定的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子高度同源，位于基因簇上游；Wzb和Wze蛋白分別與酪氨酸蛋白磷酸酶和酪氨酸蛋白激酶具有氨基酸同源性，都與多糖鏈長相關(guān)；eps1的中間部分大多由糖基轉(zhuǎn)移酶基因組成，如WelE和Glf；Wzx是低聚糖重復(fù)單元易位酶，負責將重復(fù)單元翻轉(zhuǎn)至質(zhì)周或外膜；Wzd基因位于eps1的下游，被注釋為多糖合成蛋白，與多糖的聚合和轉(zhuǎn)運相關(guān)。3 株菌eps2的核酸序列同源性為100%，推測其在EPS的合成中承擔輔助功能，EpsG和Wzz作為多糖聚合酶參與多糖的聚合和轉(zhuǎn)運。乳酸菌表面的大分子物質(zhì)可以與胃腸道黏膜的宿主模式識別受體相互作用，發(fā)揮益生功效。但到目前為止，EPS的模式識別受體仍鮮有報道，可能是由于多糖聚合物的復(fù)雜結(jié)構(gòu)導(dǎo)致菌株對微生物相關(guān)分子模式產(chǎn)生了屏蔽效應(yīng)[14]。對3 株菌EPS合成基因簇的分析表明，不同來源的L.paracasei的EPS合成模式具有差異性，源于西藏開菲爾粒的ZY-1菌株的EPS合成途徑可能更為復(fù)雜，而菌株ZY-1的黏附Caco-2能力極顯著低于S-NA5和S-NB（P＜0.01），因此推測EPS的生物合成會對菌株的體外黏附性能產(chǎn)生影響。而同一來源的S-NA5與S-NB菌株的EPS合成基因簇具有較高同源性，這與其較為接近的黏附能力及胃腸消化耐受性的具有一致性。

圖5 3 株L.paracasei的EPS合成基因簇Fig.5 EPS biosynthesis gene clusters of three L.paracasei strains

2.3.3 磷壁酸合成相關(guān)基因的預(yù)測分析

磷壁酸包含以磷酸二酯鍵共價固定在肽聚糖的MurNac殘基上的WTA和以糖脂錨定在細胞質(zhì)膜上的LTA。LTA是TLR2和TLR6異質(zhì)二聚體中的配體，CD14和CD36作為輔受體[15]。現(xiàn)有研究已表明LTA可通過TLR2依賴機制調(diào)節(jié)腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α的水平[16-17]。同樣，與野生型菌株相比，鼠李糖乳酪桿菌GG的D-丙基化缺失突變株提高了其在小鼠腸炎模型中的保護作用[6]。而嗜酸乳桿菌的ltaS突變株也被證實能下調(diào)TNF-α和白細胞介素（interleukin，IL）-12的產(chǎn)生，并促進抗炎因子IL-10的釋放，且突變株在治療慢性結(jié)腸炎疾病方面的積極效果優(yōu)于野生型菌株[18]。目前，LTA聚合物和針對其研發(fā)的特異性抗體已被用作候選的疫苗，具有一定的臨床應(yīng)用價值。參與LTA主鏈合成的關(guān)鍵基因lta1、lta2以及調(diào)控LTA支鏈合成的dltABCD基因簇在3 株L.paracasei的染色體DNA上均被檢測到，且各基因間的同源性達100%（表1）?？傮w而言，LTA的合成相關(guān)基因在3 株菌種表現(xiàn)出高度一致性，且皆位于染色體DNA上，為進一步確認磷壁酸的合成對乳酸菌黏附性能及益生功效的影響，還需構(gòu)建相關(guān)基因缺失突變株，以探究其內(nèi)在的必然聯(lián)系。

表1 3 株L.paracasei的LTA合成相關(guān)基因Table 1 LTA synthesis-related genes in three L.paracasei strains

2.3.4 蛋白類黏附素的預(yù)測分析

乳酸菌的黏附素分為蛋白類黏附素和非蛋白類黏附素。表層蛋白（SLP）是研究最為廣泛的蛋白類黏附素，SLP存在于革蘭氏陽性和陰性菌中，通過共價鍵連接于細菌的細胞壁，是乳酸菌黏附到腸上皮細胞、黏液和細胞外基質(zhì)上的重要介質(zhì)[19-21]。嗜酸乳桿菌NCFM的表層蛋白A（slpA）不僅黏附于Caco-2細胞，而且可對特定的細胞外基質(zhì)和黏蛋白的產(chǎn)生黏附效應(yīng)。從本實驗的3 株L.paracasei中各預(yù)測到2 個細菌表層蛋白相關(guān)基因，包含SLP功能結(jié)構(gòu)域（表2）。黏液、細胞外成分如膠原蛋白和纖連蛋白是常用于評價細菌與宿主間相互作用的體外模型。在菌株ZY-1中發(fā)現(xiàn)4 個包含MucBP（mucin-binding protein）結(jié)構(gòu)域的基因，而在菌株S-NA5和S-NB中存在5 個含MucBP結(jié)構(gòu)域的基因片段。此外，在3 株菌中都預(yù)測到膠原蛋白結(jié)合蛋白（collagen binding protein domain，Cbp）結(jié)構(gòu)域和纖連蛋白結(jié)合蛋白A的N端（fibronectin-binding protein A N-terminus，F(xiàn)bpA）。膠原蛋白和纖連蛋白是病原體和共生細菌的黏附靶標物質(zhì)[22]。關(guān)于Cbp和Fbp的研究大多集中在病原體中，在乳酸菌種屬的研究較少[23-24]。其中，源于植物乳植桿菌91的表層Cbp具有抑制大腸桿菌O157:H7結(jié)合的活性[25]；而發(fā)酵乳酸桿菌3872的細胞及其假定的Cbp可抑制空腸彎曲桿菌與I型膠原蛋白結(jié)合[26]。另外，嗜酸乳桿菌NCFM的FbpA缺失突變株被證實對Caco-2細胞的黏附特性降低，F(xiàn)bpB也被鑒定為S層相關(guān)蛋白參與到對黏蛋白的黏附中[27]。根據(jù)各黏附蛋白相關(guān)基因的比對結(jié)果（文中未展示），不同來源菌株的MucBP結(jié)構(gòu)域所在蛋白序列存在差異，ZY-1菌株的蛋白序列與另2 株菌相似度較低。而含有SLAP、Cbp和FbpA結(jié)構(gòu)域的基因編碼蛋白序列的同源性達100%。這可能為上文中ZY-1菌株的低Caco-2黏附能力作出解釋。乳酸菌在宿主腸道中的定植受多因素的影響，不僅包括菌株自身的黏附能力、增殖情況、代謝物質(zhì)，還受復(fù)雜環(huán)境因素的干擾，比如胃酸和膽鹽的耐受能力、腸道菌群的競爭抑制以及宿主基因及體征因素等[28]。目前，盡管各種體外評估模型、示蹤技術(shù)已被應(yīng)用于乳酸菌在復(fù)雜腸道環(huán)境中的定植數(shù)量及位置，但乳酸菌在腸道的黏附定植機制尚未探明。對于3 株L.paracasei表面黏附素基因的定位有利于推定其假定的黏附因子，并通過進一步的實驗驗證其是否能與黏液層蛋白和細胞外基質(zhì)等黏附受體發(fā)生特異性或非特異性結(jié)合。

表2 3 株L.paracasei的蛋白類黏附素Table 2 Protein adhesins of three L.paracasei strains

由于3 株菌株的蛋白類黏附素基因保守性較高，選取S-NB的黏附蛋白基因編碼產(chǎn)物進行理化性質(zhì)的分析，由ExPASy工具在線完成。11 種黏附蛋白基因性質(zhì)見表3，其氨基酸長度在170～1 700 個氨基酸之間，S-NB_01991是其中分子質(zhì)量最小的蛋白（18 965.52 Da）。11 種黏附蛋白中，S-NB_00283和S-NB_02544的不穩(wěn)定指數(shù)大于40，為不穩(wěn)定蛋白，易降解，其他9 種均為較穩(wěn)定蛋白；11 種蛋白均為親水性蛋白，且除S-NB_01596和S-NB_01870外，其余蛋白的等電點均小于7，脂肪指數(shù)略有差別。進一步通過SOPMA分析了黏附蛋白的二級結(jié)構(gòu)和功能結(jié)構(gòu)域，11 種黏附蛋白均含有α-螺旋、延伸鏈、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲的二級結(jié)構(gòu)，以α-螺旋和無規(guī)卷曲為主（圖6A）。SMART分析結(jié)果表明，S-NB_00283和S-NB_02630的C端含有跨膜區(qū)，S-NB_00283含有SLAP結(jié)構(gòu)域，S-NB_00431和S-NB_02448分別含有5 個和3 個重復(fù)蛋白序列（圖6B）。

表3 L.paracasei S-NB黏附蛋白基因編碼產(chǎn)物的一般性質(zhì)Table 3 General properties of the products encoded by the adhesion protein genes from L.paracasei S-NB

圖6 L.paracasei S-NB黏附蛋白基因編碼產(chǎn)物的二級結(jié)構(gòu)和功能結(jié)構(gòu)域分析Fig.6 Secondary structure and functional domain analysis of the products encoded by the adhesion protein genes from L.paracasei S-NB

2.4 糖代謝途徑分析

L.paracasei已被報道可以發(fā)酵多種單糖和雙糖，如葡萄糖、果糖、半乳糖、塔格糖、甘露糖、乳糖、麥芽糖等，具有豐富的糖代謝途徑[1]。根據(jù)基因組測序信息，3 株菌的糖代謝相關(guān)基因簇具備高度保守性，其中常見的乳糖和半乳糖代謝、低聚果糖和菊糖代謝以及母乳低聚糖（human milk oligosaccharide，HMO）代謝途徑相關(guān)基因簇如圖7所示（由于3 株菌的各基因簇均一致，故僅用一幅圖展示其合成基因簇）。作為牛乳中的主要碳水化合物，乳糖是乳酸菌生長的重要碳源。3 株菌株通過磷酸烯醇丙酮酸（phosphoenolpyruvate，PEP）依賴性乳糖特異性磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)（phosphotransferase system，PTS）代謝乳糖，該系統(tǒng)的相關(guān)基因常位于染色體DNA或質(zhì)粒上。其中，3 株菌的塔格糖-6-磷酸途徑（lacR、lacA、lacB、lacD和lacC）均位于染色體DNA上（表4），編碼半乳糖-6-磷酸異構(gòu)酶的lacA和lacB是誘導(dǎo)半乳糖-6-磷酸轉(zhuǎn)化為塔格糖-6-磷酸的關(guān)鍵酶。lacTEGF分別位于質(zhì)粒pLPZ1、pLPA3和pLPB1上。Leloir途徑有助于細菌的乳糖和半乳糖分解代謝，該途徑由半乳糖激酶基因galK、UDP-半乳糖4-差向異構(gòu)酶基因galE、半乳糖-1磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶基因galT、半乳糖誘變酶基因galM和阻遏蛋白galR組成。多數(shù)乳酸菌僅通過Leloir途徑或塔格糖-6-磷酸途徑代謝半乳糖，如嗜熱鏈球菌和腸膜明串珠菌株只存在Leloir途徑[29]。低聚果糖（fructo-oligosaccharide，F(xiàn)OS）的代謝主要包括msm（multiplesugar metabolism）、fos和ptsBCA操縱子3 種途徑。前人的研究表明msm操縱子參與嗜酸乳桿菌NCFM對FOS的代謝，而蔗糖PTS轉(zhuǎn)運系統(tǒng)（ptsBCA）參與植物乳植桿菌WCSF1的短鏈低聚果糖的代謝[30-31]。3 株L.paracasei對FOS的代謝則不同于嗜酸乳桿菌NCFM和植物乳植桿菌WCSF1，fosRABCDXE操縱子起到重要作用（表5）。其中fosE是β-果糖苷酶前體基因，負責FOS的胞外水解，并通過C末端區(qū)域的LPQAG細胞壁錨定基序定位于細胞壁上。與雙歧桿菌相比，關(guān)于乳酸桿菌的HMO的代謝研究相對有限。在3 株L.paracasei中發(fā)現(xiàn)半乳糖-N-二糖（galacto-Nbiose，GNB）代謝途徑，菌株通過gnbREFGBCDA基因簇分解代謝GNB，乳-N-二糖（lacto-N-biose，LNB）和N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）（表6）。L.paracaseiBL23的gnbC和ptsI缺失突變株無法利用GNB和LNB，證實了BL23對GNB和LNB的轉(zhuǎn)運和磷酸化是通過PTSGnb完成的。此外，bnaG位于gnbREFGBCDA基因簇的上游，負責乳糖-N-丙糖II的利用，而manA則被確認參與了3’-N-乙酰氨基葡萄糖-甘露糖的甘露糖部分的代謝。巖藻糖基化HMO在HMO中的比例高達35%～50%，研究表明其可促進腸道微生物的生長，維持嬰兒的腸道平衡，免受腹瀉等疾病的侵擾[32]。在3 株L.paracasei中均發(fā)現(xiàn)alf-1操縱子參與fucosyl-α-1,3-N-acetylglucosamine（3FN）的代謝，編碼alfEFG和α-L-巖藻糖苷酶alfB，alfR則位于上游負責轉(zhuǎn)錄調(diào)控（表7）。另外，alf-2基因簇參與6’FN-Asn的分解代謝，該基因簇包括糖基酶基因sugK、糖基天冬氨酸酶基因asnA2、肽酶基因pepV、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因alfR2、天門冬氨酸-4-脫羧酶基因asdA、滲透酶基因alfH和巖藻糖苷酶基因alfC（表8）。因此，3 株菌具備完善的乳糖和半乳糖、FOS和菊糖以及HMO的代謝途徑。

表4 3 株L.paracasei的乳糖及半乳糖的攝取和代謝Table 4 Lactose and galactose uptake and metabolism in three L.paracasei strains

表5 3 株L.paracasei的低聚果糖及菊糖代謝Table 5 FOS and inulin metabolism gene clusters in three L.paracasei strains

表6 3 株L.paracasei的gnb操縱子Table 6 gnb operons in three L.paracasei strains

表7 3 株L.paracasei的alf-1操縱子Table 7 alf-1 operons in three L.paracasei strains

圖7 3 株L.paracasei的碳水化合物攝取和代謝分析Fig.7 Analysis of carbohydrate uptake and metabolism in three L.paracasei strains

3 結(jié)論

本研究從西藏靈菇中分離得到1 株L.paracaseiZY-1，從新疆老酸奶中分離出L.paracaseiS-NA5和L.paracaseiS-NB菌株，對3 株L.paracasei的表面特性、耐受胃腸液消化特性以及黏附Caco-2細胞的能力差異進行評價，其中S-NB菌株表現(xiàn)出較好的黏附Caco-2細胞能力。基于全基因組測序技術(shù)比較分析了3 株菌的基因組信息，同時通過生物信息學(xué)分析對3 株菌的EPS合成基因簇、LTA合成相關(guān)基因以及蛋白類黏附素進行預(yù)測，在基因種類和數(shù)目方面各具差異，菌株ZY-1的eps1含有25 個基因片段，多于S-NA5和S-NB的eps1中的基因數(shù)量，可能與其EPS合成的復(fù)雜性具有直接聯(lián)系，而推測發(fā)揮輔助合成作用的eps2在3 株菌中的同源性高達100%。3 株菌的LTA合成基因簇同樣顯示出高度保守性。此外，蛋白類黏附素作為乳酸菌黏附到腸上皮細胞、黏液和細胞外基質(zhì)上的重要介質(zhì)，其合成途徑至關(guān)重要，3 株菌的黏附蛋白相關(guān)基因的比對結(jié)果表明，同一來源的S-NA5和S-NB菌株的黏附蛋白相關(guān)基因高度保守。碳水化合物代謝途徑分析表明3 株菌均具備完善的乳糖和半乳糖、FOS和菊糖以及HMO代謝途徑，且基因簇比對結(jié)果一致。目前，關(guān)于非人源的乳酸菌在人體胃腸道的黏附定植機制尚不清楚，對于黏附相關(guān)基因的研究也十分有限。針對3 株L.paracasei的黏附相關(guān)基因的系統(tǒng)挖掘有望為其胃腸道黏附、定植機制的解析及體內(nèi)遞送的研究提供支持。下一步的研究將側(cè)重于構(gòu)建黏附相關(guān)基因缺失突變株，評估不同黏附基因的缺失對菌株在體外黏附模型及體內(nèi)腸道定植的影響，將基因型與菌株表型及功能建立直接聯(lián)系。