GI.5和GII.4諾如病毒P蛋白的克隆表達及與長牡蠣類HBGAs的結(jié)合特性

佟利惠，楊 敏 ，王珊珊，王大軍，王明麗，周德慶

（1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點國家實驗室海洋藥物與生物制品功能實驗室，山東 青島 266071；2.青島濱海學(xué)院，山東 青島 266555；3.煙臺海裕食品有限公司，山東 煙臺 264000；4.蓬萊匯洋食品有限公司，山東 煙臺 264000）

諾如病毒（norovirus，NoV）是引起非細菌性急性胃腸炎的主要病原體，NoV傳染性極強，少至10 個病毒粒子就可引起感染風(fēng)險[1]，冬、春季節(jié)是NoV疫情高發(fā)期，被感染者主要表現(xiàn)為發(fā)熱、惡心、嘔吐、腹痛和腹瀉[2-5]。目前已發(fā)現(xiàn)NoV可分為10 個基因簇（GI～GX）[6-7]，其中GI、GII、GVIII和GIV可感染人類，被稱為人諾如病毒（human norovirus，HuNoV），GI和GII在我國范圍內(nèi)檢出率較高[8-11]。HuNoV常通過被污染的環(huán)境、水源及水產(chǎn)品（尤其是牡蠣等貝類）感染人類，引起急性胃腸炎疫情暴發(fā)。牡蠣是濾食性動物，可以通過自身的濾食作用從被污染的海水中富集HuNoV[2]，牡蠣體內(nèi)的HuNoV濃度可達周圍環(huán)境中的數(shù)十甚至上百倍，且很難通過自身代謝或凈化排出體外[12-13]。

HuNoV衣殼的結(jié)構(gòu)蛋白主要由VP1組成，VP1可進一步分為形成內(nèi)殼的殼（S）結(jié)構(gòu)域和構(gòu)成病毒拱形突起結(jié)構(gòu)的突起（P）結(jié)構(gòu)域[14]，P結(jié)構(gòu)域是與組織血型抗原（histo-blood group antigens，HBGAs）受體結(jié)合的功能區(qū)[15-17]。HBGAs是與糖蛋白或糖脂相連的復(fù)雜碳水化合物，多存在于紅細胞和黏膜上皮細胞，HBGAs是通過不同糖基轉(zhuǎn)移酶將不同單糖添加到二糖前體上產(chǎn)生，主要分為為ABO型、Lewis型和分泌型[18-21]。不同基因型別HuNoV與不同類型HBGAs的識別具有多樣性。近年來，許多研究者也證實，牡蠣組織中也存在類HBGAs，且主要存在于牡蠣鰓和消化腺中，以類A型和類H1型HBGAs居多，這些類HBGAs在牡蠣富集HuNoV的過程中起到了重要作用[22-24]。Le Guyader等[25-26]發(fā)現(xiàn)體外表達的病毒P蛋白可以與長牡蠣組織中的類HBGAs特異性結(jié)合，且不同型別病毒的結(jié)合特性存在差異。

由于HuNoV很難在體外培養(yǎng)，而P蛋白是可以與HBGAs結(jié)合的功能蛋白，且能穩(wěn)定地在大腸桿菌中表達[27]，所以可在一定程度上替代HuNoV進行科學(xué)研究。本研究運用大腸桿菌表達系統(tǒng)，克隆表達GI.5和GII.4 HuNoV P蛋白，探究兩種基因型別HuNoV P蛋白與不同人類唾液樣本的HBGAs、與牡蠣不同組織部位中的類HBGAs的結(jié)合特性，以期探明不同人群感染HuNoV以及長牡蠣富集HuNoV的規(guī)律性，為HuNoV疫情高發(fā)期間消費者食用牡蠣的安全性提供預(yù)警。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

質(zhì)粒提取試劑盒（DP103）、基因純化試劑盒（DP204）、膠回收試劑盒（DP219）、BCA蛋白濃度試劑盒（PA115）天根生化（北京）有限公司；四甲基聯(lián)苯胺（tetramethylbenzidine，TMB）（54827-17-7）北京索萊寶科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（R212）、聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）高保真酶（P510）南京諾唯贊有限公司；Fast DigestNdeI（ER0581）、XbaI（ER0682）美國Thermo公司；Ni-NTA瓊脂糖凝膠（31103）德國Cube Biotech公司；大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α、BL21（DE3）、pET 28a質(zhì)粒、兔多克隆抗體由本實驗室保存；A（921902）、H（922102）、Lea（922202）、Leb（922302）、Lex（912901）、Ley（912501）型HBGAs的單克隆抗體（一抗）美國Covance公司；辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記羊抗兔免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）G、IgM 天津三箭生物有限公司。

蛋白純化buffer 1：0.5 mol/L NaH2PO4溶液19 mL、0.5 mol/L Na2HPO4溶液81 mL、NaCl 29.3 g，加水定容到1 000 mL，pH 7.4；buffer 2：0.5 mol/L NaH2PO4溶液19 mL、0.5 mol/L Na2HPO4溶液81 mL、NaCl 29.3 g、咪唑34 g，加水定容到1 000 mL，pH 7.4；buffer 3：咪唑終濃度20 mmol/L溶液（buffer 1 96 mL、buffer 24 mL），咪唑終濃度250 mmol/L溶液（buffer 1 50 mL、buffer 2 50 mL）。

病毒樣本：本研究所用陽性Hu NoV 毒株由疾病預(yù)防控制中心提供，經(jīng)全基因組測序驗證為GI.5 V125株（GenBank：MZ021630.1）和GII.4 Sydney株（GenBank：KR131784.1）。

唾液樣本：共采集唾液樣16 份，均來自本單位工作人員，用無菌水漱口3 次后，再用10 mL無菌水入口分泌唾液，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（pH 7.4）按1∶1 000稀釋唾液樣品，移入離心管煮沸10 min，5 000×g離心10 min后冷凍保存。經(jīng)HBGAs單抗（稀釋1 000 倍）鑒定型別，分為A型、B型、AB型和O型HBGAs各4 份。

牡蠣及其提取液制備：牡蠣樣品為成年齡、活力旺盛的活牡蠣，購買于威海乳山，取10 只牡蠣于無菌條件下，取出牡蠣的鰓、消化腺、外套膜和閉殼肌組織。料液比1∶3（g/mL）加入PBS（pH 7.4）溶液，用勻漿機在冰上勻漿2 min，－80 ℃保存或繼續(xù)后續(xù)實驗。勻漿液置于95 ℃水浴中10 min，4 ℃、3 000×g離心10 min，取上清液，用BCA蛋白濃度試劑盒測定不同組織上清液中蛋白濃度。

1.2 儀器與設(shè)備

凝膠成像系統(tǒng) 上海Tanon科技有限公司；HB-100恒溫金屬浴、PCR儀 杭州博日科技有限公司；Nanodrop 2000微量核酸定量儀、D-37520臺式高速冷凍離心機 美國Thermo公司；CT-2000高壓滅菌鍋 天津市超拓科貿(mào)有限公司；垂直板式電泳儀和水平電泳儀北京六一生物科技有限公司；恒溫搖床 天津歐諾儀器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 P蛋白重組質(zhì)粒的構(gòu)建

1.3.1.1 P蛋白基因的PCR擴增

利用在線軟件NEBcutter（http://nc2.neb.com/NEBcutter2/）分析目的基因序列的限制性內(nèi)切酶位點，根據(jù)pET28a質(zhì)粒的多克隆位點，選擇目的基因沒有而質(zhì)粒多克隆位點處有的限制性內(nèi)切酶，設(shè)計5’-端帶有限制性內(nèi)切酶位點的引物進行擴增。引物如下（下劃線代表酶切位點，酶切位點前是保護堿基）：GI.5-F：GGAA TTCCATATGCATATGGAAAACCTGTATTT、GI.5-R：GCTCTAGACTCGAGTTATCTTCTGACTC；GII.4-F：GGAATTCCATATGATGAAGATGGCGTCGAGT、GII.4-R：GCTCTAGATTATACTGCACGTCTACGC。

根據(jù)病毒RNA提取試劑盒說明提取病毒RNA。將提取的RNA進行反轉(zhuǎn)錄，首先取10 pg～5 μg RNA模板進行預(yù)變性，加入RNAse-free ddH2O至10 μL，于65 ℃加熱5 min，迅速于冰浴上靜置2 min。反轉(zhuǎn)錄體系：10 μL預(yù)變性RNA混合液、2 μL 10×RT Mix、2 μL HiScript III Enzyme Mix、1 μL Oligo (dT)20 VN、5 μL RNase-free ddH2O。反應(yīng)條件：25 ℃退火5 min、50 ℃延伸45 min、85 ℃終止反應(yīng)2 min。以cDNA為模板，用高保真酶擴增目的基因，擴增體系（50 μL體系）：10 μL 5×PrimerSTAR Buffer（Mg2＋Plus）、4 μL dNTP Mixture（各2.5 mmol/L）、1 μL Forward Primer（10 μmol/L）、1 μL Reverse Primer（10 μmol/L）、cDNA模板＜200 ng、0.5 μL PrimerSTAR HS DNA Polymerase（2.5 U/μL）、加ddH2O補足至50 μL。擴增條件：95 ℃預(yù)變性3 min（1 個循環(huán)），95 ℃變性15 s、56 ℃退火15 s、72 ℃延伸60 s（30 個循環(huán)），72 ℃延伸5 min（1 個循環(huán)）。用1%瓊脂糖凝膠驗證擴增是否成功，電泳的上樣量為5 μL，電壓為100 V，時間為20 min，用凝膠成像儀觀察電泳條帶，并與預(yù)測長度比對。

1.3.1.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

在50 μL雙酶切體系中加入限制性內(nèi)切酶NdeI和XbaI各2 μL、5 μL 10×Buffer、40 μL 1.3.1.1節(jié)中擴增成功的病毒DNA模板，用ddH2O補足至50 μL，在37 ℃金屬浴中反應(yīng)3～5 h，80 ℃滅酶20 min。酶切結(jié)束后根據(jù)膠回收試劑盒說明書對目的條帶進行切膠回收。將膠回收的質(zhì)粒和P蛋白基因連接，在20 μL的體系中加入5 μL質(zhì)粒、10 μL P蛋白基因、2 μL 10×Buffer、1 μL T4 DNA Liagase、2 μL ddH2O，在16 ℃金屬浴中過夜反應(yīng)。

1.3.1.3 重組DNA導(dǎo)入宿主細胞和重組子鑒定

取10 μL連接體系加入100 μL感受態(tài)細胞BL21（BE3）中，用熱激法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細胞中，37 ℃振蕩培養(yǎng)1 h（180 r/min）。取100 μL菌懸液涂布于帶有卡那霉素（kanamycin，Kan）（終質(zhì)量濃度100 μg/mL）的LB平板上，37 ℃過夜培養(yǎng)。挑選上述平板中的菌落進行PCR驗證，其中上游引物選擇質(zhì)粒本身的一段序列（通用引物T7：5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’），下游引物選擇目的基因的下游引物。將擴增得到的目的條帶送樣測序（委托北京睿博興科生物技術(shù)有限公司完成）。將測序結(jié)果與原序列進行比對以驗證重組質(zhì)粒是否成功導(dǎo)入宿主細胞。

1.3.2 P蛋白的表達

選取1.3.1.3節(jié)陽性重組菌接種至含Kan（終質(zhì)量濃度100 μg/mL）的LB培養(yǎng)基中，37 ℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)12～16 h。取2%種子液接種到含Kan（終質(zhì)量濃度100 μg/mL）的LB培養(yǎng)基中，在37 ℃、160 r/min水平搖床中振蕩培養(yǎng)2 h，再添加終濃度0.2 mmol/L的異丙基硫代半乳糖苷（isopropylβ-D-thiogalactoside，IPTG），于20 ℃、150 r/min水平搖床中繼續(xù)培養(yǎng)至24 h。將發(fā)酵液于4 ℃、10 000 r/min離心10 min，分別收集上清液和細胞沉淀。將細胞沉淀懸浮于和上清液等體積的0.2 mol/L、pH 7.0 PBS中，超聲破碎細胞，將超聲破碎細胞后的懸液于4 ℃、10 000 r/min離心10 min，收集上清液。

1.3.3 P蛋白的純化

將超聲破碎液過0.22 μm濾膜，用Ni-NTA親和層析柱（1.6 cm×5 cm）進行純化。用5～10 倍體積buffer 1平衡柱子；取適量上清液分次上樣，結(jié)合30 min；用2～5 個柱體積含20 mmol/L咪唑的buffer 3沖洗柱子；用含250 mmol/L咪唑的buffer 3進行洗脫，收集洗脫峰。用12%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）檢測純化程度同時驗證分子質(zhì)量，電泳顯示為單一條帶的蛋白用BCA試劑盒檢測蛋白濃度。

1.3.4 P蛋白與唾液HBGAs結(jié)合特性分析

將不同唾液標本用PBS（pH 7.4）按1∶1 000稀釋，煮沸10 min，4 ℃、3 000 r/min離心5 min，取100 μL包被96 孔酶標板，以PBS作為陰性對照，4 ℃過夜。隨后每孔用200 μL的5%脫脂奶粉在37 ℃封閉1 h。各孔用PBS-T洗滌3 次。將P蛋白用2%脫脂奶粉稀釋成0.5 μg/mL，每孔100 μL（陽性對照不加P蛋白），37 ℃孵育1 h，PBS-T洗滌5 次。用2%脫脂奶粉將兔抗P蛋白多克隆血清稀釋4 000 倍，每孔100 μL，37 ℃孵育1 h，PBS-T洗滌5 次。每孔加入HRP-羊抗兔IgG（1∶3 000）100 μL，37 ℃孵育l h，PBS-T洗滌5 次。加入100 μL辣根酶的底物TMB溶液，避光室溫放置15 min顯色；加入100 μL 1 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，酶標儀測OD450nm。

1.3.5 P蛋白與長牡蠣類HBGAs結(jié)合特性分析

取已知HBGAs 型別的100 μL（質(zhì)量濃度為20～80 μg/mL）長牡蠣不同組織上清液加入酶標板中，同時取100 μL PBS作為陰性對照，每個樣品做3 組平行，4 ℃過夜；棄去殘液，用PBS洗板3 次；加入2%脫脂乳稀釋的P蛋白（0.5～1.0 μg/mL），4 ℃過夜；用300 μL 10%的脫脂奶粉封閉，37 ℃孵育2 h，棄去封閉液，PBS洗板3 次；加入100 μL稀釋1 000～4 000 倍的兔多抗血清或單克隆抗體，37 ℃孵育1 h，用0.1%的PBS-T洗滌3 次；加入100 μL稀釋1 000～2 000 倍HRP標記的羊抗兔二抗，37 ℃孵育1 h，PBS-T洗滌3 次并拍干；加入100 μLHRP的底物TMB溶液，室溫避光15 min；加入100 μL 1 mol/L H2SO4溶液終止反應(yīng)，酶標儀測OD450nm。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實驗樣本均平行測定3 次，采用Excel 和Graphpad Prism 8軟件進行數(shù)據(jù)分析并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 P蛋白的克隆表達

PCR電泳驗證擴增得到P蛋白目的基因，結(jié)果見圖1?？梢钥闯觯瑑蓷l目的基因的條帶大小約為1 700 bp，與預(yù)測的基因大小相符，表明擴增成功。將擴增的基因通過大腸桿菌表達系統(tǒng)表達得到粗蛋白，蛋白的SDS-PAGE見圖2。

圖1 P蛋白基因PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gel electropherograms of PCR products of the P protein gene

圖2 GI.5（a）和GII.4（b）P蛋白的SDS-PAGE圖Fig.2 SDS-PAGE analysis of expressed P proteins of GI.5 (a) and GII.4 (b)

2.2 P蛋白的純化

表達的P蛋白均含His6標簽，可與Ni離子結(jié)合，故采用Ni-NTA瓊脂糖凝膠進行純化。純化后的蛋白進行SDSPAGE，如圖3所示，分子質(zhì)量約為61 kDa，與預(yù)測分子質(zhì)量一致，對照物BSA條帶清晰可見，且與其分子質(zhì)量（66.4 kDa）一致，說明結(jié)果可信。

圖3 GI.5（a）和GII.4（b）P蛋白的純化SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of purified P proteins of GI.5 (a) and GII.4 (b)

2.3 P蛋白與唾液HBGAs結(jié)合模式分析

利用來自不同個體表型明確的16 份唾液樣本，研究GI.5和GII.4 HuNoV P蛋白與HBGAs的結(jié)合模式（陰性對照和陽性對照的OD450nm＜0.1，說明無假陰性和假陽性發(fā)生），如圖4所示，GII.4 HuNoV P蛋白可與A型、B型、AB型和O型HBGAs不同程度結(jié)合，其中，與O型結(jié)合程度（＞78.7%）最強，其次是與A型和AB型（65.3%～90.7%），與B型結(jié)合程度（50.7%～68.0%）最弱，這種廣譜結(jié)合特性也是GII.4 HuNoV流行性強的原因。這一結(jié)合特性與其他GII型HuNoV，如GII.17、GII.13、GII.26的結(jié)合特性一致[28-30]，但GII.17與O型HBGAs的結(jié)合強度稍弱。GI.5 HuNoV P蛋白可與A型、AB型和O型HBGAs不同程度結(jié)合，且與O型HBGAs結(jié)合程度（＞85.7%）最強，與A型和AB型HBGAs結(jié)合的強度（31.9%～45.1%）低于GII.4 HuNoV，與B型HBGAs幾乎不結(jié)合。已有研究表明，GI.1、GI.3和GI.5 HuNoV與O型HBGAs有明顯的結(jié)合優(yōu)勢，但不同的GI型HuNoV與A、B和AB型HBGAs具有不同的結(jié)合模式[8]。

圖4 GI.5和GII.4型HuNoV P蛋白與16 份唾液結(jié)合模式分析Fig.4 Binding modes analysis of HuNoV P proteins to salivary HBGAs from 16 individuals with different blood types

2.4 P蛋白與長牡蠣類HBGAs結(jié)合模式分析

利用來自牡蠣不同組織的提取液，研究HuNoV P蛋白與類HBGAs結(jié)合模式。從圖5可以看出，兩種HuNoV均不能與閉殼肌提取液結(jié)合，推測牡蠣閉殼肌中可能沒有可以與GI.5和GII.4型HuNoV結(jié)合的類HBGAs。GII.4 HuNoV可不同程度地與鰓、消化腺和外套膜提取液結(jié)合，且在消化腺中富集量最大，這與GII型HuNoV能夠在牡蠣鰓、消化腺和外套膜中富集的報道一致[31]。GI.5 HuNoV與牡蠣消化腺組織提取液結(jié)合程度高于GII.4 HuNoV與消化腺的結(jié)合程度，而與鰓和外套膜的結(jié)合程度低于GII.4 HuNoV與鰓和外套膜的結(jié)合程度。已有研究表明，HuNoV在牡蠣各組織的富集程度與HuNoV的型別有關(guān)，GI型HuNoV易在牡蠣消化腺中富集，且GI型HuNoV的富集持久性高于GII型[2]，表明消化腺組織中含有易與HuNoV結(jié)合的類HBGAs。

圖5 HuNoV P蛋白與牡蠣不同組織提取液的結(jié)合模式分析Fig.5 Binding modes analysis of HuNoV P proteins to extracts from different tissues of oysters

為研究GI.5和GII.4型HuNoV與哪種型別的HBGAs結(jié)合，提取了牡蠣的消化腺組織，根據(jù)研究室前期的研究，長牡蠣消化腺組織中含有6 種類HBGAs，包括A、H1、Lea、Leb、Lex和Ley[32]，故用不同型別HBGAs所對應(yīng)的單克隆抗體研究HuNoV與HBGAs的結(jié)合模式，結(jié)果如圖6所示，GI.5和GII.4 HuNoV P蛋白主要與類A型和H1型HBGAs結(jié)合，其次是類Ley型，與類Lea和Lex型HBGAs的結(jié)合程度較弱，與類Leb型HBGAs結(jié)合程度最弱。該研究結(jié)果與之前報道的GII.4 HuNoV變異株與A型和H1型HBGAs具有結(jié)合優(yōu)勢的結(jié)果一致[33]。此外，GI.5 HuNoV P蛋白與類H1型HBGAs結(jié)合具有明顯優(yōu)勢。

圖6 HuNoV P蛋白與長牡蠣消化道類HBGAs結(jié)合模式分析Fig.6 Binding pattern analysis of HuNoV P proteins to HBGAs-like substances in digestive gland of oysters

已有研究表明，GI.1 HuNoV與類A型、H1型和Leb型HBGAs結(jié)合，GII.17 HuNoV與類A型、H1型HBGAs的結(jié)合程度較弱[34]，而本研究的GI.5 HuNoV與類Leb型HBGAs結(jié)合微弱，GII.4 HuNoV與6 種類HBGAs都具有結(jié)合特性，表明不同型別的HuNoV與類HBGAs具有不同的結(jié)合特性。本研究的GI.5和GII.4 HuNoV與類A型和H1型HBGAs具有明顯的結(jié)合優(yōu)勢，這與HuNoV的脅迫會導(dǎo)致類A型和類H1型HBGAs的表達量顯著上調(diào)的研究結(jié)果對應(yīng)[32]。

3 結(jié)論

牡蠣是HuNoV傳播的重要載體，牡蠣的濾食特性使其易富集環(huán)境中的HuNoV，牡蠣組織內(nèi)的類HBGAs增加了病毒富集的持久性，不同型別HuNoV與不同類HBGAs的結(jié)合模式不盡相同。本研究對比研究了流行株GI.5 HuNoV和GII.4 HuNoV與唾液HBGAs和長牡蠣類HBGAs的結(jié)合特性。結(jié)果表明，GII.4 HuNoV與唾液HBGAs具有廣譜結(jié)合特性，與A型、B型、AB型和O型HBGAs均具有較好的結(jié)合特性，而GI.5 HuNoV與O型HBGAs的結(jié)合最強，其次是A型和AB型，與B型HBGAs的結(jié)合最弱。GI.5和GII.4 HuNoV主要富集在牡蠣消化腺中，且主要與類A型、H1型和Ley型HBGAs結(jié)合，GII.4 HuNoV與類Leb型HBGAs有弱結(jié)合，而GI.5 HuNoV與類Leb型HBGAs幾乎不結(jié)合，表明不同型別的HuNoV與類HBGAs的結(jié)合特性不盡相同。本研究明確了HuNoV與HBGAs的結(jié)合模式，豐富了長牡蠣富集HuNoV的機制，探明了不同人群感染HuNoV的規(guī)律性。后續(xù)研究可從減少牡蠣類HBGAs的表達方面入手，減少HuNoV在牡蠣體內(nèi)的富集，提高牡蠣的食用安全性，為人類健康保駕護航。