褐藻膠的酶法降解及其產(chǎn)物的體外免疫活性

章 倩，戚慧敏，卞 斌，馬俊美，賴晨歡，黃曹興，凌 喆，勇 強(qiáng)

（南京林業(yè)大學(xué) 江蘇省林業(yè)資源高效加工利用協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210037）

褐藻膠低聚糖（alginate oligosaccharides，AOS）是由α-L-古羅糖醛酸與β-D-甘露糖醛酸通過β-1,4糖苷鍵連接而成的聚合度為2～20的嵌段化合物[1]。AOS由于具有安全無毒、分子質(zhì)量小和水溶性好等優(yōu)點(diǎn)[2]，越來越受到人們的關(guān)注。AOS的制備方法主要有氧化降解法、酸降解法和褐藻膠裂解酶降解法等，其中酶法降解因條件溫和、產(chǎn)物聚合度可控性較強(qiáng)和褐藻膠降解效率高等優(yōu)點(diǎn)，逐漸成為制備AOS的主要方法[3]。目前，酶法制備AOS是利用褐藻膠裂解酶的β-(1,4)-消除反應(yīng)對(duì)褐藻膠進(jìn)行降解[4]，并在非還原端產(chǎn)生不飽和雙鍵[5]；同時(shí)，不飽和褐藻膠降解產(chǎn)物在非酶作用下繼續(xù)轉(zhuǎn)化為4-脫氧-L-赤-5-己酮糖糖醛酸[6]。由于褐藻膠裂解酶對(duì)褐藻膠主鏈的降解作用是隨機(jī)的，因而同時(shí)產(chǎn)生分子質(zhì)量不等的褐藻膠降解產(chǎn)物，但酶法降解過程中不同分子質(zhì)量降解產(chǎn)物的得率變化目前鮮有文獻(xiàn)報(bào)道。

AOS具有豐富的生理活性，如免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤[7]和抗氧化[8]等，將海藻多糖轉(zhuǎn)化為高活性的海藻低聚糖是海藻資源精深加工的重要研究方向之一。有研究表明，AOS的生理活性與其制備方式、β-D-甘露糖醛酸與α-L-古羅糖醛酸比例[9]等相關(guān)，且AOS分子質(zhì)量可能是影響其活性的重要因素。AOS被證實(shí)可通過促進(jìn)RAW264.7巨噬細(xì)胞中誘導(dǎo)型一氧化氮合酶的表達(dá)從而誘導(dǎo)NO的生成，并促進(jìn)多種免疫細(xì)胞因子的分泌，進(jìn)而提高宿主免疫水平[10]。研究證明AOS分子構(gòu)象和分子質(zhì)量可能是影響其誘導(dǎo)細(xì)胞因子活性的重要因素，然而，關(guān)于不同分子質(zhì)量褐藻膠降解產(chǎn)物的免疫活性鮮見系統(tǒng)研究[11]。

本研究采用商品褐藻膠裂解酶對(duì)褐藻膠進(jìn)行降解，利用乙醇沉淀法對(duì)其不同分子質(zhì)量的酶解產(chǎn)物進(jìn)行分級(jí)分離，并通過單因素試驗(yàn)優(yōu)化酶法制備AOS的工藝參數(shù)。同時(shí)，分析酶解過程中不同分子質(zhì)量降解產(chǎn)物得率的變化情況。最后，在巨噬細(xì)胞體外模型上進(jìn)行不同分子質(zhì)量酶降解產(chǎn)物的免疫活性評(píng)價(jià)，以期為酶法降解褐藻膠的工藝研究以及褐藻膠降解產(chǎn)物的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

商品褐藻膠、商品褐藻膠裂解酶（酶活力10 000 units/g）上海麥克林生化科技有限公司。

小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7 中國科學(xué)院上海生物科學(xué)研究所；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、磷酸鹽緩沖液、胰酶 美國Hyclone公司；細(xì)菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、鏈霉素、青霉素、二甲基亞砜 美國Sigma-Aldrich公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（CCK-8）、一氧化氮檢測(cè)試劑盒 上海碧云天生物公司；小鼠白介素6（interleukin 6，IL-6）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor，TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒浙江聯(lián)科生物公司；小鼠Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）ELISA試劑盒 江蘇酶標(biāo)生物科技有限公司；TAK-242 美國MedChemExpress LLC公司；乙酸銨、氫氧化鈉、鹽酸、四硼酸鈉、咔唑等其他常規(guī)試劑（均為分析純）國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

DMEM完全培養(yǎng)基：向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加胎牛血清（10%，V/V）、鏈霉素（100 units/mL）和青霉素（100 units/mL），配成完全培養(yǎng)基；DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基：將褐藻膠酶解產(chǎn)物固體粉末溶解于DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，配制成40 g/L的母液，并利用0.22 μm孔徑的無菌濾膜過濾除菌，保存于無菌離心管。并在開始實(shí)驗(yàn)前用完全培養(yǎng)基將40 mg/mL的母液稀釋至所需質(zhì)量濃度。

1.2 儀器與設(shè)備

ICS 5000高效液相離子交換色譜 美國Dionex公司；1100凝膠滲透色譜 美國沃特世公司；UV-1800紫外分光光度計(jì) 德國Agilent公司；多功能酶標(biāo)儀美國BioTek公司。

1.3 方法

1.3.1 褐藻膠酶解

于100 mL酶解瓶中，采用0.05 mol/L醋酸銨緩沖液配制50 mL 10 g/L褐藻膠分散液，并加入適量固體的褐藻膠裂解酶粉末后，置于45 ℃、150 r/min搖床中酶解。分別研究pH值（5.0、6.0、7.0、8.0和9.0）、酶用量（10、15、20、25 U/g和30 U/g（以底物質(zhì)量計(jì)））和酶解時(shí)間（3、6、12、24 h和48 h）對(duì)AOS得率的影響。

1.3.2 褐藻膠酶解產(chǎn)物的分級(jí)分離

對(duì)褐藻膠酶解液采用分級(jí)醇沉法進(jìn)行處理，其操作如下：將無水乙醇添加至商品褐藻膠酶解液中直至其終體積分?jǐn)?shù)為50%，均勻混合后靜置10 000 r/min離心5 min，得到的沉淀標(biāo)記為SA50組分；向上清液中繼續(xù)添加無水乙醇直至其終體積分?jǐn)?shù)為75%，均勻混合后靜置離心，得到的沉淀標(biāo)記為SA75組分。AOS仍溶解于上清液中，采用真空蒸發(fā)除去乙醇，冷凍干燥后稱質(zhì)量，得到AOS組分。將上述所得的褐藻膠酶解產(chǎn)物（SA50、SA75和AOS）用去離子水復(fù)溶，并進(jìn)行透析處理（截留分子質(zhì)量為200 Da），每4 h更換新鮮的去離子水。透析后所得樣品溶液于冷凍干燥后密封保存。

1.3.3 細(xì)胞培養(yǎng)與傳代

細(xì)胞復(fù)蘇：將凍存有細(xì)胞的凍存管置于37 ℃下輕輕搖晃使其迅速融化，于無菌環(huán)境將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，加入10 mL DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基使其混勻后于1 000 r/min離心5 min，去除上清液，并于離心管中加入2 mL DMEM完全培養(yǎng)基將細(xì)胞沉淀復(fù)懸，最終將其轉(zhuǎn)移至含有8 mL完全培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，于飽和濕度、5% CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。第2天更換新配制的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

細(xì)胞傳代：當(dāng)細(xì)胞生長約占培養(yǎng)皿底面積80%時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。首先去除舊培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液沖洗細(xì)胞表面2 次；然后加入1 mL的胰酶消化液，并搖晃使其完全浸潤貼壁細(xì)胞，在培養(yǎng)箱中消化1 min；隨后加入5 mL新配制的DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基終止消化，并輕輕吹打培養(yǎng)皿底部的貼壁細(xì)胞，使其混勻成細(xì)胞懸液。將其轉(zhuǎn)移至離心管中1 000 r/min離心5 min，棄去上清液，并輕輕拍打離心沉淀后加入3 mL新鮮的DMEM完全培養(yǎng)基，并使其形成細(xì)胞懸液，然后取1 mL至含有9 mL新鮮的DMEM完全培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.4 褐藻膠酶解產(chǎn)物處理后RAW264.7細(xì)胞增殖能力測(cè)定

采用CCK-8試劑盒測(cè)定[12]。首先通過血球計(jì)數(shù)器計(jì)算細(xì)胞液的細(xì)胞密度，并調(diào)節(jié)細(xì)胞液的細(xì)胞密度為1×105個(gè)/mL，并以100 μL/孔添加到96 孔板中，培養(yǎng)24 h后吸去細(xì)胞液，并加入100 μL用新鮮培養(yǎng)基配成不同質(zhì)量濃度（25、50、100、200、400、800 μg/mL）待測(cè)樣品繼續(xù)培養(yǎng)24 h，同時(shí)設(shè)置1 μg/mL LPS作為陽性對(duì)照，以完全培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞為陰性對(duì)照。最后，吸取培養(yǎng)基后在每個(gè)孔中添加100 μL稀釋10 倍的CCK-8試劑，并在37 ℃和5% CO2環(huán)境下孵育1 h。用酶標(biāo)儀檢測(cè)在450 nm波長處的吸光度（A），用以定量細(xì)胞存活的程度。細(xì)胞活力按式（1）計(jì)算：

1.3.5 褐藻膠酶解產(chǎn)物處理后RAW264.7細(xì)胞NO分泌量測(cè)定

根據(jù)Griess反應(yīng)中亞硝酸鹽的含量[13]，研究褐藻膠酶解產(chǎn)物對(duì)RAW264.7細(xì)胞分泌NO的影響。首先，將100 μL對(duì)數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞（1×105個(gè)/mL）接種至96 孔板并培養(yǎng)24 h。移去培養(yǎng)液后加入含有不同質(zhì)量濃度（25～800 μg/mL）樣品的新鮮培養(yǎng)基100 μL，同時(shí)設(shè)置1 μg/mL的LPS作為陽性對(duì)照，以完全培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞為陰性對(duì)照。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，取培養(yǎng)上清液50 μL至新96 孔板，并于避光條件下加入100 μL Griess混合溶液（Griess I試劑與Griess II試劑體積比1∶1混合），反應(yīng)15 min后用酶標(biāo)儀測(cè)定540 nm波長處的吸光度。NO標(biāo)準(zhǔn)曲線：先用DMEM培養(yǎng)基配制濃度為0、3.125、6.25、12.5、25、50、100 μmol/L的NaNO2標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按上述操作測(cè)定吸光度并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算細(xì)胞上清液中NO濃度。

1.3.6 褐藻膠酶解產(chǎn)物處理后RAW264.7細(xì)胞細(xì)胞因子分泌量測(cè)定

使用ELISA試劑盒研究褐藻膠酶解產(chǎn)物對(duì)RAW264.7細(xì)胞分泌TNF-α、IL-6和TLR4含量的影響。首先，將100 μL對(duì)數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞（1×105個(gè)/mL）接種至96 孔板培養(yǎng)24 h。吸去細(xì)胞液后加入含有不同質(zhì)量濃度（200、400、800 μg/mL）樣品的新鮮培養(yǎng)基100 μL，以1 μg/mL的LPS和完全培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞作為陽性對(duì)照和陰性對(duì)照。培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，培養(yǎng)液離心收集上清液，按照ELISA試劑盒說明書測(cè)定細(xì)胞因子TNF-α、IL-6和TLR4的含量。

1.3.7 TAK-242處理后RAW264.7細(xì)胞活力測(cè)定

將100 μL 對(duì)數(shù)生長期的RAW 264.7 細(xì)胞（1×105個(gè)/mL）接種至96 孔板，培養(yǎng)24 h。除去培養(yǎng)液后，加入100 μL含有不同濃度TAK-242（0.5～64 μmol/L）的新鮮基礎(chǔ)培養(yǎng)基。并用無TAK-242的基礎(chǔ)培養(yǎng)基作為對(duì)照。培養(yǎng)4 h后使用CCK-8試劑盒分析細(xì)胞存活率以確定不同濃度TAK-242對(duì)細(xì)胞的毒性，所有實(shí)驗(yàn)均為3 個(gè)平行。

1.3.8 TAK-242處理后褐藻膠酶解產(chǎn)物刺激RAW264.7細(xì)胞分泌NO和細(xì)胞因子水平測(cè)定

將100 μL對(duì)數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞（1×105個(gè)/mL）接種至96 孔板，培養(yǎng)24 h。除去培養(yǎng)基后，將添加和不添加TAK-242（8 μmol/L）的新鮮完全培養(yǎng)基添加至孔板中，培養(yǎng)4 h；再用褐藻膠酶解產(chǎn)物不同組分（800 μg/mL）和陽性對(duì)照LPS（1 μg/mL）培養(yǎng)24 h。根據(jù)1.3.5節(jié)和1.3.6節(jié)方法測(cè)定NO、TNF-α、IL-6和TLR4的含量。

1.3.9 理化指標(biāo)分析

1.3.9.1 單糖的定量分析

β-D-甘露糖醛酸與α-L-古羅糖醛酸采用 DINOX ICS-5000 型高效液相陰離子交換色譜分析，外標(biāo)法測(cè)定。色譜條件：Carbo Pac PA10色譜柱（孔徑×長＝2 mm×250 mm），進(jìn)樣量10 μL，以100 mmol/L氫氧化鈉（A）和500 mmol/L醋酸鈉（B）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，柱溫為30 ℃，流速為0.3 mL/min，脈沖安培檢測(cè)器檢測(cè)[14]。

1.3.9.2 褐藻膠酶解產(chǎn)物的定量分析

在褐藻膠酶解產(chǎn)物分級(jí)分離的基礎(chǔ)上，將上述所得的褐藻膠酶解產(chǎn)物（SA50、SA75和AOS）配成5 g/L溶液，利用咔唑-硫酸法[15]測(cè)定其中糖醛酸含量。在冰浴條件下先后向具塞試管中加入0.5 mL樣品溶液和2.5 mL四硼酸鈉-硫酸溶液，充分混勻后，煮沸15 min。冰浴冷卻后，加入100 μL咔唑煮沸15 min。反應(yīng)結(jié)束后，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)530 nm波長處的吸光度。標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：準(zhǔn)確配制不同質(zhì)量濃度（0、0.02、0.04、0.06、0.08 g/L和0.10 g/L）的標(biāo)準(zhǔn)甘露糖醛酸和古羅糖醛酸溶液0.5 mL，冰浴條件下按上述操作測(cè)量吸光度，以醛酸質(zhì)量濃度（g/L）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。并根據(jù)1.3.9.1節(jié)方法測(cè)定樣品中單糖含量。褐藻膠降解產(chǎn)物得率和單糖得率（游離的糖醛酸）按式（2）計(jì)算：

式中：ρa(bǔ)為褐藻膠酶解產(chǎn)物的糖醛酸質(zhì)量濃度/（g/L）；ρb為褐藻膠酶解產(chǎn)物的單糖質(zhì)量濃度/（g/L）；ρg為商品SA中的糖醛酸質(zhì)量濃度/（g/L）。

1.3.9.3 重均分子質(zhì)量和聚合度分析

采用高效凝膠滲透色譜法檢測(cè)并分析3 個(gè)褐藻膠酶解產(chǎn)物組分的平均分子質(zhì)量。其操作條件如下：Agilent 1200型色譜儀（配有示差檢測(cè)器）；Ultrahydrogel 120和Ultrahydrogel 250串聯(lián)；柱溫55 ℃；流動(dòng)相NaNO3；進(jìn)樣量10 μL；流速0.6 mL/min。采用Chemstation色譜工作站和GPC軟件計(jì)算分子質(zhì)量；在此基礎(chǔ)上，采用數(shù)均分子質(zhì)量除以褐藻膠單糖組成的摩爾質(zhì)量，用于計(jì)算其平均聚合度。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS（2008）統(tǒng)計(jì)軟件（適用于Windows 16.0版本）通過方差分析（ANOVA）分析數(shù)據(jù)。使用Tukey多范圍檢驗(yàn)區(qū)分各組之間的差異顯著性。P＜0.05，數(shù)據(jù)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 褐藻膠酶解產(chǎn)物的分子質(zhì)量分析

為分析經(jīng)裂解酶處理后褐藻膠降解產(chǎn)物的分子質(zhì)量變化情況，以10 g/L褐藻膠為底物，45 ℃、pH 7.0、酶用量10 U/g條件下反應(yīng)24 h，并采用乙醇分級(jí)分離方法對(duì)酶解液進(jìn)行處理，獲得3 個(gè)褐藻膠降解產(chǎn)物組分（SA50、SA75和AOS）。商品褐藻膠和3 種褐藻膠酶解產(chǎn)物組分的凝膠排阻色譜圖、重均分子質(zhì)量和平均聚合度如圖1所示。褐藻膠原料以及3 種褐藻膠酶解產(chǎn)物組分的信號(hào)峰都呈現(xiàn)典型的正態(tài)分布，說明褐藻膠和分級(jí)醇沉得到的3 種組分的分子質(zhì)量相對(duì)均一且純度較高。根據(jù)各個(gè)組分的出峰時(shí)間可推斷，3 種組分的相對(duì)分子質(zhì)量均遠(yuǎn)小于商品褐藻膠。其中，褐藻膠的重均分子質(zhì)量為292 kDa，與文獻(xiàn)[16]報(bào)道相似（219～343 kDa）。SA50、SA75和AOS 3 種組分重均分子質(zhì)量分別為13.4、5.73 kDa和3.85 kDa；且乙醇體積分?jǐn)?shù)越高，其所分離的組分分子質(zhì)量越低，這和同為酸性多糖的聚半乳糖醛酸酶解產(chǎn)物的分級(jí)醇沉規(guī)律相同[17]。此外，根據(jù)各組分的數(shù)均分子質(zhì)量折算其平均聚合度可知，酶解處理前褐藻膠的平均聚合度為1 032，經(jīng)酶解處理后，其平均聚合度顯著降低至16～54。其中，AOS組分的平均聚合度為16，屬于低聚糖。

圖1 褐藻膠及其酶解產(chǎn)物的凝膠排阻色譜圖和平均聚合度Fig.1 Gel exclusion chromatograms and average polymerization degrees of alginate and its enzymatic digestion products

2.2 AOS的酶法制備工藝優(yōu)化

以10 g/L褐藻膠為底物，于45 ℃、酶用量10 U/g條件下經(jīng)褐藻膠裂解酶酶解24 h，pH值對(duì)AOS得率的影響如圖2a所示。結(jié)果表明，褐藻膠酶解產(chǎn)物中同時(shí)存在3 種不同分子質(zhì)量的褐藻膠不完全降解產(chǎn)物（SA50、SA75和AOS）。當(dāng)pH值從5.0增加至7.0，AOS組分得率從3.20%增加到最高29.13%；而進(jìn)一步酶解pH值至9.0時(shí)，AOS得率降低到0.72%。在pH 7.0的條件下，AOS得率最高可達(dá)到29.13%；此時(shí)，SA50和SA75得率分別可達(dá)38.30%和28.45%。酶解pH值對(duì)褐藻膠不完全降解產(chǎn)物各組分得率有顯著影響，這可能與褐藻膠不溶于酸性溶液以及褐藻膠裂解酶的酸堿度耐受性有極大的關(guān)系[18]。因此，褐藻膠酶法制備AOS的適宜酶解pH值為7.0。

圖2 酶解參數(shù)對(duì)AOS制備的影響Fig.2 Effect of enzymatic hydrolysis parameters on the preparation of alginate oligosaccharides

圖2b結(jié)果表明，當(dāng)酶用量從10 U/g增加到30 U/g時(shí)，SA50和AOS組分的得率逐漸降低，而SA75組分的得率逐步增高。在酶用量為15 U/g時(shí)，酶解所得SA50、SA75和AOS組分的得率分別為26.94%、35.08%和30.32%，此時(shí)酶解產(chǎn)物的聚合度低于10 U/g酶用量時(shí)酶解產(chǎn)物的聚合度。值得探究的是隨著酶用量的增加，AOS得率從最高30.32%逐步下降至15.58%，總糖得率從96.70%降低至84.48%，這可能是因?yàn)楹衷迥z裂解酶處理后會(huì)產(chǎn)生不飽和單糖，并且隨著酶用量和酶解程度的增加，酶解產(chǎn)物中不飽和單糖含量不斷增加。這一現(xiàn)象和Tang Shou等[19]的研究結(jié)果一致：6 U/mL重組褐藻膠裂解酶處理褐藻膠，其不飽和單糖的轉(zhuǎn)化率高達(dá)37.6%。因此，褐藻膠酶法制備AOS的適宜酶用量為15 U/g。

如圖2c所示，在酶解過程中，SA50組分的得率隨著降解時(shí)間的延長而逐步降低；SA75和AOS組分的得率隨著降解時(shí)間的延長而逐漸升高。降解時(shí)間為24 h時(shí)，SA50、SA75和AOS組分得率分別為27.47%、35.93%和28.05%。3 個(gè)酶解組分的變化可以說明隨著降解時(shí)間的延長，AOS的聚合度逐步降低。并且酶解時(shí)間24 h相對(duì)于48 h可以減少工藝耗時(shí)、提高生產(chǎn)效率。因此，褐藻膠酶法制備AOS的適宜酶解時(shí)間為24 h。綜上所述，以10 g/L褐藻膠為底物、45 ℃、pH 7.0、酶用量15 U/g和反應(yīng)時(shí)間24 h是生物酶解法制備AOS的最適條件，此時(shí)AOS得率最高為28.05%。黃菊等[20]利用褐藻膠裂解酶酶解褐藻膠制備“褐藻低聚糖”，產(chǎn)率可高達(dá)75%，但是其所得到的“褐藻低聚糖”分子質(zhì)量高達(dá)6～8 kDa，并不是聚合度為2～20的AOS。

2.3 褐藻膠酶解產(chǎn)物對(duì)巨噬細(xì)胞免疫功能的影響

2.3.1 褐藻膠酶解產(chǎn)物對(duì)RAW264.7細(xì)胞增殖的影響

巨噬細(xì)胞可以通過多種信號(hào)通路達(dá)到免疫調(diào)節(jié)的目的[21]，因此，采用巨噬細(xì)胞評(píng)估褐藻膠酶解產(chǎn)物的體外免疫調(diào)節(jié)能力；而LPS是公認(rèn)的巨噬細(xì)胞促分裂原，通常用于刺激巨噬細(xì)胞釋放一氧化氮和細(xì)胞因子[22]，用作陽性對(duì)照。如圖3所示，褐藻膠及其酶解產(chǎn)物均可以促進(jìn)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7的增殖，且呈現(xiàn)質(zhì)量濃度依賴性，當(dāng)樣品質(zhì)量濃度為100～800 μg/mL時(shí)，經(jīng)褐藻膠及其酶解產(chǎn)物培養(yǎng)的細(xì)胞存活率顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），表明它們是生物安全的，可應(yīng)用于生物體內(nèi)。

圖3 褐藻膠酶解產(chǎn)物對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力的影響Fig.3 Effect of enzymatically hydrolyzed alginate on the viability of RAW264.7 cells

2.3.2 褐藻膠酶解產(chǎn)物對(duì)RAW264.7細(xì)胞釋放NO的影響

NO被認(rèn)為是由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的重要分子，其參與調(diào)節(jié)生理或病理過程，包括宿主對(duì)抗病原體和血管舒張[23]。如圖4所示，褐藻膠及其酶解產(chǎn)物均可促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞的NO產(chǎn)生（P＜0.05），并具有質(zhì)量濃度依賴性。

圖4 褐藻膠酶解產(chǎn)物對(duì)RAW264.7細(xì)胞中NO產(chǎn)率的影響Fig.4 Effect of enzymatically hydrolyzed alginate on the production of NO in RAW264.7 cells

2.3.3 褐藻膠酶解產(chǎn)物對(duì)RAW264.7細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響

TLR4是糖類誘導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)中刺激巨噬細(xì)胞和糖類識(shí)別的主要受體[24]。并且該受體的級(jí)聯(lián)激活可以引發(fā)免疫細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子的級(jí)聯(lián)催化反應(yīng)，從而可以同時(shí)促進(jìn)包括TNF-α、IL-6等細(xì)胞因子的分泌[25]。這些細(xì)胞因子可直接參與胞間相互作用，從而調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)、抑制腫瘤生長。Mami等[26]研究酶解褐藻膠獲得的不同聚合度褐藻寡糖對(duì)巨噬細(xì)胞分泌IL-1α和IL-1β、IL-6的影響，同樣發(fā)現(xiàn)了AOS可以促進(jìn)細(xì)胞因子的分泌，且AOS聚合度與其細(xì)胞因子分泌量未見明顯相關(guān)性。然而，目前鮮有文獻(xiàn)對(duì)比AOS和其他不同分子質(zhì)量范圍褐藻膠降解產(chǎn)物的體外免疫活性差異。本研究系統(tǒng)對(duì)比了褐藻膠和3 種分子質(zhì)量褐藻膠酶解產(chǎn)物對(duì)RAW264.7細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響，結(jié)果如圖5所示。與對(duì)照組相比，褐藻膠酶解產(chǎn)物顯著促進(jìn)了TLR4、TNF-α和IL-6的分泌（P＜0.001），并具有質(zhì)量濃度依賴性。SA75組分的免疫調(diào)節(jié)活性最為顯著，TNF-α和IL-6的分泌量可分別達(dá)到16 895.77、69 613.89 pg/mL，甚至高于LPS，這可能是因?yàn)殡S著酶解程度的提高，酶解產(chǎn)物中不飽和單糖含量不斷增加，AOS組分中的不飽和單糖較多，導(dǎo)致其免疫活性降低。

圖5 褐藻膠酶解產(chǎn)物對(duì)RAW264.7細(xì)胞中TNF-α（a）、IL-6（b）和TLR4（c）分泌的影響Fig.5 Effect of enzymatically hydrolyzed alginate on the secretion of TNF-α (a),IL-6 (b) and TLR4 (c) in RAW264.7 cells

2.3.4 TAK-242對(duì)褐藻膠酶解產(chǎn)物體外免疫調(diào)節(jié)活性的影響

為了驗(yàn)證褐藻膠酶解產(chǎn)物的免疫刺激通路，本研究引入了TLR4的阻斷劑TAK-242以探究TAK-242對(duì)褐藻膠酶解產(chǎn)物免疫調(diào)節(jié)活性的影響。TAK-242是直接選擇性和受體TLR4結(jié)合并干擾TLR4和銜接分子之間的相互作用[27]的小分子特異性抑制劑。在研究TLR4和褐藻膠酶解產(chǎn)物介導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)活性之間的相關(guān)性前，先通過CCK-8確定TAK-242對(duì)RAW264.7細(xì)胞的毒性作用。如圖6a所示，隨著TAK-242濃度的增加，細(xì)胞存活率逐漸降低。具體而言，4 μmol/L TAK-242對(duì)RAW264.7細(xì)胞的存活無影響，而超過該濃度后，TAK-242對(duì)細(xì)胞的毒性作用逐漸顯現(xiàn)。因此，選擇4 μmol/L的TAK-242培養(yǎng)細(xì)胞4 h以測(cè)試其是否影響褐藻膠酶解產(chǎn)物誘導(dǎo)NO的產(chǎn)生。圖6b與理論預(yù)期一致，與未添加抑制物組相比，引入TAK-242顯著降低了NO的產(chǎn)生（P＜0.05）。在所有使用TAK-242的組中，AOS組分誘導(dǎo)的NO生成量從11.38 mol/L降低至4.82 mol/L。這一結(jié)果與TAK-242作用于與其他多糖如桑黃多糖和馬尾松花粉多糖培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞的結(jié)果一致[28-29]。這些結(jié)果也表明TLR4信號(hào)通路與褐藻膠酶解產(chǎn)物誘導(dǎo)NO分泌的過程有關(guān)，同時(shí)表明其他受體也可能與褐藻膠酶解產(chǎn)物的免疫調(diào)節(jié)活性有關(guān)。

圖6 不同濃度TAK-242對(duì)細(xì)胞存活率的影響（a）和褐藻膠酶解產(chǎn)物對(duì)有無TAK-242孵育RAW264.7細(xì)胞中NO產(chǎn)生的影響（b）Fig.6 Effect of different concentrations of TAK-242 on cell viability (a) and effects of enzymatically hydrolyzed alginate on NO production in RAW264.7 cells incubated with or without TAK-242 (b)

TAK-242對(duì)褐藻膠酶解產(chǎn)物免疫調(diào)節(jié)活性的影響如圖7所示，特異性抑制劑的加入嚴(yán)重影響了TNF-α和IL-6的分泌。與NO的減少量相比，TAK-242的添加將SA75組分的IL-6分泌量從51 794.74 pg/mL降低到284.21 pg/mL。當(dāng)用TAK-242和LPS培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，獲得了相似的結(jié)果。同時(shí)TLR4的降低表明褐藻膠酶解產(chǎn)物通過誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞TLR4的分泌引起級(jí)聯(lián)反應(yīng)，可以促進(jìn)NO、TNF-α和IL-6的分泌，從而調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞免疫活性；但是顯著性不高，說明還有其他的免疫刺激通路。

圖7 褐藻膠酶解產(chǎn)物對(duì)有無TAK-242條件下培養(yǎng)的RAW264.7細(xì)胞中TNF-α（a）、IL-6（b）和 TLR4（c）分泌的影響Fig.7 Effect of enzymatically hydrolyzed alginate on the secretion of TNF-α (a),IL-6 (b) and TLR4 (c) in RAW264.7 cells cultivated with or without TAK-242

3 結(jié)論

通過對(duì)褐藻膠酶法降解工藝進(jìn)行優(yōu)化，并通過巨噬細(xì)胞體外模型系統(tǒng)評(píng)價(jià)了不同分子質(zhì)量范圍的褐藻膠酶解產(chǎn)物組分免疫活性差異，得到以下結(jié)論：1）褐藻膠在底物質(zhì)量濃度10 g/L、45 ℃、pH 7.0和酶用量15 U/g最優(yōu)條件下經(jīng)褐藻膠裂解酶酶解24 h，此時(shí)通過乙醇分級(jí)分離獲得了3 種不同分子質(zhì)量范圍的降解產(chǎn)物SA50、SA75和AOS，其重均分子質(zhì)量分別為13.4、5.73 kDa和3.85 kDa；得率分別為27.47%、35.93%和28.05%。2）不同分子質(zhì)量范圍褐藻膠酶解產(chǎn)物的體外免疫增強(qiáng)效果不同，本研究中SA75組分（分子質(zhì)量為5.73 kDa）促進(jìn)細(xì)胞因子分泌的能力高于其他酶解組分。3）通過TLR4阻斷劑TAK-242的引入，證實(shí)了褐藻膠酶解產(chǎn)物通過誘導(dǎo)TLR4的分泌，促進(jìn)NO和其他細(xì)胞因子的分泌。