枯草芽孢桿菌SNBS-3全基因組測序及其抑菌物質(zhì)預(yù)測分析

紀(jì)帥奇，烏日娜,3，張?zhí)葬?，婁夢雪，丁瑞雪，馬 穎，武俊瑞,3,*

（1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽 110866；2.遼寧省食品發(fā)酵技術(shù)工程研究中心，遼寧 沈陽 110866；3.沈陽市微生物發(fā)酵技術(shù)創(chuàng)新重點實驗室，遼寧 沈陽 110866）

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）是一類細(xì)長桿狀、內(nèi)生孢子的革蘭氏陽性細(xì)菌，本身可產(chǎn)生多種具有良好廣譜抑菌性、穩(wěn)定性和安全性的抑菌物質(zhì)，例如，對金黃色葡萄球菌和單核細(xì)胞增生李斯特菌等多種食源性致病菌有良好抑制作用的細(xì)菌素Subtilosin A，其已被認(rèn)為是未來可替代傳統(tǒng)抗生素的重要物質(zhì)[1-3]。此外，由于枯草芽孢桿菌可產(chǎn)生多種抑菌物質(zhì)，在發(fā)酵黃豆醬中能夠抑制有害菌的生長，提高發(fā)酵豆醬的品質(zhì)，因此，枯草芽孢桿菌在食品防腐保鮮方面發(fā)揮著重要作用[4]。

隨著計算機技術(shù)和生物信息學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，高通量測序技術(shù)在微生物基因組中得到廣泛應(yīng)用，使人們能準(zhǔn)確、高效解析微生物基因組信息，進(jìn)而更好挖掘微生物功能及其作用機制[5-8]。近年來，研究者利用全基因組測序技術(shù)對不同芽孢桿菌開展菌株生物學(xué)特性研究，挖掘菌株基因組信息，預(yù)測菌株功能，這對深入挖掘細(xì)菌素合成基因簇、鑒定細(xì)菌素特定基因以及細(xì)菌素功能基因組學(xué)等方面具有重要的意義[9-13]。

為了詳細(xì)解析枯草芽孢桿菌基因組信息，本研究對從豆醬中分離的1 株具有優(yōu)良抑菌特性的枯草芽孢桿菌SNBS-3進(jìn)行全基因組測序，獲得基因組信息的同時，結(jié)合直系同源集（Clusters of Orthologous Groups，COG）、基因本體論（Gene Ontology，GO）、京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）、碳水化合物活性酶（Carbohydrate-Active Enzymes，CAZyme）、抗生素耐藥性數(shù)據(jù)庫（Comprehensive Antibiotic Resistance Database，CARD）和致病毒力因子數(shù)據(jù)庫（Virulence Factor Database，VFDB）等，詳細(xì)地解析基因組和菌株次級產(chǎn)物信息，應(yīng)用AntiSMASH和Bagel4軟件發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌SNBS-3具有完整合成細(xì)菌素的基因簇，結(jié)合抑菌實驗和蛋白酶實驗結(jié)果驗證該菌具有合成細(xì)菌素的能力。旨在更好地為開發(fā)枯草芽孢桿菌SNBS-3提供生物信息基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枯草芽孢桿菌SNBS-3分離于遼寧省沈陽市傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬，保存于沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院菌庫，沙門氏菌（Salmonella）、大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、單核細(xì)胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）、痢疾志賀氏菌（Shigella dysenteriae）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）同為本實驗室保存菌種。

LB培養(yǎng)基 上海源葉生物科技有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒 中科瑞泰（北京）生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀、TDE超低溫冰箱 美國賽默飛世爾科技公司；TGL-168高速臺式離心機 德國艾本德公司。

1.3 方法

1.3.1 體外抑菌實驗

枯草芽孢桿菌SNBS-3培養(yǎng)24 h收集上清液。指示菌制成活菌數(shù)為106CFU/mL的菌懸液，采用打孔法測定上清液抑菌特性，菌懸液涂布后在孔內(nèi)滴加50 μL上清液，培養(yǎng)24 h后測量抑菌圈直徑[14]。

1.3.2 蛋白酶實驗

蛋白酶K酶液（20 mg/mL）與離心后的上清液按1∶20比例混合，45 ℃水浴30 min后取出，對照組為不加蛋白酶K、45 ℃水浴30 min的上清液，進(jìn)行抑菌實驗，測量抑菌圈直徑[15]。

1.3.3 菌株DNA提取

將枯草芽孢桿菌SNBS-3培養(yǎng)24 h，離心收集菌體，采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取菌株DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取后的DNA純度和濃度[16-17]。

1.3.4 全基因組測序

本次測序委托上海美吉生物科技有限公司完成。樣本質(zhì)檢合格后，采用二代測序技術(shù)和第三代高通量測序平臺完成測序分析，原始數(shù)據(jù)的接頭去除及低質(zhì)量序列等工作使用質(zhì)量統(tǒng)計軟件來進(jìn)行優(yōu)化。

1.3.5 基因組組裝

基于三代測序數(shù)據(jù)，使用軟件Unicycler v 0.4.8進(jìn)行組裝，組裝過程中會借助Pilonjin v1.22軟件進(jìn)行序列校正，得到初步組裝結(jié)果，使用SOAPdenovo2軟件對組裝結(jié)果進(jìn)一步校正，得最終組裝結(jié)果[18-19]。

1.3.6 基因預(yù)測

通過GeneMarkS軟件對基因組中的編碼序列進(jìn)行預(yù)測。利用tRNAscan-SE v2.0和Barrnap軟件分別對基因組中tRNA和rRNA進(jìn)行預(yù)測，獲得基因組中tRNA和rRNA序列信息[20-22]。

1.3.7 基因組圈圖繪制

將測序得到的基因組序列、編碼基因預(yù)測及非編碼RNA等信息文件組裝成GBK文件，通過CGView軟件繪制單個樣本基因組圈圖，全面展示測序基因組特征[23]。

1.3.8 基因功能分析

預(yù)測的編碼蛋白序列分別與COG、GO、KEGG、CAZyme數(shù)據(jù)庫中的蛋白序列進(jìn)行BLAST比對和注釋。預(yù)測的基因組序列分別與CARD進(jìn)行序列比對，完成耐藥基因分析。預(yù)測的氨基酸序列與VFDB進(jìn)行比對，完成毒力基因注釋結(jié)果[24-29]。

1.3.9 抑菌物質(zhì)預(yù)測分析

應(yīng)用在線軟件AntiSMASH和Bagel4對菌株SNBS-3全基因組中抑菌物質(zhì)合成基因簇進(jìn)行挖掘，參數(shù)均設(shè)置為默認(rèn)參數(shù)[30-31]。

2 結(jié)果與分析

2.1 枯草芽孢桿菌的體外抑菌效果

由圖1可知，枯草芽孢桿菌上清液中的抑菌物質(zhì)對6 種指示菌均有影響，其中對革蘭氏陽性菌的抑制效果比革蘭氏陰性菌效果更好，對金黃色葡萄球菌抑制效果最好。

圖1 枯草芽孢桿菌SNBS-3體外抑菌實驗Fig.1 In vitro antimicrobial activity of B.subtilis SNBS-3

2.2 蛋白酶對枯草芽孢桿菌上清液抑菌能力的影響

由表1可知，枯草芽孢桿菌SNBS-3上清液經(jīng)過蛋白酶K處理前后對6 種指示菌的抑制能力下降較大，均超過50%，說明上清液含有的抑菌物質(zhì)為蛋白質(zhì)或肽類。

表1 蛋白酶對上清液抑菌能力的影響Table 1 Effect of protease on the antibacterial activity of the fermentation supernatant of B.subtilis SNBS-3

2.3 基因組組成與信息

由圖2可知，枯草芽孢桿菌SNBS-3的基因組為一條環(huán)狀閉合DNA，大小為4 076 387 bp，共預(yù)測到4 000 個蛋白質(zhì)編碼基因、86 個tRNA基因、30 個rRNA基因、91 個sRNA。由圖3可知，基因平均長度為897.02 bp，最短基因長度為90 bp，最長基因長度為16 545 bp，長度大于等于500 bp的基因有2 815 個，長度大于等于1 000 bp的基因有1 328 個；串聯(lián)重復(fù)序列為34 個，重復(fù)比例為0.8%；散在重復(fù)序列為35 個，重復(fù)比例為0.07%。

圖2 枯草芽孢桿菌SNBS-3基因組圖Fig.2 Genome map of B.subtilis SNBS-3

圖3 枯草芽孢桿菌SNBS-3基因長度圖Fig.3 Lengths of genes from B.subtilis SNBS-3

2.4 基因功能注釋

2.4.1 COG數(shù)據(jù)庫注釋

將菌株SNBS-3基因組中的蛋白編碼基因在COG數(shù)據(jù)庫注釋，共有3 209 個蛋白質(zhì)編碼基因得到注釋，結(jié)果如圖4所示。

圖4 枯草芽孢桿菌SNBS-3 COG注釋分類Fig.4 Classification of COG annotations of B.subtilis SNBS-3

由圖4可知，注釋結(jié)果共有20 類，分別有1、172、34、302、80、255、103、97、159、260、124、196、39、103、196、67、859、127、32、54 個基因注釋分類到B～V。其中未知功能基因最多，共859 個，占注釋基因總數(shù)的26.77%，接下來注釋基因數(shù)量較多的功能分類依次：氨基酸轉(zhuǎn)運與代謝（E）302 個（占比9.41%）、轉(zhuǎn)錄（K）260 個（占比8.1%）、碳水化合物運輸和代謝（G）255 個（占比7.95%）、細(xì)胞壁/細(xì)胞膜/細(xì)胞被膜（M）和無機離子的轉(zhuǎn)運與代謝（P）各占196 個（占比6.11%）。

2.4.2 GO數(shù)據(jù)庫注釋

將菌株SNBS-3基因組中的氨基酸序列與GO數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對分析，共有2 824 個功能基因得到注釋，結(jié)果如圖5所示。

圖5 枯草芽孢桿菌SNBS-3 GO注釋分類Fig.5 Classification of GO annotations of B.subtilis SNBS-3

由圖5可知，2 258、1 645 個和1 638 個功能基因分別注釋到分子功能、生物過程和細(xì)胞組分。在分子功能中，分類到ATP結(jié)合和DNA結(jié)合功能基因占比最多，分別為324 個（占比8.1%）和283 個（占比7.08%）。在生物過程中，分類到細(xì)胞孢子的產(chǎn)生與形成和轉(zhuǎn)錄調(diào)控、DNA模板化功能基因占比最多，分別為172 個（占比4.3%）和108 個（占比2.7%）。在細(xì)胞組分中，分類到膜整體組件和質(zhì)膜功能基因占比最多，分別為809 個（占比20.73%）和587 個（占比14.68%）。

2.4.3 KEGG數(shù)據(jù)庫注釋

由圖6可知，注釋結(jié)果顯示共有2 560 個基因在KEGG途徑中富集到細(xì)胞過程、新陳代謝、人類疾病、遺傳信息處理、有機系統(tǒng)和環(huán)境信息處理五大功能中，共計42 條代謝通路。其中注釋到新陳代謝的相關(guān)基因最多，共計1 780 個，其次依次為環(huán)境信息處理、遺傳信息處理、細(xì)胞過程、人類疾病和有機系統(tǒng)，相關(guān)基因依次為300、191、150、93 個和46 個。

圖6 枯草芽孢桿菌SNBS-3 KEGG注釋分類Fig.6 Classification of KEGG annotations of B.subtilis SNBS-3

2.4.4 CAZyme數(shù)據(jù)庫注釋

將菌株SNBS-3中基因組數(shù)據(jù)與CAZyme數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對分析，發(fā)現(xiàn)基因組中共有147 個基因編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域?qū)儆贑AZyme家族，注釋結(jié)果如表2所示。

表2 枯草芽孢桿菌SNBS-3 CAZyme注釋結(jié)果Table 2 Results of CAZyme annotations of B.subtilis SNBS-3

由表2可知，糖苷水解酶最多，其次分別為糖基轉(zhuǎn)移酶、碳水化合物酯酶、多糖裂解酶、氧化還原酶和碳水化合物結(jié)合域。在糖苷水解酶中，纖維素酶基因（GH5家族基因）共有1 個，淀粉酶基因（GH13家族基因）有8 個。

2.4.5 CARD注釋

CARD是目前使用最為廣泛、包含最為全面的細(xì)菌耐藥基因數(shù)據(jù)庫，通過CARD數(shù)據(jù)庫注釋，以identity≥80%為條件，CARD注釋結(jié)果如表3所示。菌株SNBS-3的基因組有耐藥基因12 個，其中ykkC、blt、bmr、ykkD、vmlR基因具有多重耐藥性，含有多個耐藥受體，推測SNBS-3可能具有一定耐藥性。

表3 枯草芽孢桿菌SNBS-3 CARD注釋結(jié)果Table 3 Results of CARD annotations of B.subtilis SNBS-3

2.4.6 VFDB注釋

將菌株SNBS-3中基因組數(shù)據(jù)與VFDB進(jìn)行比對分析，以identity≥70%作為篩選條件，結(jié)果如表4所示。基因組中共發(fā)現(xiàn)有4 個毒力因子。其中clpC毒力基因與細(xì)菌黏附相關(guān)[32]，clpP毒力基因與菌株生長代謝相關(guān)[33]，bslA和capsule兩個毒力基因的功能注釋未知，還有待研究。

表4 枯草芽孢桿菌SNBS-3 VFDB注釋結(jié)果Table 4 Results of VFDB annotations of B.subtilis SNBS-3

2.5 抑菌物質(zhì)預(yù)測分析

通過在線軟件AntiSMASH和Bagel4挖掘發(fā)現(xiàn)SNBS-3產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)信息如表5所示，其細(xì)菌素合成基因簇如圖7所示。由表5可看出，枯草芽孢桿菌SNBS-3可能產(chǎn)生抑菌物質(zhì)Subtilosin A、Surfactin、Plipastatin、Mycosubtilosin、Bacilysin、Bacillaene。由圖7可知，SNBS-3具有完整合成Subtilosin A基因簇。其中sboA是編碼細(xì)菌素Subtilosin A結(jié)構(gòu)基因，翻譯后的前體結(jié)構(gòu)沒有抑菌活性，需經(jīng)切割加工為成熟蛋白才有活性[34]。albA對Subtilosin A前體翻譯后進(jìn)行修飾，起到結(jié)合金屬離子和酶輔因子的作用。albB、albC和albD對菌株起到保護(hù)作用，抵御自身分泌的細(xì)菌素和環(huán)境中的抗菌劑的作用[35-36]。albE、albF和albG負(fù)責(zé)調(diào)控Subtilosin A的合成，與Subtilosin A產(chǎn)量有關(guān)[37]。通過前期抑菌實驗和蛋白酶K實驗結(jié)果可知，上清液抑菌能力下降原因可能是Subtilosin A或其他多肽類抑菌物質(zhì)被蛋白酶K分解失去活性，而剩下的抑菌活性為不受蛋白酶K影響的其他抑菌物質(zhì)保留的，因此枯草芽孢桿菌SNBS-3具有合成包括細(xì)菌素在內(nèi)的多種抑菌物質(zhì)的能力，具有生防菌的潛力。

表5 抑菌物質(zhì)相關(guān)基因及其功能注釋匯總Table 5 Summary of genes related to bacteriostatic substances and their function annotations

圖7 細(xì)菌素合成基因簇Fig.7 Gene cluster for bacteriocin synthesis

3 討論與結(jié)論

目前，作為一項高效檢測技術(shù)，全基因組測序已廣泛應(yīng)用于芽孢桿菌抑菌物質(zhì)預(yù)測與挖掘。Johny等[38]對從海洋中分離的貝萊斯芽孢桿菌FTL7進(jìn)行全基因組測序，證明了其具有產(chǎn)生細(xì)菌素的能力并闡明了其抑菌機制。Dindhoria等[39]對地衣芽孢桿菌MCC 2514進(jìn)行全基因組測序，發(fā)現(xiàn)該菌株具有多種脂肽和細(xì)菌素的基因簇，具有一定防腐的能力。Iqbal等[40]對從土壤中分離得到具有抗菌活性的矮芽孢桿菌SF-4進(jìn)行測序和分析，獲得與功能多樣性、進(jìn)化和生物合成潛力相關(guān)基因組的同時，準(zhǔn)確預(yù)測到菌株基因組內(nèi)多種抑菌物質(zhì)合成基因簇。

本研究通過全基因組測序發(fā)現(xiàn)S N B S-3 含有Surfactin、Mycosubtilosin、Plipastatin、Bacilysin、Bacillaene和Subtilosin A等多種抑菌物質(zhì)的基因簇。這些抑菌物質(zhì)在芽孢桿菌或其他菌株均有相關(guān)報道，其中Surfactin是目前已知的表面活性最強的生物表面活性劑之一，可有效破壞細(xì)菌的生物膜[41]；Mycosubtilin是一種由非核糖體合成的Iturin家族脂肽，Yu Chenjie等[42]發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌ATCC6633中產(chǎn)生的Mycosubtilin對引起谷物作物疾病的稻谷鐮刀菌和黃萎病鐮刀菌具有良好抑制作用。Plipastatin是Fengycin家族脂肽，參與抑制磷脂酶A2和生物膜的形成，可有效抑制常見食源性致病菌[43]。Bacilysin是一種由芽孢桿菌產(chǎn)生的二肽抑菌物質(zhì)，其可通過抑制葡萄糖胺6-磷酸合酶而發(fā)揮對革蘭氏陰性食源性致病菌的抑制效果[44]。Bacillaene是一種多烯抗生素，通過抑制蛋白合成發(fā)揮作用，本身對光、溫度、氧氣等因素十分敏感[45]。細(xì)菌素Subtilosin A是一種由核糖體合成的抑菌物質(zhì)，Guo Yaoqi等[46]發(fā)現(xiàn)Subtilosin A對多種細(xì)菌具有殺菌活性，在食品保鮮方面具有潛在的應(yīng)用價值。以上結(jié)果表明，通過全基因組測序推測SNBS-3產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)較多，種類廣泛，具有良好的生防潛力。

綜上，本研究對具有良好抑菌能力的枯草芽孢桿菌SNBS-3進(jìn)行全基因組測序，通過與多種數(shù)據(jù)庫比對，發(fā)現(xiàn)其基因組為一條環(huán)狀閉合DNA，大小為4 076 387 bp，GC含量為43.82%，預(yù)測共有4 000 個蛋白質(zhì)編碼基因、86 個tRNA基因、30 個rRNA基因和91 個sRNA基因。應(yīng)用AntiSMASH和Bagel4在線分析軟件，快速且準(zhǔn)確地從基因?qū)用骖A(yù)測枯草芽孢桿菌SNBS-3產(chǎn)抑菌物質(zhì)及其細(xì)菌素Subtilosin A的合成基因簇。解析SNBS-3基因組的同時也有助于未來實現(xiàn)Subtilosin A的異源表達(dá)，降低細(xì)菌素的生產(chǎn)成本，提高菌株在食品防腐和生物防治方面的應(yīng)用價值。