亞油酸含量對(duì)大豆11S球蛋白膜理化性質(zhì)的影響

周榮雪，趙 源，石林凡，任中陽，翁武銀

（集美大學(xué)海洋食品與生物工程學(xué)院，福建 廈門 361021）

大豆蛋白價(jià)格低廉、資源豐富，具有良好的成膜性能[1]。由大豆蛋白制備的可食膜具有良好的透明度、機(jī)械性能和氣體阻隔性能，是應(yīng)用在食品包裝上塑料薄膜的良好替代材料[2]。然而，由于大豆蛋白含有較多的親水基團(tuán)，導(dǎo)致蛋白膜的水蒸氣阻隔能力較差，從而限制了其應(yīng)用范圍[3]。因此，近年來有關(guān)油脂添加對(duì)可食膜理化性質(zhì)影響的研究逐漸受到國內(nèi)外研究學(xué)者的關(guān)注。前期研究發(fā)現(xiàn)乳液膜的性質(zhì)與油脂的分布具有一定關(guān)聯(lián)性[4]，但關(guān)于大豆蛋白基乳液中蛋白與油脂的相互作用規(guī)律及其對(duì)乳液膜性質(zhì)影響的研究仍然不夠深入。

大豆7S（β-伴大豆球蛋白）和11S（大豆球蛋白）球蛋白占大豆蛋白質(zhì)總量的80%以上[5]，因此常被用于研究，以深入了解大豆蛋白的乳化性和成膜性。11S球蛋白分子質(zhì)量約為340～380 kDa，由6 個(gè)亞基組成，每個(gè)亞基由一個(gè)酸性多肽和一個(gè)堿性多肽通過二硫鍵連接而成[6]。11S球蛋白中含有大量巰基，可形成分子間二硫鍵[7]，因此大豆11S球蛋白可食膜的抗拉伸強(qiáng)度（tensile strength，TS）大于7S球蛋白基可食膜[8]。前期研究發(fā)現(xiàn)，添加亞油酸會(huì)使蛋白分子間的疏水相互作用和共價(jià)鍵增加，導(dǎo)致7S球蛋白膜的TS降低，而水蒸氣透過系數(shù)（water vapor permeability，WVP）呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)[9]。然而，有關(guān)亞油酸對(duì)11S球蛋白乳液膜影響的研究卻鮮有報(bào)道。

為了深入解析蛋白-油脂的作用規(guī)律，已有研究利用分子動(dòng)力學(xué)模擬從微觀角度揭示分子間的相互作用[10]。Zhou Rongxue等[9]通過分子動(dòng)力學(xué)模擬發(fā)現(xiàn)，亞油酸可以通過靜電相互作用、范德華相互作用和氫鍵與7S球蛋白發(fā)生相互作用。因此，本實(shí)驗(yàn)從大豆中提取11S球蛋白，研究亞油酸與11S球蛋白的相互作用規(guī)律，以及亞油酸含量對(duì)11S球蛋白膜理化性質(zhì)的影響，探究乳液成膜過程中脂質(zhì)和蛋白之間的相互作用，為大豆蛋白乳液成膜機(jī)制的研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆購于黑龍江可心農(nóng)副產(chǎn)品有限公司。

亞油酸（純度≥95%）上海麥克林生化科技有限公司；異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）、尼羅紅 上海阿拉丁試劑有限公司；其他化學(xué)試劑均為分析級(jí)。

1.2 儀器與設(shè)備

UM113攪拌脫泡機(jī) 日本Unix公司；DHR-2型流變儀、Q2000型差示掃描量熱儀 美國TA儀器有限公司；TCSSP8型共聚焦激光掃描顯微鏡 德國徠卡公司；Phenom ProX G6型掃描電子顯微鏡、Nicolet IS 50型傅里葉變換紅外光譜儀 美國賽默飛世爾科技公司；TA-XT Plus型質(zhì)構(gòu)儀 英國Stable Micro Systems公司；TS7700分光測色儀 深圳市三恩時(shí)科技有限公司；UV-8000A型紫外-可見分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 11S球蛋白的提取

大豆經(jīng)液氮粉碎后，在25 ℃真空干燥24 h，使用正己烷制備脫脂豆粉，采用Peng Liping等[11]方法提取11S球蛋白。將100 g脫脂豆粉分散于1 500 mL蒸餾水中并攪拌2 h，使用0.5 mol/L NaOH溶液使豆粉溶液pH值維持在7.5。豆粉溶液經(jīng)離心（20 ℃、9 000×g）30 min后，在上清液中加入亞硫酸氫鈉并調(diào)節(jié)pH值至6.4后，在4 ℃靜置16 h。將溶液于4 ℃、6 500×g離心20 min，收集沉淀并將其分散于蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH值至7.0，并在4 ℃透析48 h，獲得的11S球蛋白溶液凍干后保存－20 ℃。

1.3.2 11S球蛋白膜的制備

參考Hu Yanyu等[4]報(bào)道的方法制備11S球蛋白膜。將8 g 11S球蛋白和1.6 g甘油溶于100 mL蒸餾水中，磁力攪拌30 min，調(diào)pH值至9.0，90 ℃水浴加熱30 min后，分別加入相對(duì)于蛋白質(zhì)量0%、10%、20%、30%和40%的亞油酸，均質(zhì)5 min，脫除氣泡后獲得11S球蛋白成膜液。將成膜液均勻倒入5 cm×5 cm的有機(jī)硅膠樹脂框內(nèi)，在（25.0±0.5）℃、相對(duì)濕度（relative humidity，RH）（50±5）%的恒溫恒濕箱中干燥24 h后，手動(dòng)剝離，在相同條件下保存48 h后，測定分析理化性質(zhì)。

1.3.3 成膜液表觀黏度的測定

根據(jù)Cao Wenqi等[12]的方法，利用配有帕爾貼平板的（直徑為40 mm，間隙為0.5 mm）的流變儀對(duì)成膜液的表觀黏度進(jìn)行測定。測定溫度為25 ℃，剪切速率范圍為0.01～1 000 s－1。

1.3.4 成膜液和膜的共聚焦激光掃描顯微鏡（confocal laser scanning microscopy，CLSM）觀察

根據(jù)Zhao Yuan等[13]的方法，采用CLSM觀察油滴在成膜液和膜中的分布狀態(tài)。蛋白相和油相分別采用FITC和尼羅紅標(biāo)記，激發(fā)光波長分別設(shè)為488 nm和552 nm。根據(jù)1.3.2節(jié)的方法，用染色后的成膜液制備膜，使用CLSM進(jìn)行觀察。

1.3.5 膜的表征

1.3.5.1 掃描電子顯微鏡（scanningelectron microscopy，SEM）觀察

測定前，將膜置于硅膠中充分脫水，使用雙面導(dǎo)電膠將膜固定在鋁制樣品支架上，噴金，利用SEM在5 kV加速電壓下觀察膜上下表面的微觀結(jié)構(gòu)。

1.3.5.2 傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）測定

使用FTIR測定膜上下表面的紅外光譜，掃描波數(shù)范圍為4 000～400 cm－1，分辨率為4 cm－1。

1.3.5.3 差示掃描量熱法（differential scanning calorimetry，DSC）分析

將膜樣品存放在硅膠中干燥2 周后，使用DSC儀測定11S球蛋白膜的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度（Tg），測量溫度范圍為－10～110 ℃，加熱速率為10 ℃/min。

1.3.5.4 機(jī)械性能測定

根據(jù)Zhao Yuan等[14]方法，使用質(zhì)構(gòu)儀測定膜的機(jī)械性能，夾具初始距離和拉伸速度分別設(shè)為30 mm和60 mm/min。膜的TS和斷裂延伸率（elongation at break，EAB）分別根據(jù)Zhao Yuan等[14]報(bào)道的公式進(jìn)行計(jì)算。

1.3.5.5 WVP測定

參照Zhao Yuan等[14]方法測定膜的WVP，將膜覆蓋在裝有干燥硅膠的塑料瓶口，于30 ℃、100% RH環(huán)境中放置8 h，每隔1 h進(jìn)行稱質(zhì)量。膜的WVP（g/（m·Pa·s））根據(jù)Zhao Yuan等[14]報(bào)道的公式計(jì)算。

1.3.5.6 顏色測定

將膜置于白板上，用色差儀測定膜的顏色，記錄顏色參數(shù)L*（亮度）、a*（綠紅度）和b*（藍(lán)黃度）值。白板的L*、a*和b*值分別為94.66、－0.07和1.10。

1.3.5.7 透明度測定

利用紫外分光光度計(jì)測定膜在600 nm波長處的吸光度。膜的透明度根據(jù)Hu Yanyu等[15]報(bào)道的公式計(jì)算。

1.3.5.8 化學(xué)作用力測定

將膜樣品在液氮中研磨成粉，于25 ℃真空干燥后，稱取約20 mg溶于1 mL pH值為7.0的4 種不同變性溶液中。4 種變性溶液分別為0.6 mol/L NaCl（S1）、0.6 mol/L NaCl＋1.5 mol/L尿素（S2）、0.6 mol/L NaCl＋8 mol/L尿素（S3）、0.6 mol/L NaCl＋8 mol/L尿素＋0.5 mol/Lβ-巰基乙醇（S4）。將樣品在25 ℃振蕩24 h，離心后（10 000×g，30 min）獲得上清液，采用改良Lowry蛋白檢測試劑盒測定上清液中的蛋白含量。同時(shí)，將膜溶解在2 mol/L NaOH溶液中，測定溶解的總蛋白含量。膜中離子鍵的比例為S1中溶解的蛋白占總蛋白含量的百分比。氫鍵的比例為溶解在S2中的蛋白減去溶解在S1中的蛋白（S2－S1）占總蛋白含量的百分比。同樣，疏水相互作用和共價(jià)鍵比例分別為S3－S2和S4－S3占總蛋白含量的百分比。

1.3.6 分子動(dòng)力學(xué)（molecular dynamics，MD）模擬

1.3.6.1 MD模擬體系的構(gòu)建

11S球蛋白晶體結(jié)構(gòu)來自PDB數(shù)據(jù)庫（PDB ID：1OD5），利用Discovery Studio軟件包的Prepare Protein模塊補(bǔ)全缺失的氨基酸殘基。亞油酸（PubChem CID：5280450）SDF文件從PubChem數(shù)據(jù)庫獲得，然后使用Discovery Studio Visualizer軟件轉(zhuǎn)化成PDB文件。將11S球蛋白分子放在邊長為14 nm的正方體模擬盒中心，盒子中裝滿水分子，水分子模擬模型為TIP3P。將模擬盒子沿z軸正負(fù)方向分別延長6 nm，并用亞油酸分子填滿延伸區(qū)域。

1.3.6.2 MD模擬過程

在周期性邊界條件下，使用GROMACS 2020.4軟件包在AMBER14SB力場中進(jìn)行MD模擬。為了消除分子間的相互作用力，采用最速下降法使初始系統(tǒng)的能量最小化，使最大作用力小于100.0 kJ/（mol·nm）。先經(jīng)過100 ps的模擬退火，再在等溫等壓系統(tǒng)下模擬1 ns實(shí)現(xiàn)系統(tǒng)平衡。分子動(dòng)力學(xué)模擬在溫度為298 K、壓力為1 bar的等溫等壓條件下進(jìn)行，時(shí)間步長為2 fs，模擬時(shí)間為100 ns，每100 ps保存1 次運(yùn)行軌跡。采用Leap-frog算法對(duì)牛頓運(yùn)動(dòng)方程進(jìn)行積分，應(yīng)用LINCS算法約束所有化學(xué)鍵的鍵長。長程靜電相互作用利用Particle-Mesh-Ewald方法進(jìn)行計(jì)算，而范德華相互作用采用Lennard-Jones函數(shù)進(jìn)行計(jì)算，其非鍵截?cái)嗑嚯x設(shè)定為1.2 nm。利用Visual Molecular Dynamics軟件對(duì)MD模擬結(jié)果進(jìn)行可視化，利用GROMACS分析工具計(jì)算MD模擬過程中11S球蛋白的均方根偏差（root mean square deviation，RMSD），蛋白和亞油酸分子間最小距離、相互作用能。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS statistics 26.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。通過Duncan檢驗(yàn)（P＜0.05）進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 亞油酸含量對(duì)蛋白成膜液物理性質(zhì)的影響

2.1.1 亞油酸含量對(duì)蛋白成膜液表觀黏度的影響

如圖1所示，在同一剪切速率下，成膜液的表觀黏度隨亞油酸含量增大而增大。這可能是因?yàn)橛偷闻c周圍流體之間的摩擦增加了能量耗散的速度[16]。另一方面，隨著剪切速率增加，所有樣品的表觀黏度均逐漸減小。這是因?yàn)榧羟辛ζ茐牧顺赡ひ褐蓄w粒與顆粒之間的相互作用，導(dǎo)致絮凝體尺寸減小，黏度降低。Krstono?i?等[17]在研究不同蛋白對(duì)水包魚油乳液穩(wěn)定性的影響中發(fā)現(xiàn)類似的剪切稀化行為，這是因?yàn)榧羟袌隹梢愿淖冾w粒的空間分布，包括使非球形顆粒與流體場對(duì)齊、去除顆粒上的溶劑分子以及破壞絮凝顆粒。

圖1 亞油酸-11S球蛋白成膜液的表觀黏度Fig.1 Apparent viscosity of linoleic acid-11S globulin film-forming solutions

2.1.2 亞油酸含量對(duì)成膜液中油滴分布的影響

使用CLSM觀察亞油酸在11S球蛋白成膜液中的分布，結(jié)果如圖2a所示。未添加亞油酸的11S球蛋白溶液在FITC的作用下呈現(xiàn)均勻的綠色。當(dāng)亞油酸的添加量為10%時(shí)，成膜液中出現(xiàn)均勻分布的油滴。隨著亞油酸含量增加，油滴數(shù)量逐漸增多，尺寸逐漸增增大。這可能是因?yàn)槌赡ひ褐杏拖囿w積增大后，油滴之間更容易發(fā)生碰撞，導(dǎo)致絮凝和聚集。

圖2 亞油酸-11S球蛋白成膜液（a）和膜（b）的CLSM圖像Fig.2 CLSM images of linoleic acid-11S globulin film-forming solutions (a) and films (b)

2.2 亞油酸含量對(duì)蛋白膜理化性質(zhì)的影響

2.2.1 亞油酸含量對(duì)蛋白膜中油滴分布的影響

亞油酸在11S球蛋白膜中的分布如圖2b所示。未添加亞油酸的11S球蛋白膜結(jié)構(gòu)均勻致密。添加10%亞油酸后，膜中出現(xiàn)均勻分布的小油滴，但油滴輪廓不明顯。隨著亞油酸含量增大，膜中油滴尺寸逐漸增大。當(dāng)亞油酸添加量大于20%時(shí)，膜表面出現(xiàn)大量輪廓清晰的大尺寸油滴，這說明膜基質(zhì)與亞油酸融合能力有限，無法束縛過量的亞油酸。相比于成膜液中的油滴，膜中的油滴尺寸更大，這可能是因?yàn)樵诟稍锍赡み^程中，油滴隨水分的減少進(jìn)一步絮凝和聚集。Hu Yanyu等[18]也發(fā)現(xiàn)了干燥成膜后油滴粒徑增大的現(xiàn)象，這與干燥過程中膜組分濃度隨水分蒸發(fā)而逐漸增大有關(guān)。

2.2.2 亞油酸含量對(duì)蛋白膜微觀形貌的影響

利用SEM觀察11S球蛋白膜的微觀結(jié)構(gòu)，如圖3所示。在膜的上表面，11S球蛋白膜表面光滑平整。當(dāng)亞油酸添加量為10%時(shí)，膜表面出現(xiàn)分布均勻的油滴。隨亞油酸含量增加，膜表面的油滴數(shù)量逐漸增加，尺寸逐漸增大，這與成膜液中亞油酸液滴數(shù)量和尺寸變化趨勢(shì)相吻合（圖2a）。11S球蛋白膜的下表面和上表面同樣光滑致密。然而，與膜上表面不同的是，加入亞油酸后，膜下表面并未出現(xiàn)油滴，且表面凹凸不平。根據(jù)11S球蛋白膜截面觀察結(jié)果，結(jié)構(gòu)致密的蛋白膜伴隨亞油酸的添加逐漸出現(xiàn)孔洞，表明亞油酸液滴會(huì)破壞膜基質(zhì)的連續(xù)性。7S球蛋白乳液膜上下表面均存在油滴[9]，而本研究中11S球蛋白膜下表面未出現(xiàn)油滴，這可能是因?yàn)?1S球蛋白與亞油酸之間相互作用較弱。Zhao Yuan等[14]在研究大豆油濃度對(duì)大豆分離蛋白（soy protein isolate，SPI）乳液膜表面微觀結(jié)構(gòu)的影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)成膜液中的油滴在干燥過程中上浮，導(dǎo)致膜下表面沒有油滴出現(xiàn)。膜下表面凹凸不平的結(jié)構(gòu)可能是因?yàn)楹衼営退岬?1S球蛋白成膜液黏度大，流動(dòng)性差，在干燥過程中油滴上浮留下的空間無法及時(shí)被蛋白補(bǔ)充所導(dǎo)致。

圖3 添加亞油酸對(duì)11S球蛋白復(fù)合膜微觀結(jié)構(gòu)的影響Fig.3 Effect of linoleic acid on the microstructure of 11S globulin composite films

2.2.3 亞油酸含量對(duì)蛋白膜結(jié)構(gòu)的影響

酰胺I帶（C＝O拉伸）、酰胺II帶（N—H彎曲）和酰胺III帶（C—N拉伸）分別位于1 633、1 532 cm－1和1 235 cm－1處[4]。酰胺A帶是由參與形成氫鍵的N—H和O—H伸縮振動(dòng)引起。位于3 010 cm－1處的吸收峰是由亞油酸中共軛C＝C上的C—H鍵伸縮振動(dòng)產(chǎn)生[19]。位于2 925 cm－1和2 855 cm－1處的吸收峰分別對(duì)應(yīng)亞油酸中C—H對(duì)稱和不對(duì)稱的伸縮振動(dòng)[20]。

如圖4a所示，在膜的上表面，隨著亞油酸含量增加，位于3 010、2 925 cm－1和2 855 cm－1處的吸收峰強(qiáng)度增加，這與膜上表面油滴數(shù)量逐漸增加的現(xiàn)象一致（圖3）。添加亞油酸后，11S球蛋白膜中氫鍵沒有明顯變化。然而，先前的研究發(fā)現(xiàn)，7S球蛋白膜中的氫鍵隨著亞油酸含量增加而逐漸降低[9]。這可能是因?yàn)?S球蛋白與亞油酸之間的相互作用阻礙膜中氫鍵生成，而11S球蛋白與亞油酸相互作用較弱。亞油酸的加入對(duì)于膜下表面的紅外譜圖沒有明顯影響（圖4b），這是因?yàn)樵诟稍锍赡み^程中油滴向上表面遷移所導(dǎo)致（圖3）。

圖4 亞油酸-11S球蛋白膜上表面（a）和下表面（b）的FTIR光譜Fig.4 FTIR spectra of the upper (a) and lower (b) surfaces of linoleic acid-11S globulin films

2.2.4 亞油酸含量對(duì)蛋白膜熱穩(wěn)定性的影響

利用DSC測定11S球蛋白膜的Tg，結(jié)果如圖5所示。未添加亞油酸的11S球蛋白膜Tg為53.50 ℃。隨著亞油酸含量增大，膜的Tg逐漸降低。通常油的加入會(huì)阻礙蛋白之間的相互作用，增加蛋白網(wǎng)絡(luò)的靈活性，降低膜的熱穩(wěn)定性[21]。同樣地，Zhao Yuan等[14]在向SPI膜中添加水包油預(yù)乳液后發(fā)現(xiàn)，隨著膜中油含量增加，膜的Tg降低。

圖5 添加亞油酸對(duì)11S球蛋白膜的熱穩(wěn)定性的影響Fig.5 Effect of linoleic acid on the thermal stability of 11S globulin films

2.2.5 亞油酸含量對(duì)蛋白膜機(jī)械性能的影響

由表1所知，11S球蛋白膜的TS和EAB（12.67 MPa和95.58%）高于7S球蛋白膜（10.31 MPa和53.36%）[9]。復(fù)合膜內(nèi)部存在強(qiáng)共價(jià)鍵會(huì)導(dǎo)致膜在斷裂的同時(shí)表現(xiàn)出高韌性、高強(qiáng)度和高應(yīng)變[22]。在本研究中，11S球蛋白富含巰基[7]，在成膜過程中可能會(huì)形成分子間二硫鍵，導(dǎo)致膜的TS和EAB較高。Cho等[23]發(fā)現(xiàn)，使用SPI中高分子質(zhì)量組分制備的蛋白膜TS和EAB均高于使用低分子質(zhì)量蛋白制備的膜。因此，分子質(zhì)量較大的11S球蛋白制備的蛋白膜TS和EAB較高。隨著亞油酸含量增加，膜的TS逐漸減小，而EAB逐漸增大。膜的TS降低可能是因?yàn)樘畛湓谀せ|(zhì)中的亞油酸破壞了11S球蛋白網(wǎng)絡(luò)。類似的結(jié)果也出現(xiàn)在SPI-阿拉伯樹膠乳液膜中，精油的加入破壞了生物聚合物網(wǎng)絡(luò)，導(dǎo)致膜的TS降低[24]。油滴以易變形的液體存在于膜基質(zhì)中，可以增強(qiáng)膜中聚合物鏈的流動(dòng)性和彈性，導(dǎo)致膜的EAB增加[25]。

表1 亞油酸含量對(duì)11S球蛋白膜TS、EAB和WVP的影響Table 1 Effect of linoleic acid concentration on the TS,EAB and WVP of 11S globulin films

2.2.6 亞油酸含量對(duì)蛋白膜WVP的影響

蛋白分子中帶有極性基團(tuán)，當(dāng)其與水分子相互作用時(shí)可以增加聚合物的自由體積和聚合物鏈段的流動(dòng)性，導(dǎo)致蛋白膜水蒸氣阻隔能力下降[3]。11 S球蛋白膜的WVP如表1所示。11S球蛋白膜的WVP（2.52×10－10g/（m·Pa·s））與7S球蛋白膜的WVP（2.62×10－10g/（m·Pa·s））相近。隨著亞油酸含量增加，膜的WVP逐漸減小，這可能是因?yàn)樘畛湓谀せ|(zhì)中的亞油酸提高了膜的整體疏水性，減少蛋白對(duì)水分子的吸附，導(dǎo)致膜的WVP下降。

2.2.7 亞油酸含量對(duì)蛋白膜顏色的影響

亞油酸含量對(duì)11S球蛋白膜顏色的影響如表2所示。與標(biāo)準(zhǔn)白板相比，11S球蛋白膜L*值和a*值較低，而b*值較高，表明11S球蛋白膜呈淡黃色。隨著亞油酸含量增加，膜的L*值和a*值逐漸增加，b*值逐漸下降。植物油脂對(duì)可食膜顏色的影響很大程度上取決于其來源[26]。在先前的報(bào)道中，將亞油酸加入7S球蛋白膜中，L*值和a*值增加，b*值減小，這與亞油酸的顏色屬性有關(guān)[9]。

表2 亞油酸含量對(duì)11S球蛋白膜顏色和透明度的影響Table 2 Effect of linoleic acid concentration on the color and transparency of 11S globulin films

2.2.8 亞油酸含量對(duì)蛋白膜透明度的影響

如表2所示，11S球蛋白的透明度略大于報(bào)道的7S球蛋白膜（0.81）[9]，這可能是因?yàn)樵诩訜嶙冃赃^程中，7S球蛋白溶液保持透明，而11S球蛋白的溶解度隨溫度升高而降低，溶液的渾濁度增加[27]。當(dāng)亞油酸添加量為10%時(shí)，膜的透明度與未添加亞油酸的11S球蛋白膜無顯著差異（P＞0.05）。隨著亞油酸含量繼續(xù)增大，膜的透明度逐漸增加，這可能是因?yàn)榕c膜基質(zhì)不相容的油滴逐漸增多并浮至表面（圖3），導(dǎo)致光散射增強(qiáng)。根據(jù)之前的報(bào)道，復(fù)合膜中組分之間相容性較差，光易在兩相處發(fā)生分散或反射，導(dǎo)致膜的透明度降低[28]。

2.3 亞油酸含量對(duì)11S球蛋白成膜機(jī)制的影響

2.3.1 成膜液的MD模擬

通過分子動(dòng)力學(xué)模擬描述11S球蛋白在亞油酸-水體系中的微觀行為，從而進(jìn)一步探究11S球蛋白與亞油酸之間的相互作用情況。RMSD是評(píng)價(jià)模擬體系是否穩(wěn)定的重要指標(biāo)[29]。如圖6b所示，模擬體系在30 ns后趨于穩(wěn)定。11S球蛋白與亞油酸之間的最小距離變化情況如圖6c所示，在模擬的200 ns內(nèi)，11S球蛋白未到達(dá)亞油酸界面層。同時(shí)，11S球蛋白與亞油酸之間未發(fā)生靜電相互作用和范德華相互作用（圖6d）。在之前的研究中發(fā)現(xiàn)，7S球蛋白可吸附至亞油酸界面層，并通過靜電相互作用、范德華相互作用和氫鍵與之穩(wěn)定結(jié)合[9]。11S球蛋白和7S球蛋白在油-水體系中的行為差異可能與二者的結(jié)構(gòu)差異有關(guān)。含有二硫鍵的11S球蛋白具有剛性結(jié)構(gòu)也可能導(dǎo)致其不易與亞油酸發(fā)生相互作用[30]。有研究表明，大豆11S球蛋白二硫鍵含量比7S球蛋白多，且具有不靈活的剛性結(jié)構(gòu)，因此11S球蛋白的乳化性比7S球蛋白差[31]。

圖6 11S球蛋白在亞油酸體系中的MD模擬Fig.6 MD simulation of interaction between 11S globulin and linoleic acid

2.3.2 蛋白成膜液和膜的化學(xué)作用力分析

11S球蛋白成膜液中的化學(xué)作用力占比如圖7a所示。在11S球蛋白成膜液中，離子鍵、氫鍵、疏水相互作用、二硫鍵和共價(jià)鍵的占比分別為52.38%、17.50%、23.70%、5.52%和1.56%，表明離子鍵為11S球蛋白成膜液中貢獻(xiàn)最大的化學(xué)鍵。11S球蛋白成膜液中疏水相互作用比例（10.49%）明顯高于報(bào)道的7S球蛋白成膜液，而氫鍵（30.11%）和共價(jià)鍵比例（15.40%）明顯低于7S球蛋白成膜液[9]。這可能是因?yàn)?1S球蛋白中非極性氨基酸含量遠(yuǎn)高于7S球蛋白，而谷氨酸和賴氨酸等可生成共價(jià)鍵的極性氨基酸含量低于7S球蛋白[31-32]。隨著亞油酸的添加，11S球蛋白成膜液中蛋白分子間的離子鍵比例降低，氫鍵、疏水相互作用和非二硫共價(jià)鍵比例增加（圖7a）。這可能是油脂能夠提供疏水環(huán)境，促使包裹在蛋白內(nèi)部的疏水基團(tuán)暴露出來[33]。

圖7 添加亞油酸對(duì)蛋白成膜液（a）和膜（b）中化學(xué)作用力的影響Fig.7 Effect of linoleic acid on chemical forces in film-forming solutions (a) and resulting films (b)

溶液干燥成膜后，氫鍵、二硫鍵和非二硫共價(jià)鍵比例增加，離子鍵和疏水相互作用比例下降（圖7b），表明干燥11S球蛋白分子間距離縮短后促進(jìn)氫鍵、二硫鍵和非二硫共價(jià)鍵的形成。添加亞油酸后，膜中的離子鍵和二硫鍵比例降低，疏水相互作用和非二硫鍵共價(jià)鍵比例增加，而氫鍵沒有顯著變化（圖7b）。有研究報(bào)道，大豆分離蛋白中的巰基在干燥成膜過程中容易與空氣中的氧氣反應(yīng)形成分子間二硫鍵[7,34]。然而，由于亞油酸具有良好的抗氧化性[35]，添加的亞油酸在一定程度上會(huì)抑制巰基氧化生成二硫鍵，導(dǎo)致巰基可能參與氫鍵的形成。

3 結(jié)論

本研究揭示了亞油酸含量對(duì)11S球蛋白膜理化性質(zhì)的影響規(guī)律。分子動(dòng)力學(xué)模擬結(jié)果表明11S球蛋白與亞油酸分子間不會(huì)發(fā)生相互作用。添加的亞油酸會(huì)填充在膜基質(zhì)中，且隨著亞油酸含量的增加油滴尺寸逐漸增大。在干燥過程中油滴容易向上移動(dòng)，結(jié)果導(dǎo)致膜的上下表面油脂分布不均勻和透明度下降。亞油酸的添加還會(huì)改變11S球蛋白膜中蛋白間的相互作用，進(jìn)而影響膜的機(jī)械性能、水蒸氣阻隔性能和熱穩(wěn)定性。本研究結(jié)果表明，添加亞油酸不會(huì)與11S球蛋白發(fā)生相互作用，但會(huì)改變蛋白間的相互作用，進(jìn)而影響膜的理化性質(zhì)。