熒光RNA及其生物傳感技術(shù)研究進(jìn)展

左方婷，張雅強(qiáng)，楊慧敏，楊弋，陳顯軍

特邀綜述

熒光RNA及其生物傳感技術(shù)研究進(jìn)展

左方婷1,2,3，張雅強(qiáng)1,2,3，楊慧敏1,2，楊弋1,2，陳顯軍1,2

1. 華東理工大學(xué)光遺傳學(xué)與合成生物學(xué)交叉學(xué)科研究中心，生物反應(yīng)器工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237 2. 華東理工大學(xué)藥學(xué)院，上海市細(xì)胞代謝光遺傳學(xué)技術(shù)前沿科學(xué)研究基地，上海 200237 3. 華東理工大學(xué)生物工程學(xué)院，上海 200237

熒光RNA技術(shù)是一種新興的RNA標(biāo)記技術(shù)，可用于活細(xì)胞RNA的原位實(shí)時(shí)標(biāo)記與成像，對(duì)于人們理解RNA的功能和調(diào)控機(jī)制發(fā)揮著至關(guān)重要的作用?；跓晒釸NA的生物傳感技術(shù)可用于活細(xì)胞內(nèi)小分子代謝物以及蛋白質(zhì)等靶標(biāo)的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)檢測(cè)，為生命科學(xué)基礎(chǔ)研究以及生物醫(yī)學(xué)傳感技術(shù)開發(fā)提供極具價(jià)值的工具。本文對(duì)遺傳編碼的熒光RNA的發(fā)展歷程、熒光RNA技術(shù)在活細(xì)胞RNA成像，以及基于熒光RNA的生物傳感技術(shù)在活細(xì)胞代謝物檢測(cè)等方面的應(yīng)用進(jìn)行了介紹和總結(jié)，并對(duì)該領(lǐng)域的發(fā)展現(xiàn)狀和未來發(fā)展方向展開討論和展望，以期為該技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展和在相關(guān)領(lǐng)域的應(yīng)用提供參考。

熒光RNA；熒光標(biāo)記；RNA成像；生物傳感

光遺傳學(xué)可被視作研究光信號(hào)與生物信號(hào)交互作用的學(xué)科，而遺傳編碼熒光標(biāo)記技術(shù)可幫助人們解析活細(xì)胞中生命的動(dòng)態(tài)過程。綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)是人類發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)天然的熒光蛋白，1962年由日本化學(xué)家、海洋生物學(xué)家Osamu Shimomura從維多利亞水母()中分離提取[1]。1992年，美國分子生物學(xué)家Douglas C. Prasher等[2]完成對(duì)其基因序列的測(cè)定。1994年，美國科學(xué)家Martin Chalfie等[3]在大腸桿菌()、線蟲()中成功實(shí)現(xiàn)了GFP的異源表達(dá)，首次證明GFP可以作為遺傳編碼的熒光標(biāo)簽。此后，研究者也發(fā)現(xiàn)了來源于其他物種的典型熒光蛋白，包括俄羅斯科學(xué)院生物有機(jī)化學(xué)研究所Sergey A. Lukyanov課題組發(fā)現(xiàn)的來源于香菇珊瑚()的紅色熒光蛋白DsRed[4]等。美國加州大學(xué)錢永健課題組進(jìn)一步優(yōu)化熒光蛋白的生化和熒光性質(zhì)，拓寬了熒光蛋白的應(yīng)用范圍[5～7]。熒光蛋白的出現(xiàn)，為活細(xì)胞蛋白質(zhì)標(biāo)記帶來革命性突破，已經(jīng)成為當(dāng)代生命科學(xué)研究中最重要的工具之一。近年來也涌現(xiàn)出一些基于黃素單核苷酸(flavin mononucleotide, FMN)、藻藍(lán)膽素(phycocyanobilin)、膽綠素(biliverdin, BV)、膽紅素(bilirubin, BR)等配體結(jié)合的新型非典型熒光蛋白，如與BV結(jié)合后熒光增強(qiáng)的近紅外熒光蛋白(infrared-fluorescent proteins, IFP)系列[8～10]，與BR結(jié)合后產(chǎn)生非氧依賴性綠色熒光的UnaG[11]等。此外，基于蛋白質(zhì)標(biāo)簽和激活型熒光染料的類熒光蛋白如SNAP-tag[12]、Halo-tag[13]、Y-FAST-tag[14]也發(fā)展迅速，它們結(jié)合了蛋白質(zhì)可遺傳編碼以及小分子熒光染料在熒光亮度、光穩(wěn)定性等方面的優(yōu)勢(shì)，進(jìn)一步拓寬了遺傳編碼熒光標(biāo)記技術(shù)的應(yīng)用范圍。

與蛋白質(zhì)相比，細(xì)胞內(nèi)的RNA種類更多、功能更為復(fù)雜。發(fā)展可以對(duì)活細(xì)胞RNA特異標(biāo)記與成像的技術(shù)，將允許人們實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)RNA在活細(xì)胞中各種代謝行為，如生成、運(yùn)輸、翻譯、降解等，這是深入研究RNA功能機(jī)制極為有用的工具和所需要解決的重要技術(shù)挑戰(zhàn)。RNA研究領(lǐng)域也迫切需要類似于熒光蛋白這樣操作方便、簡單可行的活細(xì)胞RNA標(biāo)記技術(shù)。自然界中存在天然的熒光蛋白，但是人們尚未在自然界中發(fā)現(xiàn)天然存在的熒光RNA。受熒光蛋白和類熒光蛋白的啟發(fā)，研究者發(fā)展了熒光RNA(fluorescent RNA)技術(shù)，其工作原理為RNA適配體與熒光團(tuán)分子高特異性、高親和力結(jié)合，當(dāng)將RNA適配體與目標(biāo)RNA融合，在細(xì)胞中表達(dá)并加入熒光團(tuán)孵育，通過特定波長的光激發(fā)后發(fā)出明亮的熒光實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)RNA的成像。RNA適配體可以利用指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX)[15～17]篩選獲得。相比于傳統(tǒng)遺傳編碼的熒光蛋白-RNA結(jié)合蛋白技術(shù)，熒光RNA技術(shù)具有標(biāo)記更加直接、對(duì)靶標(biāo)RNA干擾小以及成像信噪比高的優(yōu)勢(shì)，將為人們理解活細(xì)胞中RNA的功能和作用提供實(shí)用工具。本文將對(duì)遺傳編碼的熒光RNA技術(shù)及基于熒光RNA的生物傳感技術(shù)進(jìn)行重點(diǎn)介紹，包括熒光RNA的發(fā)展歷程、在活細(xì)胞RNA成像及代謝物檢測(cè)方面的應(yīng)用，同時(shí)還將探討該技術(shù)未來的發(fā)展方向以及面臨的挑戰(zhàn)，以期為該技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展和在相關(guān)領(lǐng)域的應(yīng)用提供參考。

1 熒光RNA的發(fā)展歷程

熒光蛋白可在基因水平上進(jìn)行遺傳編碼，并在自身生化反應(yīng)機(jī)制下產(chǎn)生熒光。經(jīng)典的綠色熒光蛋白GFP由238個(gè)氨基酸組成，三個(gè)氨基酸殘基Ser65-Tyr66-Gly67自催化形成生色團(tuán)HBI，被包裹在由11個(gè)β折疊環(huán)繞而成的桶狀結(jié)構(gòu)中[18](圖1A)。此外，科學(xué)家們也發(fā)現(xiàn)含外源生色團(tuán)的熒光蛋白，如來源于鰻魚以膽紅素BR為生色團(tuán)的UnaG[11](圖 1B)等。無論是蛋白自身催化產(chǎn)生生色團(tuán)還是外源生色團(tuán)，它們本質(zhì)上都屬于分子轉(zhuǎn)子型熒光團(tuán)，被蛋白質(zhì)骨架固定住(經(jīng)高溫加熱或其他方式變性后的熒光蛋白不再具有熒光[19])，從而限制分子內(nèi)的電荷轉(zhuǎn)移，進(jìn)而產(chǎn)生熒光。因此，科學(xué)家們基于類似的原理，利用RNA適配體的結(jié)構(gòu)骨架來固定分子轉(zhuǎn)子型熒光團(tuán)，發(fā)展了系列熒光RNA (圖1, C～E)。

1.1 概念期的熒光RNA

2003年，因發(fā)展熒光蛋白技術(shù)而獲得諾貝爾獎(jiǎng)的錢永健教授，開發(fā)了首個(gè)基于小分子染料祖母綠(malachite green, MG)的“熒光團(tuán)-RNA適配體”復(fù)合物(圖2A)。他們對(duì)MG熒光團(tuán)進(jìn)行SELEX篩選，獲得了可以特異性結(jié)合MG的RNA適配體。MG是一種分子轉(zhuǎn)子型熒光團(tuán)，當(dāng)處于自由溶液中受激發(fā)時(shí)，獲得的能量主要通過圍繞結(jié)構(gòu)中的乙炔橋進(jìn)行類似于“呼啦圈旋轉(zhuǎn)”的運(yùn)動(dòng)方式非輻射衰減，所以其受激發(fā)時(shí)不會(huì)發(fā)出熒光。當(dāng)MG嵌合在RNA適配體形成的空間結(jié)構(gòu)中時(shí)，MG中的乙炔橋被固定，因而只能通過發(fā)出熒光輻射衰減。不過MG是一種三苯甲烷染料，熒光輻照后會(huì)產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species, ROS)自由基對(duì)細(xì)胞有明顯的毒性[20,21]，因此該復(fù)合物并不能應(yīng)用于活細(xì)胞研究。

一些研究者利用核酸染料進(jìn)行熒光RNA的開發(fā)，如基于Hoechst開發(fā)的II-mini3-4-Hoechst 1c藍(lán)色熒光RNA[22]、基于二甲基吲哚紅(dimethylindoline, DIR)開發(fā)的DIR-Apt1紅色熒光RNA[23]、DIR2s-Apt系列熒光RNA[24]等。由于核酸染料嵌入DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)后發(fā)出熒光，這導(dǎo)致該類熒光RNA存在很高的背景熒光，難以用于活細(xì)胞RNA的標(biāo)記與成像。另外，加拿大西蒙菲莎大學(xué)Peter J. Unrau課題組基于花菁類核酸染料噻唑橙(thiazole orange, TO)開發(fā)了Mango系列[25～27]和Peach[28]熒光RNA。TO1-Biotin熒光團(tuán)及衍生物由于分子量大，需要借助顯微注射等方式導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。此外，核酸染料還存在一定的致癌風(fēng)險(xiǎn)。因此，該類熒光RNA并不適用于活細(xì)胞RNA標(biāo)記。

熒光團(tuán)-猝滅基團(tuán)偶聯(lián)物也被用于發(fā)展熒光RNA，RNA適配體對(duì)偶聯(lián)物中熒光團(tuán)或猝滅基團(tuán)的特異性結(jié)合會(huì)解除猝滅基團(tuán)對(duì)熒光團(tuán)的猝滅作用，進(jìn)而使其恢復(fù)熒光(圖2B)?；谠撛O(shè)計(jì)思路，2011年，日本京都大學(xué)Motonari Uesugi課題組開發(fā)了基于BHQ1猝滅基團(tuán)的A1系列熒光RNA[29]。德國海德堡大學(xué)Andres J?schke課題組基于類似思路，陸續(xù)發(fā)展了DNB系列熒光RNA[30]、SRB-2-TMR-DN熒光RNA[31]和SR-DN-SRB-2熒光RNA[32]。2018年，美國科羅拉多大學(xué)Amy E. Palmer課題組報(bào)道了另一類基于鈷胺素(Cbl, 也稱維生素B12)核糖開關(guān)的Cbl系列熒光RNA[33]。2020年，法國斯特拉斯堡大學(xué)Michael Ryckelynck課題組基于熒光團(tuán)二聚反應(yīng)自猝滅的原理，開發(fā)了基于SRB二聚體染料Gemini-561的熒光RNA[34]。不過，該類型熒光團(tuán)配體由于分子量大，很難自由進(jìn)入細(xì)胞，如Cbl熒光團(tuán)需要借助微珠碾壓的方式破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)導(dǎo)入，因此該類型熒光RNA并不便于活細(xì)胞RNA研究。

圖1 熒光蛋白與熒光RNA晶體結(jié)構(gòu)

A：GFP熒光蛋白晶體結(jié)構(gòu)，氨基酸殘基Ser65-Tyr66-Gly67自催化形成生色團(tuán)HBI。B：UnaG熒光蛋白晶體結(jié)構(gòu)，膽紅素(bilirubin, BR)為生色團(tuán)。C：Spinach熒光RNA晶體結(jié)構(gòu)，DFHBI為熒光團(tuán)。D：Mango熒光RNA晶體結(jié)構(gòu)，TO1-Biotin為熒光團(tuán)。E：Pepper熒光RNA晶體結(jié)構(gòu)，HBC為熒光團(tuán)。晶體結(jié)構(gòu)示意圖來源于美國國家生物技術(shù)信息中心(national center for biotechnology information, NCBI)網(wǎng)站，PDB ID依次為4OGS、4I3B、4TS2、6C63和7SZU (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/icn3d)。

2011年，美國康奈爾大學(xué)Samie R. Jaffrey課題組以GFP生色團(tuán)HBI為基礎(chǔ)進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾獲得DMHBI熒光團(tuán)，并篩選優(yōu)化獲得Spinach適配體。Spinach-DFHBI熒光RNA在受激發(fā)時(shí)可發(fā)出綠色熒光[35]。這是第一例可以應(yīng)用于活細(xì)胞RNA成像的熒光RNA，后續(xù)的研究也表明其可應(yīng)用于不同類型的活細(xì)胞，包括細(xì)菌[36]、釀酒酵母[37,38]、哺乳動(dòng)物細(xì)胞[39]、衣藻葉綠體[40]中RNA的標(biāo)記與成像。隨后，他們對(duì)熒光團(tuán)優(yōu)化獲得DFHBI-1T[41]、DFHBI-2T[41]，對(duì)RNA適配體優(yōu)化獲得“超折疊”的Spinach2[42]、Broccoli[43]、dBroccoli[43]，提高了該類熒光RNA在活細(xì)胞中的熒光強(qiáng)度和穩(wěn)定性。此外，還有一些研究者完成對(duì)Spinach-DFHBI復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)的解析，并優(yōu)化得到結(jié)構(gòu)更為小巧的Baby Spinach RNA適配體[44]；或通過微流控輔助的隨機(jī)突變方法獲得離子依賴性更低的iSpinach RNA適配體[45,46]。2017年，Jaffrey課題組以紅色熒光蛋白生色團(tuán)DsRed為基礎(chǔ)開發(fā)了DFHO熒光團(tuán)，并篩選獲得二聚化的Corn-DFHO熒光RNA[47]。此后，他們優(yōu)化獲得Red Broccoli-OBI[48]，篩選獲得與DFHBI-1T和DFHO都能結(jié)合的Squash RNA適配體[49]，基于DFHO優(yōu)化獲得DFAME熒光團(tuán)并篩選獲得與Corn具有相似結(jié)構(gòu)的Beetroot[50]。2019年，德國維爾茨堡大學(xué)Claudia H?bartner課題組對(duì)HBI修飾獲得DMHBI- Imi、DMHBI+和DMHBO+，它們均可被類似于Spinach結(jié)構(gòu)的RNA適配體Chili結(jié)合并激活[51]產(chǎn)生大斯托克斯位移(large Stokes shift)熒光。該類熒光RNA的熒光團(tuán)分子量小、柔性大，因此具有跨膜容易、無細(xì)胞毒性、背景熒光低等優(yōu)點(diǎn)，但這種線性結(jié)構(gòu)的熒光團(tuán)很難被RNA適配體牢牢固定，導(dǎo)致它們與RNA適配體的親和力較低，需要使用高濃度的熒光團(tuán)才能實(shí)現(xiàn)有效標(biāo)記。更值得注意的是，這些熒光RNA的活細(xì)胞亮度較低，部分還會(huì)因發(fā)生快速光異構(gòu)化而具有較差的光穩(wěn)定性。上述這些不足大大限制了這類熒光RNA的廣泛應(yīng)用。

圖2 不同熒光RNA識(shí)別的熒光團(tuán)結(jié)構(gòu)及熒光RNA光譜信息

A：基于分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移原理。B：基于接觸-猝滅原理。C：基于螺環(huán)開-閉環(huán)原理。方框標(biāo)注“RNA適配體-熒光團(tuán)復(fù)合物”的最大激發(fā)波長和發(fā)射波長，單位nm。

此外，近些年還發(fā)展了一類基于螺環(huán)結(jié)構(gòu)開-閉環(huán)原理(spirolactonization)的熒光RNA(圖2C)。通過將開環(huán)-閉環(huán)的平衡態(tài)轉(zhuǎn)化為開環(huán)的熒光狀態(tài)，從而增加螺旋內(nèi)酯化硅羅丹明染料的熒光。德國海德堡大學(xué)Andres J?schke課題組以硅羅丹明SiR為熒光團(tuán)篩選優(yōu)化獲得了SiRA RNA適配體，并利用SiRA-SiR復(fù)合物實(shí)現(xiàn)中RNA的受激發(fā)射損耗(stimulated emission depletion microscopy, STED)超分辨成像[52]。此后，該課題組成員發(fā)展了光譜可調(diào)諧的BeCA-BC系列熒光RNA[53]。不過該類熒光RNA由于背景熒光較高，因此在應(yīng)用到高等生物細(xì)胞時(shí)仍然存在較大挑戰(zhàn)。

總體上看，基于核酸染料和熒光團(tuán)-猝滅基團(tuán)偶聯(lián)物的熒光RNA存在染料進(jìn)細(xì)胞困難、背景熒光高、明顯的細(xì)胞毒性等缺點(diǎn)，而基于熒光團(tuán)衍生物的熒光RNA存在親和力弱、細(xì)胞亮度低、穩(wěn)定性差、缺乏生物正交性和/或多聚體等不足，這些問題限制了概念期熒光RNA的應(yīng)用。

1.2 高性能實(shí)用熒光RNA

相比于蛋白質(zhì)，活細(xì)胞內(nèi)的RNA具有顯著縮短的半衰期(細(xì)菌中mRNA的平均半衰期只有2.5～ 8.0 min[54～56]，哺乳動(dòng)物細(xì)胞中mRNA的平均半衰期也只有2～10 h[57])，導(dǎo)致活細(xì)胞中RNA的豐度遠(yuǎn)低于蛋白質(zhì)，這就對(duì)RNA的標(biāo)記和成像工具提出了更高的要求。理想的熒光RNA應(yīng)該具備以下特點(diǎn)：(1) RNA適配體為單體且不含G-四鏈體。RNA的二聚化可能會(huì)改變目標(biāo)RNA的代謝，而RG4結(jié)構(gòu)可被活細(xì)胞解旋酶靶向[58]，導(dǎo)致RNA的解旋或降解；(2) 熒光團(tuán)具有背景熒光低、結(jié)合RNA適配體后熒光激活倍數(shù)高、進(jìn)細(xì)胞容易、細(xì)胞毒性低等特點(diǎn)；(3) RNA適配體在高等動(dòng)物細(xì)胞中能夠正確表達(dá)折疊，RNA適配體與熒光團(tuán)親和力強(qiáng)，產(chǎn)生明亮且穩(wěn)定的熒光，以滿足對(duì)目標(biāo)RNA的高亮度和長時(shí)間動(dòng)力學(xué)追蹤。熒光RNA只有在各方面的性能均取得突破性進(jìn)展后，才可能在活細(xì)胞內(nèi)對(duì)各類RNA進(jìn)行簡單方便的標(biāo)記與成像，實(shí)現(xiàn)熒光RNA技術(shù)的普遍應(yīng)用(表1)。

1.2.1 Pepper-HBC系列熒光RNA

2019年，本團(tuán)隊(duì)基于全新的分子設(shè)計(jì)理念開發(fā)了一類創(chuàng)新的HBC熒光團(tuán)分子，它們結(jié)構(gòu)簡單、分子量小，同時(shí)具有樹枝狀、剛性結(jié)構(gòu)，理論上會(huì)相對(duì)容易被RNA結(jié)合固定。HBC熒光團(tuán)在自由溶液中不發(fā)光，具備熒光蛋白生色團(tuán)無背景的優(yōu)勢(shì)。研究者基于HBC熒光團(tuán)篩選獲得與之高度特異結(jié)合的RNA適配體，對(duì)其優(yōu)化最終獲得長度為43 nt的Pepper RNA適配體；對(duì)HBC熒光團(tuán)進(jìn)行分子結(jié)構(gòu)上的光譜調(diào)諧，獲得光譜涵蓋青、綠、橙、紅等不同顏色的8種系列熒光RNA[59](因其具有多種顏色與辣椒類似，因此被命名為Pepper)。進(jìn)一步結(jié)果表明，Pepper以單體且非G-四鏈體的結(jié)構(gòu)形式、以納摩爾級(jí)的高親和力與熒光團(tuán)分子結(jié)合，且具有高溫度穩(wěn)定性、強(qiáng)pH耐受性，以及對(duì)外源序列融合插入的高度兼容性。Pepper的這些優(yōu)良性質(zhì)使得它在細(xì)胞中的熒光亮度、激活倍數(shù)比其他熒光RNA高出至少一個(gè)數(shù)量級(jí)，親和力與穩(wěn)定性高出兩到三個(gè)數(shù)量級(jí)。此外，研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)將多個(gè)Pepper以串聯(lián)方式融合，這種串聯(lián)體的單分子熒光強(qiáng)度會(huì)隨拷貝數(shù)的增加呈等比例上升，因此可將成像檢測(cè)靈敏度又提高一個(gè)數(shù)量級(jí)。Pepper系列熒光RNA的出現(xiàn)，應(yīng)該說是熒光RNA從概念到實(shí)用的一個(gè)突破。

表1 哺乳動(dòng)物細(xì)胞實(shí)用的熒光RNA

a光譜單位nm；b親和力單位nmol/L；c體外激活倍數(shù)；d體外亮度[量子產(chǎn)率×摩爾消光系數(shù)]并根據(jù)EGFP為100校正；e溫度穩(wěn)定性單位為℃；f指Pepper530 (485/530)；g指Pepper620 (577/620)；h指Clivia580 (524/580)；NA，not available，未獲得相應(yīng)數(shù)據(jù)。

Pepper應(yīng)用于活細(xì)胞RNA成像時(shí)，研究者可將Pepper融合到不同類型的RNA分子序列中，實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞中對(duì)目標(biāo)RNA的熒光標(biāo)記與示蹤。其中，Pepper不僅可被用于細(xì)胞中表達(dá)豐度較高的5S、7SK等非編碼RNA的活細(xì)胞成像(圖3A)，還可用于表達(dá)水平更低的mRNA的無背景成像(圖3B)，而不影響這些RNA的轉(zhuǎn)錄、定位、翻譯、降解等正常代謝。利用Pepper熒光RNA標(biāo)記活細(xì)胞中不同種類目標(biāo)RNA，與利用經(jīng)典的熒光原位雜交(fluorescencehybridization, FISH)技術(shù)標(biāo)記固定細(xì)胞中相同目標(biāo)RNA的結(jié)果一致，證明熒光RNA標(biāo)記技術(shù)的準(zhǔn)確性。得益于Pepper具有活細(xì)胞RNA無背景定量檢測(cè)的特性，研究團(tuán)隊(duì)在國際上首次利用Pepper對(duì)單細(xì)胞中mRNA的翻譯過程進(jìn)行了大規(guī)模定量研究。結(jié)果顯示癌細(xì)胞中mRNA量與其編碼蛋白質(zhì)量之間存在較低相關(guān)性，這表明癌細(xì)胞的翻譯調(diào)控顯著失調(diào)，這為癌癥的診療提供一種全新的思路。此外，Pepper還可與CRISPR技術(shù)結(jié)合起來，通過sgRNA展示的方法利用Pepper對(duì)基因組特定位點(diǎn)進(jìn)行活細(xì)胞成像。由于Pepper與熒光團(tuán)分子非共價(jià)結(jié)合，因此可以通過加入不同熒光團(tuán)的方法，靈活改變細(xì)胞內(nèi)熒光RNA的顏色，對(duì)于多色熒光標(biāo)記穩(wěn)定細(xì)胞株和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的構(gòu)建十分有利。得益于良好的光穩(wěn)定性，Pepper620熒光RNA首次實(shí)現(xiàn)了紅色熒光RNA用于活細(xì)胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)光照明(structure illumination microscopy, SIM)超分辨成像，成像分辨率顯著提高。Pepper系列熒光RNA為活細(xì)胞中研究目標(biāo)RNA的功能提供了極具價(jià)值的工具。

1.2.2 Broccoli-BI系列熒光RNA

2020年，美國康奈爾大學(xué)Samie R. Jaffrey課題組在DFHBI-1T基礎(chǔ)上優(yōu)化獲得BI[60]、TBI[61]等熒光團(tuán)，大幅度提高了該類熒光RNA在活細(xì)胞中的光穩(wěn)定性和亮度。他們利用優(yōu)化的Broccoli-BI熒光RNA實(shí)現(xiàn)了活細(xì)胞中的單分子成像[60]。不過，Broccoli適配體結(jié)構(gòu)中含有G-四鏈體。而且，受限于熒光蛋白生色團(tuán)固有的特點(diǎn)，該類熒光RNA在活細(xì)胞中仍然存在熒光猝滅的現(xiàn)象，光穩(wěn)定性和熒光強(qiáng)度仍有待提升。

圖3 利用Pepper熒光RNA實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞中不同RNA的熒光成像

A：利用Pepper530標(biāo)記活細(xì)胞內(nèi)各類小核RNA。B：利用Pepper530標(biāo)記活細(xì)胞內(nèi)各類mRNA。標(biāo)尺：10 μm。根據(jù)文獻(xiàn)[59]修改繪制。

1.2.3 SiR系列熒光RNA

隨著近幾年的發(fā)展，SiR系列熒光RNA通過RNA適配體優(yōu)化、二聚化、熒光團(tuán)螺旋內(nèi)酯化等技術(shù)手段，逐步降低熒光團(tuán)的高背景熒光。所開發(fā)的熒光RNA在活細(xì)胞中表達(dá)后熒光強(qiáng)度高、光穩(wěn)定性好，可實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞RNA超分辨成像、單分子成像，進(jìn)一步豐富了熒光RNA工具箱。2021年，德國海德堡大學(xué)Andres J?schke課題組優(yōu)化獲得RhoBAST- TMR-DN熒光RNA，具有快速光轉(zhuǎn)換性質(zhì)，可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞中RNA的單分子定位(single-molecule localization microscopy, SMLM)超分辨成像。然而，TMR-DN與RhoBAST親和力低且結(jié)合后熒光激活倍數(shù)偏低，導(dǎo)致成像信噪比較低[62]。2023年，他們發(fā)展了二聚化的biSiRA-SiR2和biRhoBAST-TMR2[63]，它們的親和力顯著提升達(dá)到皮摩爾級(jí)。研究者利用8個(gè)biRhoBAST重復(fù)串聯(lián)序列，實(shí)現(xiàn)對(duì)活細(xì)胞中單分子水平的mRNA成像[63]。同年，該課題組成員改造得到SpyRho (spirocyclic rhodamine, 螺旋環(huán)羅丹明)熒光團(tuán)，RhoBAST-SpyRho熒光RNA可實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞中RNA的SMLM和STED超分辨成像[64]。然而，這類熒光團(tuán)的分子量相對(duì)較大，顯著影響了其進(jìn)細(xì)胞的速度。此外，這些熒光團(tuán)會(huì)被細(xì)胞內(nèi)源組分非特異性結(jié)合并激活，進(jìn)而產(chǎn)生較高的背景熒光。

1.2.4 Clivia-NBSI系列熒光RNA

在大斯托克斯位移(large Stokes shift)熒光RNA開發(fā)方面，2023年，本團(tuán)隊(duì)在原創(chuàng)的分子轉(zhuǎn)子型熒光團(tuán)的骨架結(jié)構(gòu)上，引入更多的轉(zhuǎn)動(dòng)位點(diǎn)獲得NBSI熒光團(tuán)，使得其發(fā)射光譜大幅度紅移，斯托克斯位移顯著增加。研究團(tuán)隊(duì)基于NBSI熒光團(tuán)篩選獲得與之高度特異結(jié)合的RNA適配體，對(duì)其優(yōu)化獲得長度為30 nt的Clivia RNA適配體[65]。Clivia以納摩爾級(jí)的高親和力結(jié)合不發(fā)光的NBSI，激活產(chǎn)生高亮度橙色熒光(因其光譜與君子蘭類似，因此被命名為Clivia)。同時(shí)，Clivia結(jié)構(gòu)中不含G-四鏈體，對(duì)Mg2+的依賴性極低。研究團(tuán)隊(duì)通過對(duì)NBSI熒光團(tuán)進(jìn)行分子結(jié)構(gòu)上的光譜調(diào)諧獲得光譜從黃、橙到紅的14種Clivia系列熒光RNA，這些熒光RNA的斯托克斯位移最大可達(dá)108 nm，高出傳統(tǒng)熒光染料至少4倍。與此前報(bào)道的唯一大斯托克斯位移熒光RNA Chili相比，Clivia的活細(xì)胞成像亮度高出1～2個(gè)數(shù)量級(jí)，體現(xiàn)了大斯托克斯位移熒光RNA從概念到實(shí)用的突破。

基于Clivia獨(dú)特的光譜特性，研究者結(jié)合Clivia和Pepper兩種熒光RNA，首次實(shí)現(xiàn)了活細(xì)胞RNA和基因位點(diǎn)的“單激發(fā)-雙發(fā)射”雙色熒光成像。與此前基于CRISPR-dCas (clustered regularly interspaced short palindromic repeats, 成簇規(guī)則間隔短回文重復(fù)序列)(dead Cas, 失活的Cas蛋白)和MS2-MCP(MS2 coating protein，MS2衣殼蛋白)的基因位點(diǎn)標(biāo)記方法相比，基于熒光RNA的方法更加直接和簡單高效。通過嵌合sgRNA的顏色組合，該方法還可以實(shí)現(xiàn)不同染色體上三個(gè)基因位點(diǎn)的同時(shí)標(biāo)記與成像。研究者利用該系統(tǒng)首次在活細(xì)胞水平直接對(duì)染色體兩端的端粒序列拷貝數(shù)進(jìn)行測(cè)定。得益于Clivia的小巧結(jié)構(gòu)，研究者將Clivia插入到多種小核RNA序列中，實(shí)現(xiàn)這些小核RNA的高信噪比原位實(shí)時(shí)標(biāo)記與動(dòng)態(tài)成像，而不影響它們本身的定位與功能?；诖?，研究者利用Clivia標(biāo)記的U1小核RNA對(duì)細(xì)胞應(yīng)激情況下U-小體的形成過程進(jìn)行了實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。

此外，由于Clivia574的激發(fā)光譜和NLuc熒光素酶(NanoLuc luciferase)的發(fā)射光譜接近(圖4A)，研究者還將Clivia與NLuc結(jié)合起來，開發(fā)了基于生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移(bioluminescence resonance energy transfer, BRET)的RNA-蛋白質(zhì)相互作用檢測(cè)技術(shù)。研究者將MS2發(fā)夾RNA插入到Clivia的環(huán)區(qū)，由于MS2與二聚化的MCP結(jié)合從而帶動(dòng)Clivia靠近NLuc(圖4B)。通過設(shè)計(jì)NLuc和ddMCP (directed dimer MCP)連接處的氨基酸序列，以及Clivia和MS2連接處的堿基序列，優(yōu)化后的系統(tǒng)其BRET效率超過90% (圖4C)，可實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞中對(duì)MS2和MCP相互作用的BRET成像檢測(cè)(圖4D)。研究者進(jìn)一步構(gòu)建工程化的HEK293T細(xì)胞，并移植到小鼠體內(nèi)(圖4E)，實(shí)現(xiàn)了活體水平的MS2和MCP相互作用的BRET成像檢測(cè)(圖4F)。此外，該系統(tǒng)不僅可以檢測(cè)RNA與蛋白質(zhì)是否發(fā)生相互作用，還可以檢測(cè)相互作用的強(qiáng)弱。研究團(tuán)隊(duì)利用該系統(tǒng)檢測(cè)了多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)源RNA-蛋白質(zhì)間的相互作用，為解析活細(xì)胞中RNA-蛋白質(zhì)的相互作用提供了極具價(jià)值的實(shí)用工具。

圖4 基于Clivia熒光RNA的生物發(fā)光成像技術(shù)檢測(cè)RNA-蛋白相互作用

A：NLuc的發(fā)射光譜和Clivia574的激發(fā)和發(fā)射光譜。B：BRET融合蛋白與Clivia-MS2報(bào)告RNA結(jié)合模型示意圖。C：表達(dá)Clivia和NLuc的HEK293T細(xì)胞與熒光團(tuán)和底物孵育后的發(fā)射光譜。D：對(duì)圖C成像結(jié)果，標(biāo)尺：10 μm。E：表達(dá)Clivia和NLuc的移植小鼠皮下組織示意圖。F：對(duì)圖E成像結(jié)果。根據(jù)文獻(xiàn)[65]修改繪制。

大斯托克斯位移熒光蛋白已被廣泛應(yīng)用于活細(xì)胞與活體蛋白質(zhì)的多色熒光標(biāo)記與成像，而Clivia則代表了大斯托克斯位移熒光RNA的原創(chuàng)性突破。Clivia具有高穩(wěn)定性、高信噪比、高亮度等性質(zhì)，是目前唯一可用于活細(xì)胞分析的大斯托克斯位移熒光RNA，也是唯一可在活體上對(duì)RNA動(dòng)態(tài)進(jìn)行測(cè)量的熒光RNA。Clivia系列熒光RNA為實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞多個(gè)RNA的單激發(fā)多發(fā)射多色成像，活細(xì)胞中RNA與蛋白相互作用的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，以及在時(shí)間和空間尺度深入探究RNA功能和相互作用、RNA功能與調(diào)控機(jī)制研究提供極具價(jià)值的創(chuàng)新研究工具，也有望為活細(xì)胞與活體生物傳感、即時(shí)診斷甚至實(shí)時(shí)診斷技術(shù)的發(fā)展提供新機(jī)遇。

1.3 基于熒光RNA的活細(xì)胞內(nèi)源性RNA標(biāo)記

熒光RNA不僅可用于活細(xì)胞中外源RNA的標(biāo)記與成像，還可檢測(cè)內(nèi)源RNA，包括miRNA[66]、mRNA[67,68]等。利用堿基互補(bǔ)配對(duì)原理對(duì)目標(biāo)RNA直接雜交是最簡單易行的方法，可實(shí)現(xiàn)對(duì)活細(xì)胞中內(nèi)源性RNA的標(biāo)記和成像(圖5A)。2022年，武漢大學(xué)周翔課題組基于本團(tuán)隊(duì)開發(fā)的Pepper熒光RNA，實(shí)現(xiàn)對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中內(nèi)源性β-肌動(dòng)蛋白mRNA的標(biāo)記，以及對(duì)mRNA所產(chǎn)生應(yīng)激顆粒的檢測(cè)與成像[68]。

圖5 基于熒光RNA的活細(xì)胞內(nèi)源性RNA標(biāo)記原理示意圖

A：基于堿基互補(bǔ)配對(duì)原理。B：基于雙分子熒光互補(bǔ)原理。C：基于鏈置換原理。

研究者還可將RNA適配體進(jìn)行“Split”裂解設(shè)計(jì)，開發(fā)類似于熒光蛋白中的雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)，進(jìn)一步降低熒光RNA在未結(jié)合目標(biāo)時(shí)產(chǎn)生的本底熒光，實(shí)現(xiàn)對(duì)活細(xì)胞中內(nèi)源RNA的高信噪比成像 (圖5B)。2018年，中國科學(xué)院上海應(yīng)用物理研究所樊春海課題組發(fā)展了基于熒光RNA的適配體啟動(dòng)熒光互補(bǔ)(aptamer-initiated fluorescence complemen-tation, AiFC)方法，實(shí)現(xiàn)HeLa細(xì)胞中β-肌動(dòng)蛋白mRNA高對(duì)比度的實(shí)時(shí)成像[69]。美國馬薩諸塞大學(xué)尤明旭課題組發(fā)展了基于熒光RNA的基因編碼的催化發(fā)夾組裝RNA回路(catalytic hairpin assembly RNA circuit that is genetically encoded, CHARGE)系統(tǒng)[70]和遺傳雜交擴(kuò)增技術(shù)(genetic hybridi-zation amplification technique, INSIGHT)[71]，實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞中各種目標(biāo)RNA的定位成像。此類生物傳感器還可用于活細(xì)胞內(nèi)相互作用的研究，如在活細(xì)胞中對(duì)RNA自組裝過程及siRNA干擾過程監(jiān)測(cè)[72]、對(duì)病毒自組裝過程監(jiān)測(cè)[73]、對(duì)內(nèi)含子自剪接過程監(jiān)測(cè)[74]、對(duì)核糖體構(gòu)象變化和下游基因?qū)崟r(shí)翻譯監(jiān)測(cè)[75]、對(duì)RNA共轉(zhuǎn)錄折疊、RNA-納米粒復(fù)合物形成過程監(jiān)測(cè)[76]等。

此外，研究者還可以基于鏈置換原理發(fā)展內(nèi)源RNA標(biāo)記技術(shù)，在RNA適配體的核心結(jié)構(gòu)中添加與目標(biāo)RNA互補(bǔ)的序列，通過結(jié)合目標(biāo)RNA改變RNA適配體的二級(jí)結(jié)構(gòu)，即形成熒光團(tuán)的結(jié)合口袋實(shí)現(xiàn)熒光激活，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)活細(xì)胞內(nèi)源RNA的檢測(cè)(圖5C)。2017年，湖南大學(xué)蔣健暉課題組利用熒光RNA實(shí)現(xiàn)在多種腫瘤活細(xì)胞中對(duì)癌癥生物標(biāo)志物miR-21的成像檢測(cè)[77]。同年，美國密蘇里大學(xué)Blake C. Meyers課題組利用同樣原理開發(fā)出FASTmiR，實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞中對(duì)miR-122水平差異的定量檢測(cè)[78]。

2 基于熒光RNA的生物傳感技術(shù)

熒光蛋白技術(shù)為活細(xì)胞蛋白質(zhì)成像帶來了革命性突破。研究者基于熒光蛋白發(fā)展了多種遺傳編碼的熒光探針[79,80](圖6A)，包括本團(tuán)隊(duì)開發(fā)的Frex[81]、SoNar[82]、iNap[83]、FiNad[84]、FiLa[85]等，實(shí)現(xiàn)了對(duì)體外、細(xì)胞甚至活體內(nèi)多種代謝物及生物過程的實(shí)時(shí)原位監(jiān)測(cè)與成像。不過，由于多數(shù)靶標(biāo)缺乏對(duì)應(yīng)的結(jié)合蛋白，研究者難以構(gòu)建基于熒光蛋白的生物傳感器。此外，該類傳感器還可能存在信噪比低的問題，限制了它們的應(yīng)用。

圖6 基于熒光蛋白和熒光RNA的生物傳感器示意圖

A：基于熒光蛋白的生物傳感器示意圖。示意圖中為環(huán)化重排熒光蛋白(cyclic rearrangement of fluorescent proteins, cpFP)和青霉素結(jié)合蛋白(penicillin binding proteins, PBPs)。B：基于熒光RNA的生物傳感器示意圖。

在過去十余年的發(fā)展中，熒光RNA技術(shù)使得活細(xì)胞內(nèi)相關(guān)生物過程的監(jiān)測(cè)變得更加簡單可行(圖6B)。相較于基于熒光蛋白的生物傳感器，基于熒光RNA的生物傳感器理論上更容易被設(shè)計(jì)和構(gòu)建，且具有更大的動(dòng)態(tài)檢測(cè)范圍。除熒光RNA技術(shù)本身的RNA適配體組分可遺傳編碼、熒光團(tuán)組分靈活多樣、信噪比高、熒光信號(hào)生成速度快等優(yōu)勢(shì)外，研究者可通過SELEX技術(shù)篩選獲得與目標(biāo)分子結(jié)合的“變構(gòu)RNA”，將熒光RNA的RNA適配體核心區(qū)域外的莖環(huán)結(jié)構(gòu)替換成變構(gòu)RNA。當(dāng)檢測(cè)體系中目標(biāo)分子不存在時(shí)，RNA適配體呈現(xiàn)松散結(jié)構(gòu)不能結(jié)合熒光團(tuán)，不產(chǎn)生熒光；目標(biāo)分子存在時(shí)可誘導(dǎo)變構(gòu)RNA識(shí)別靶標(biāo)并形成結(jié)合口袋，從而傳感到RNA適配體正確折疊形成結(jié)合熒光團(tuán)的結(jié)構(gòu)，激活熒光團(tuán)發(fā)出熒光，從而實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞代謝物小分子等的生物傳感與檢測(cè)。

自熒光RNA技術(shù)問世以來，多個(gè)團(tuán)隊(duì)不斷發(fā)展了基于熒光RNA的生物傳感技術(shù)。研究者將變構(gòu)RNA分別替換為識(shí)別S-腺苷甲硫氨酸(s-adenosine methionine, SAM)和腺苷-5′-二磷酸(adenosine 5′-diphosphate, ADP)的RNA適配體，開發(fā)出SAM探針和ADP探針[86]。基于類似原理，基于熒光RNA的MS2衣殼蛋白(MS2 coating protein, MCP)探針[86]、硫胺素焦磷酸(thiamine 5′-pyrophosphate, TPP)探針[87]、環(huán)二鳥苷酸(cyclic diguanylate monophosphate, c-di-GMP)探針[88]、環(huán)鳥苷酸-腺苷酸(cyclic AMP- GMP, c-GMP-AMP)探針[88]、環(huán)二腺苷酸(cyclic diadenosine monophosphate, c-di-AMP)探針[89]、S-腺苷-L-高半胱氨酸(s-adenosyl-l-homocysteine, SAH)探針[90]等陸續(xù)被報(bào)道。此外，多個(gè)團(tuán)隊(duì)繼續(xù)優(yōu)化探針，通過添加腳手架發(fā)展更為穩(wěn)定的SAM探針[91]，更換熒光RNA發(fā)展紅色SAM探針[48]等。其中，比率型探針由兩種不同波段的熒光RNA以及變構(gòu)RNA組成，其具備自校準(zhǔn)功能可最大限度減少轉(zhuǎn)染和表達(dá)效率的差異，實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞中對(duì)目標(biāo)RNA的定量成像。多個(gè)團(tuán)隊(duì)也陸續(xù)發(fā)展了SAM比率型探針[49]、miRNA比率型探針[77]、mRNA比率型探針[92]、四環(huán)素及c-di-GMP比率型探針[93,94]等。不過由于早期的熒光RNA性質(zhì)并不穩(wěn)定，在活細(xì)胞中表達(dá)時(shí)熒光弱、光穩(wěn)定性差，因此基于這些概念期的熒光RNA而開發(fā)的生物傳感器性能并不出眾，并且很多較難應(yīng)用于活細(xì)胞中。

2023年，本團(tuán)隊(duì)發(fā)展了基于Pepper的系列可特異性識(shí)別不同小分子代謝物與蛋白質(zhì)的遺傳編碼熒光探針[95]。研究者設(shè)計(jì)了不同堿基組成和數(shù)量的SAM適配體與Pepper連接處的傳導(dǎo)模塊(圖7A)，獲得的Pepper-SAM探針可實(shí)現(xiàn)藥物刺激下活細(xì)胞中SAM水平動(dòng)態(tài)變化的實(shí)時(shí)標(biāo)記與成像(圖7, B和C)。此外，研究者還設(shè)計(jì)構(gòu)建了Pepper-MCP探針，其可實(shí)現(xiàn)光遺傳學(xué)技術(shù)操縱的蛋白質(zhì)易位的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。得益于Pepper熒光RNA優(yōu)異的性質(zhì)，基于Pepper熒光RNA構(gòu)建的探針在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中顯示出更高的折疊效率和細(xì)胞亮度，并且不同顏色的探針具有良好的適配性，能夠與其他成像工具進(jìn)行組合使用，為生命科學(xué)基礎(chǔ)研究提供實(shí)用的工具。此外，中國科學(xué)院北京生命科學(xué)研究院李幸課題組于同年也基于Pepper熒光RNA開發(fā)出系列生物傳感器[96]。受益于Pepper在活細(xì)胞中的優(yōu)異表現(xiàn)，這些基于Pepper熒光RNA的生物傳感器實(shí)現(xiàn)了對(duì)活細(xì)胞中代謝物、外源藥物、蛋白與金屬離子等靶標(biāo)的監(jiān)測(cè)，展現(xiàn)出高通量、高內(nèi)涵藥物篩選的潛力。

3 結(jié)語與展望

RNA最初作為生物體遺傳信息傳遞的中間體而被人們熟知。然而，近年來的研究表明，RNA種類繁多，功能復(fù)雜，廣泛參與生命過程的各個(gè)階段，包括感知細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)、控制基因表達(dá)等。活細(xì)胞中的RNA具有高度的時(shí)空動(dòng)態(tài)特性，而時(shí)空分布的異常往往會(huì)引起多種疾病的發(fā)生與發(fā)展。因此，發(fā)展可以對(duì)活細(xì)胞內(nèi)RNA進(jìn)行原位實(shí)時(shí)標(biāo)記與成像的技術(shù)將會(huì)極大促進(jìn)人們對(duì)RNA功能與調(diào)控機(jī)制的解析。熒光RNA技術(shù)在過去的十余年發(fā)展迅猛。憑借適配體組分可遺傳編碼、更快的熒光信號(hào)生成速率、更優(yōu)異的光學(xué)性質(zhì)、對(duì)目標(biāo)RNA更小的干擾，熒光RNA技術(shù)為活細(xì)胞RNA標(biāo)記成像提供極具價(jià)值的實(shí)用工具。此外，基于熒光RNA的生物傳感技術(shù)，在保留熒光RNA上述優(yōu)勢(shì)外，還可應(yīng)用于活細(xì)胞中小分子代謝物以及蛋白質(zhì)等靶標(biāo)的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。但是目前的熒光RNA技術(shù)仍然存在篩選技術(shù)落后、具有高穩(wěn)定性與高熒光強(qiáng)度的熒光RNA偏少、光譜范圍無法涵蓋到近紅外波段、以及應(yīng)用范圍較窄等不足。本文針對(duì)這些不足提出以下展望。

圖7 利用Pepper-SAM-C14U探針實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞內(nèi)源性SAM的動(dòng)力學(xué)檢測(cè)

A：SAM探針設(shè)計(jì)原理及其對(duì)SAM的響應(yīng)。B：SAM探針對(duì)活細(xì)胞內(nèi)SAM濃度變化的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)與成像。標(biāo)尺：10 μm。C：對(duì)圖B中細(xì)胞熒光信號(hào)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。根據(jù)文獻(xiàn)[95]修改繪制。

首先，更加高效的熒光RNA篩選方法的開發(fā)。相較于傳統(tǒng)僅依靠SELEX技術(shù)篩選獲得的熒光RNA，Broccoli-DFHBI[43]、Mango II/III/IV-TO1- Biotin[27]分別借助流式分選與SELEX技術(shù)、微流控與SELEX技術(shù)篩選獲得，性質(zhì)有一定的提升。2023年，美國哥倫比亞大學(xué)Milan N. Stojanovic課題組發(fā)展了一種官能團(tuán)引導(dǎo)的小分子適配體篩選方法，該方法還可用于計(jì)算機(jī)輔助適配體設(shè)計(jì)的機(jī)器學(xué)習(xí)[97]從而提升篩選效率。同年，美國賓夕法尼亞州立大學(xué)王勇課題組改善了篩選介質(zhì)，報(bào)道了一種以三維大孔聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)水凝膠作為適配體篩選基質(zhì)的方法，可顯著縮短篩選周期從而提高篩選效率[98]。

其次，熒光RNA穩(wěn)定性和熒光強(qiáng)度的進(jìn)一步提高。由于細(xì)胞中核酸酶對(duì)RNA的水解作用，以及部分熒光團(tuán)膜通透性差、RNA適配體缺乏良好的折疊能力、復(fù)合物親和能力低等問題，目前能真正應(yīng)用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞RNA標(biāo)記與成像的熒光RNA種類和數(shù)量仍很少。研究者采取了多種方式，如優(yōu)化折疊效率更高的RNA適配體獲得Spinach2[42]、通過定向SELEX篩選RNA獲得Broccoli[43]、通過官能團(tuán)的修飾改善熒光團(tuán)性能獲得BI[60]和TBI[61]、使用類似天然核糖開關(guān)結(jié)構(gòu)的RNA文庫進(jìn)行SELEX篩選獲得Squash[49]、使用F30[93,99]或tRNA[100]支架作為側(cè)翼序列表達(dá)RNA、在活細(xì)胞中表達(dá)環(huán)狀的RNA適配體[101]以及構(gòu)建以二價(jià)方式結(jié)合的熒光RNA[63]等方法提高熒光RNA在活細(xì)胞中的穩(wěn)定性、折疊效率、表達(dá)豐度以及熒光強(qiáng)度等性能。

最后，熒光RNA技術(shù)應(yīng)用范圍的拓寬。進(jìn)一步發(fā)展基于熒光RNA的多色成像技術(shù)、超分辨成像技術(shù)、單分子RNA成像技術(shù)、活體RNA成像技術(shù)等。目前具有生物正交性的活細(xì)胞實(shí)用熒光RNA數(shù)量仍然十分有限，已報(bào)道的Pepper497可與Clivia系列聯(lián)合使用，Pepper530可與Clivia618、RhoBAST- TMR-DN或RhoBAST-SpyRho聯(lián)合使用，Pepper620可與Broccoli-BI聯(lián)合使用。研究者需要開發(fā)熒光團(tuán)種類更為豐富、RNA適配體與熒光團(tuán)之間親和力更強(qiáng)、且具有良好生物正交性的新型熒光RNA，以實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞中對(duì)多種目標(biāo)RNA的多色成像；發(fā)展熒光強(qiáng)度高、光穩(wěn)定性好的熒光RNA實(shí)現(xiàn)超分辨成像，以揭示活細(xì)胞RNA中更為精細(xì)的空間結(jié)構(gòu)；發(fā)展基于熒光RNA的單分子RNA成像技術(shù)，該技術(shù)可以避免傳統(tǒng)的熒光蛋白-RNA結(jié)合蛋白技術(shù)中過大的熒光標(biāo)簽對(duì)目標(biāo)RNA代謝與功能產(chǎn)生的潛在干擾；發(fā)展具有近紅外光譜的熒光RNA，實(shí)現(xiàn)哺乳動(dòng)物深層組織、甚至是活體中目標(biāo)RNA的可視化。

綜上所述，熒光RNA及其生物傳感技術(shù)已經(jīng)讓人們對(duì)多種RNA的生物學(xué)功能和動(dòng)態(tài)變化規(guī)律有了更加深入的了解。隨著這些技術(shù)的不斷發(fā)展，未來它們將繼續(xù)為探究RNA更為復(fù)雜的功能與調(diào)控機(jī)制提供極具價(jià)值且不可或缺的工具。

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Progress on fluorescent RNA and fluorescent RNA-based biosensing technology

Fangting Zuo1,2,3, Yaqiang Zhang1,2,3, Huimin Yang1,2, Yi Yang1,2, Xianjun Chen1,2

Fluorescent RNA is a kind of emerging RNA labeling technique that can be used forlabeling and imaging of RNA in live cells, which plays an important role in understanding the function and regulation mechanism of RNA. Biosensing technology based on fluorescent RNA can be applied in dynamic detection of small molecule metabolites and proteins in real time, offering valuable tools for basic life science research and biomedical sensing technology development. In this review, we introduce the development of genetically encoded fluorescent RNA, and the application of fluorescent RNA in RNA imaging and biosensing technology based on fluorescent RNA in biosensing in live cell. Meanwhile, we discuss the direction and challenge of future development of fluorescent RNA technology to provide valuable insights for further development and application of this technology in relevant fields.

fluorescent RNA; fluorescent labeling; RNA imaging; biosensing

楊弋，教授，博士生導(dǎo)師，長江學(xué)者特聘教授，國家杰出青年基金獲得者，國家自然科學(xué)基金創(chuàng)新群體負(fù)責(zé)人，國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃首席科學(xué)家?，F(xiàn)任生物反應(yīng)器工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室副主任，華東理工大學(xué)光遺傳學(xué)與合成生物學(xué)交叉學(xué)科研究中心主任，中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)會(huì)常務(wù)理事及酶學(xué)分會(huì)副主任、秘書長，中國生物物理學(xué)會(huì)理事。主要研究方向?yàn)楣膺z傳控制方法、細(xì)胞代謝監(jiān)控方法和生物大分子標(biāo)記方法。系列前沿方法學(xué)研究成果發(fā)表于等國際重要期刊，已被國內(nèi)外實(shí)驗(yàn)室廣泛應(yīng)用。

陳顯軍，教授，博士生導(dǎo)師，國家高層次青年人才。研究方向主要為新型光遺傳學(xué)技術(shù)的開發(fā)與應(yīng)用和生物大分子熒光標(biāo)記技術(shù)開發(fā)與應(yīng)用，近年來聚焦活細(xì)胞RNA實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)與時(shí)空精確調(diào)控的方法學(xué)關(guān)鍵難題，創(chuàng)新發(fā)展了系列高性能熒光RNA與RNA代謝光控因子，實(shí)現(xiàn)了活細(xì)胞RNA高時(shí)空分辨成像與精密控制。相關(guān)研究成果以第一或通訊作者發(fā)表在等國際重要期刊，授權(quán)多項(xiàng)國內(nèi)外發(fā)明專利。研究成果在國際同行中產(chǎn)生重要影響，所發(fā)展技術(shù)被300余個(gè)國內(nèi)外一流機(jī)構(gòu)實(shí)驗(yàn)室跟蹤應(yīng)用。主持包括十余項(xiàng)國家與省部級(jí)基金項(xiàng)目。

2023-12-12;

2024-01-25;

2024-01-29

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目 (編號(hào): 32121005, 32150028, 21937004, 91857202, 32250009)和國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(編號(hào): 2022YFC3400100)資助 [Supported by the National Natural Science Foundation of China (Nos. 32121005, 32150028, 21937004, 91857202, 32250009) and the National Key Research and Development Program of China (No. 2022YFC3400100)]

左方婷，博士后，研究方向：熒光RNA技術(shù)的開發(fā)與應(yīng)用。E-mail: ftzuo@ecust.edu.cn

楊弋，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：生命成像與調(diào)控。E-mail: yiyang@ecust.edu.cn

陳顯軍，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：活細(xì)胞RNA成像與調(diào)控。E-mail: xianjunchen@ecust.edu.cn

10.16288/j.yczz.23-306

(責(zé)任編委: 史岸冰)