死后人體組織中15種金屬元素的電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)法檢測及其結(jié)果分析

劉興勝 王愛華 于忠山 常 靖 李永剛 李 洋 劉 耀

(1.中國人民公安大學 偵查學院,北京 100038;2.吉林警察學院,長春 130117;3.公安部鑒定中心,北京 100038)

金屬元素在人體內(nèi)含量很少,但它們在生命過程中起著非常重要的作用,是人體保持健康生命活動的必需成分。與此同時,過量攝入金屬元素能夠不同程度地引起人體生理活動的異常,造成中毒或死亡的結(jié)果[1]。金屬單質(zhì)及化合物廣泛存在于自然環(huán)境中[2],與人類生產(chǎn)、生活關系密切,許多有毒金屬化合物無色無臭,中毒癥狀與疾病易混淆,常被不法分子用于投毒犯罪活動,涉及金屬元素中毒的案事件時有發(fā)生[3]。在法醫(yī)金屬毒物中毒死亡案件檢測中,常見的檢材主要包括肝臟、腎臟、肺、腦等人體組織,通常采用檢測其金屬元素總量來實現(xiàn)。正常人體組織中可檢測到超過20種以上金屬元素,其中包括含量較高且為人體所必需的鎂、鈣、鐵、銅、鋅等元素,也包括鉻、錳、鍶、鋇等微量元素[4],因此,分析體內(nèi)金屬元素正常含量,對于金屬毒物檢測、區(qū)別金屬在人體中的正常含量與中毒含量具有重要意義。由于死后人體組織中金屬元素含量基礎數(shù)據(jù)缺失,無法將檢測結(jié)果與體內(nèi)正常含量做對比,導致在金屬元素中毒結(jié)果認定上缺少科學參考和合理依據(jù)。

近年來,電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICP-MS)因其具備檢出限低、準確度高、能夠同時檢測多種元素的優(yōu)點,已經(jīng)在生物樣品分析中廣泛應用[5-7]。GONG等[8]采用ICP-MS檢測武漢地區(qū)孕婦和非孕婦全血中12種金屬元素含量,發(fā)現(xiàn)9種元素在孕婦和非孕婦之間含量有差異性,7對元素之間顯著相關。S?DERBERG等[9]采用ICP-MS對120例自殺上吊死亡患者的股骨血和尿進行分析,獲得了68種元素的描述性統(tǒng)計數(shù)據(jù),為死后人體元素濃度評價提供參考。而利用ICP-MS對死后人體組織中金屬元素分析評價較少。本研究以非元素中毒者的死后人體組織為研究對象,采用微波消解-電感耦合等離子體質(zhì)譜法分析測定鎂、鋁、鈣、鉻、錳、鐵、銅、鋅、砷、鍶、鎘、鋇、汞、鉈、鉛等15種元素,獲得元素含量基礎數(shù)據(jù),通過相關性分析與主成分分析,研究死后人體組織中金屬元素含量之間的差異,分析其相關性,對元素含量做綜合評價,為法醫(yī)金屬毒物分析和中毒認定提供重要參考。

1 實驗部分

1.1 試劑與材料

65%濃硝酸、30%過氧化氫,ICP-MS調(diào)諧溶液,1.0 mg/mL標準溶液,以上供儀器分析使用的試劑均為優(yōu)級純,實驗用水由Milli-Q系統(tǒng)(Millipore,美國)制備,符合GB/T 6682中一級水規(guī)定。死后人體組織樣本來源于非正常死亡案件死者組織檢材(由公安部鑒定中心提供,死因均排除金屬元素中毒),置于冰箱中-24 ℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 儀器及工作條件

iCAP Q電感耦合等離子質(zhì)譜儀(Thermo Fisher Scientific,美國),Preps 全自動微波消解儀(上海屹堯儀器科技發(fā)展有限公司),移液器,50 mL容量瓶(適用于ICP-MS檢測)。釆用質(zhì)譜調(diào)諧液對儀器各項工作指標進行優(yōu)化,儀器工作條件達到測定要求,確定儀器最佳工作技術條件與參數(shù)值,見表1。

表1 電感耦合等離子質(zhì)譜儀工作條件

1.3 實驗方法

1.3.1 標準溶液配制

用濃度2%稀硝酸溶液將市售1 000 μg/mL的15種金屬元素標準物質(zhì)溶液逐級稀釋配制混合標準工作溶液,As、Hg、Tl、Pb濃度分別為0、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10 ng/mL,Cr、Mn、Cu、Sr、Cd、Ba濃度分別為0、2、5、10、20、50、100、200、500、1 000 ng/mL,Mg、Al、Ca、Fe、Zn濃度分別為0、20、50、100、200、500、1 000、2 000、5 000、10 000 ng/mL。用濃度2%稀硝酸溶液將市售1 000 μg/mL的Bi和In標準物質(zhì)溶液逐級稀釋配制成10 ng/mL的內(nèi)標溶液。

1.3.2 樣品前處理

金屬元素在體內(nèi)與多種蛋白質(zhì)形成結(jié)合物,難以直接檢測,需進行氧化、分解等操作,將有機質(zhì)徹底破壞。取0.5 g(精確至0.000 1 g)組織樣品于消解罐中,加入5 mL濃硝酸(65%),2 mL過氧化氫(30%),經(jīng)微波消解儀消解(消解程序見表2)后,轉(zhuǎn)移消解液至50 mL容量瓶中,用去離子水清洗消解罐3次,將清洗液合并至樣品消解液中,并用去離子水定容至刻度,作為樣品提取液,供儀器檢測。

表2 微波消解程序

1.3.3 定量方法選擇

采用標準曲線-在線雙內(nèi)標實時校正法進行定量。Mg、Al、Ca、Cr、Mn、Fe、Cu、Zn、As、Sr、Cd、Ba等12種元素采用In為內(nèi)標,Hg、Tl、Pb等3種元素采用Bi為內(nèi)標。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性、檢出限和定量限

取15種金屬元素的混合標準溶液和10份空白對照溶液進行ICP-MS檢測,通過標準曲線方程得到的樣品空白平均值加上3倍標準偏差作為檢出限(LOD),以3倍檢出限作為定量限(LOQ)。結(jié)果表明,As、Hg、Tl、Pb元素在0～10 ng/mL,Cr、Mn、Cu、Sr、Cd、Ba元素在0～1 000 ng/mL,Mg、Al、Ca、Fe、Zn元素在0～10 000 ng/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)具有良好線性關系,相關系數(shù)(r2)不小于0.998 7,各元素檢出限為0.000 1～1.2 ng/mL,定量限為0.000 3～3.7 ng/mL(表3),滿足人體組織等生物樣本的檢測要求。

表3 15種金屬元素的線性關系、檢出限和定量限

2.2 精密度實驗

取15種金屬元素的混合標準溶液,連續(xù)6次進行ICP-MS檢測,統(tǒng)計6次檢測結(jié)果的相對標準偏差(RSD)為0.27%～3.4%,見表3,精密度較高,符合檢測方法精密度要求。

2.3 加標回收率實驗

以Bi和In作為內(nèi)標在線實時校正儀器,降低儀器響應信號變化的基體效應和信號漂移影響,提高檢測結(jié)果的準確性和精密度。

同一組織樣品中分別取0.5 g(精確至0.000 1 g)制備低、中、高3個質(zhì)量濃度的加標樣品和空白對照樣品,每個濃度設置3個平行樣品,按實驗方法制備樣品溶液,進行儀器檢測,獲取樣品信號強度,cps。添加的標準混合液信號強度為A,加標樣品信號強度為B,空白對照樣品信號強度為C,加標回收率=(B-C)/A×100%,計算得出加標回收率為82.1%～116%,見表4。

表4 樣品加標量和回收率

2.4 樣品含量檢測結(jié)果

用ICP-MS對44份死后人體組織樣品中15種金屬元素進行檢測,結(jié)果見表5。肝組織中Fe含量最高,平均值達422 953 ng/g,其次為Mg、Ca、Zn元素,平均含量超過80 000 ng/g,其他微量元素中,Cu、Mn、Al、Cr、Cd元素含量較高,平均值超過700 ng/g,其余6種元素含量較少。表中4種組織間元素含量比較,腎中Cd、Hg元素含量高于其他組織含量,肺中Al、Ba元素含量較高,其中Al超過其他組織50倍以上,肺和胃中Ca含量高于肝和腎。不同組織中15種元素含量的變異系數(shù)為27.0%～224.2%,其中Al、Cr、Mn、Cu、Cd、As、Ba、Hg、Tl、Pb元素含量變異系數(shù)超過100%,說明組織中金屬元素含量差異較大,有必要進行分析和綜合評價[10]。表5中得到的基礎數(shù)據(jù)可以為法醫(yī)金屬毒物檢驗案件的中毒值認定提供參考。

表5 死后人體肝、腎、肺、胃等組織中15種金屬元素含量

2.5 金屬元素相關性分析

采用Origin 2022軟件繪制15種元素的Spearman秩相關性分析圖,探討組織樣本金屬元素濃度之間的相關性,見圖1,發(fā)現(xiàn)有47對金屬元素之間具有顯著相關性(P<0.01)。其中Al、Sr分別與Cd顯著負相關,其余顯著相關關系均為正相關。Mg、Cu與Mn,Cu與Zn,Fe與Pb呈極顯著正相關(P<0.01),相關系數(shù)>0.8,其中Cu與Zn相關系數(shù)達0.91,表明Cu含量高的樣本中對應的Zn含量也高,死后人體組織樣本中金屬元素之間存在復雜的相關關系,具備進行主成分分析的條件[10]。

圖1 死后人體組織中15種金屬元素之間相關性(n=44)Figure 1 Correlation between 15 metal elements in postmortem human tissues(n=44).

2.6 金屬元素含量主成分分析

采用SPSS 26統(tǒng)計軟件對組織中15種金屬元素含量做主成分分析,對數(shù)據(jù)進行標準化處理后,以特征值>1提取4個主成分(表6),所提取的主成分累計方差貢獻率達72.942%,包含了15種元素的主要信息,從KMO和巴特利特球形度檢驗結(jié)果來看,KMO值=0.685,顯著性Sig值<0.001,各因素之間關聯(lián)程度較高,與相關性分析結(jié)果一致,符合開展主成分分析的條件。表中第一主成分方差貢獻率較大,達31.34%,第一主成分中Al、Mn、Fe元素載荷值>0.7,主要受這3種金屬元素影響,第二主成分主要受Cu、Zn元素影響,第四主成分主要受Cd影響,可以得出,Al、Mn、Fe、Cu、Zn、Cd等6種元素是死后人體組織的主要特征金屬元素。

表6 死后人體組織中金屬元素含量主成分分析(n=44)

選取前4個主成分對不同組織中金屬元素含量進行綜合評價,計算4個主成分的單獨得分,然后以每個主成分因子對應的方差相對貢獻率為權重得到每個樣品的綜合得分[11],按照綜合得分降序排序,結(jié)果見表7。綜合得分越高,說明總體金屬元素含量越高,由表7可知,肝臟中總體金屬元素含量最高,其次是腎和肺,胃組織中總體金屬元素含量最低。

表7 死后人體組織金屬元素含量主成分得分及評價(n=44)

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn),4種組織中不同金屬元素含量存在明顯差異。上述15種金屬元素中毒性比較大的有Hg、Cd、Tl、Pb、Cr等[12],其中Cd檢測含量較高,不同組織間Cd含量大小排序為腎>肝>胃>肺,腎中Cd含量達18 461 ng/g,遠低于文獻中報道的(200 mg/kg)引起腎臟鎘毒性反應的劑量[13]。POST等[13]利用掃描電鏡對死后人體腎、肝、肺組織中Cd金屬元素進行檢測,含量腎>肝>肺,依次為17.4、2.21、0.5 μg/g,王愛華等[14]對非鎘中毒者死后人體組織中Cd元素含量采取ICP-MS檢測,含量腎>肝>胃>肺,依次為8.31、2.23、0.208、0.17 μg/g,與本研究濃度范圍一致。

對不同組織中金屬元素開展相關性分析,發(fā)現(xiàn)有47對金屬元素之間具有顯著相關性,結(jié)果表明4種組織中不同金屬元素含量既存在差異性,也具有一定關聯(lián)性,有必要進行綜合評價。通過主成分分析,將15種金屬元素進行正交變換轉(zhuǎn)化為幾個綜合變量(即主成分)來表征原有變量的大部分信息,可以依據(jù)原變量對主成分的貢獻率(即載荷變量)來反應其在主成分中的重要性[15]。主成分分析篩選出Al、Mn、Fe、Cu、Zn、Cd等6種主要特征元素?；谠睾糠治霭l(fā)現(xiàn),肺中Al含量最高,腎中Cd含量最高,Cu和Zn元素在肝中含量最高,且在不同組織中含量呈顯著正相關關系。

4 結(jié)論

以Bi和In雙內(nèi)標在線校正基體效應和信號漂移干擾,采用微波消解-電感耦合等離子體質(zhì)譜法檢測死后人體組織樣本中15種金屬元素含量,方法干擾少,可同時分析多種元素,精密度和準確度高。通過對測得金屬元素含量進行相關性分析、主成分分析等綜合評價,研究死后人體組織中金屬元素含量的差異與關聯(lián),本研究考察的金屬元素檢測方法可以為法醫(yī)金屬毒物分析案件檢測提供參考,所獲取的基礎數(shù)據(jù)可以為相關案件中毒判定提供科學的數(shù)據(jù)支撐。