微波灰化-高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)法測定茶葉中的鉻酸鉛

劉 欠 吳綺莉 潘春秀

(1.中鋼集團(tuán)馬鞍山礦山研究總院股份有限公司,安徽 馬鞍山 243000;2.安徽工業(yè)大學(xué),安徽 馬鞍山 243000)

隨著茶葉保健功能的深入研究可知,茶葉中含有多種功能營養(yǎng)成分,如茶多酚類、茶氨酸、茶多糖等,其中茶多酚因含有較多的酚羥基,據(jù)相關(guān)研究表明,茶葉中的茶多酚具有抗氧化、抗衰老、抗癌變、降低血脂和膽固醇、抑菌消炎以及防治心血管疾病和保護(hù)心肌等多種藥理作用[1],近年來,茶葉深受人民喜愛。但是隨著人們生活水平的不斷提高,人們在關(guān)注茶葉營養(yǎng)成分的同時,也開始重視茶葉中的有害物質(zhì)[2]。

鉛鉻綠又稱“美術(shù)綠”,其成分主要由鉻酸鉛和鐵藍(lán)或者酞箐藍(lán)組成,由于其顏色鮮艷,價(jià)格低廉,近年來常被不法商販所利用,添加于茶葉成品中使茶葉的顏色變綠,提高茶葉的色澤度,以次充好[3-5]。鉛鉻綠中含有大量的鉛和鉻,大量的攝入對人體的健康造成嚴(yán)重危害,如果被添加于茶葉中,人在飲用的過程中大量的攝入鉛會對造血系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)和腎臟等造成嚴(yán)重?fù)p害[6-9]。同時,鉻通過鉻酸根或者重鉻酸根的形態(tài)通過帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜,并且促使氧化,從而導(dǎo)致病變發(fā)生,具有致癌和誘發(fā)基因突變的作用[10]。因此,測定茶葉中非法添加劑鉛鉻綠具有重要意義。

鉛鉻綠是一種混合物,很難通過特定的物質(zhì)對其進(jìn)行定量和定性分析。一般通過測定茶葉中的鉛和鉻的含量,以此來推斷茶葉中是否添加了鉛鉻綠[5,9,11-14],這些方法雖然能夠準(zhǔn)確測定茶葉中的鉛和鉻,但是不能明確茶葉中鉛和鉻的來源。直到2019年5月BJS201910《茶葉中美術(shù)綠(鉛鉻綠)的測定》的發(fā)布,為茶葉中鉛鉻綠的測定提供了依據(jù)。但是該標(biāo)準(zhǔn)的第一篇第一法高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用法(HPLC-ICP-MS)測定茶葉中鉻酸根時,消除樣品干擾的方法采用的是電爐灼燒法,以最大功率灼燒茶葉至無白煙。本文經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)使用電爐灰化茶葉時仍存在一些弊端。一方面,由于電爐型號不同使用的最大功率也不同,導(dǎo)致灼燒溫度不同,從而影響茶葉灰化的效果及樣品的準(zhǔn)確度測定[3,15]。另一方面,由于電爐很小,每個電阻絲的溫度不同,樣品放在電爐上會受熱不均勻,影響茶葉灰化的時間和灰化效果,同時不利于批量樣品的同時測定。此外電爐受外界干擾比較多,容易導(dǎo)致樣品的污染。相關(guān)研究表明微波灰化[16-20]和馬弗爐煅燒[16,21-22]均能消除樣品本身的干擾。但是馬弗爐在高溫煅燒前需要對樣品進(jìn)行蒸發(fā)水分和除去有機(jī)質(zhì)等碳化過程,過程比較繁瑣且時間比較長,容易對樣品造成污染。另外,馬弗爐煅燒不能隔絕空氣,容易導(dǎo)致Cr(Ⅲ)向Cr(Ⅵ)的轉(zhuǎn)化[3]。微波灰化是一種新型的灰化技術(shù),無需炭化可以直接快速升溫灰化,冷卻時間較快,節(jié)約了樣品分析的時間,灰化效果好。因此,本文采用微波灰化茶葉除去有機(jī)物,然后用堿性提取液提取灰分中的鉻酸根,利用HPLC-ICP-MS測定提取液中的鉻酸根,結(jié)合茶葉中鉛的測定結(jié)果推測出茶葉中鉻酸鉛的含量,為茶葉中是否添加了鉛鉻綠提供了判定依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器

Agilent 7900電感耦合等離子質(zhì)譜儀,Agilent 1260高效液相色譜儀,CEM PHOENIX微波灰化儀(美國CEM公司),HJS-6型水浴恒溫磁力攪拌器(金壇市儀純儀器有限公司),G3268-80001色譜柱(30 mm×4.6 mm,5 μm,美國Agilent)。

1.2 試劑與材料

硝酸(優(yōu)級純,德國默克公司),鉻酸鉛、氫氧化鈉、無水碳酸鈉和氨水(優(yōu)級純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);Be、Ce、Fe、In、Mg、Pb、U的混合標(biāo)準(zhǔn)調(diào)諧液(1.0 μg/L,美國珀金埃爾默公司),六價(jià)鉻標(biāo)準(zhǔn)溶液(100 mg/L,國家有色金屬及電子材料分析測試中心);Milli-Q去離子水發(fā)生器(美國Millipore公司)。

取10.0 g NaOH和15.0 g Na2CO3,水定容至1 L,得到0.25 mol/L的NaOH和0.14 mol/L的Na2CO3的混合堿性提取液。

硝酸銨溶液(0.05 mol/L):一定量水中加入3.4 mL硝酸和3.7 mL氨水,定容至1 L,搖勻;用10%硝酸溶液或10%氨水溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0～7.2,得到50 mmol/L的硝酸銨緩沖鹽溶液。

1.3 樣品制備

茶葉樣品去雜后粉碎,過0.425 mm篩,稱取過篩樣品1.000 g(精確至0.001 g)于瓷坩堝中,放入微波灰化爐中在500 ℃,灰化時間50 min條件下灰化至白灰狀,灰化程序見表1?；一瓿衫鋮s至室溫,取出樣品加入30 mL的堿性提取液,置于磁力攪拌恒溫水浴鍋中,在90～95 ℃下不間斷攪拌10 min,取出后冷卻至室溫,轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中,從中取1.0 mL用0.05 mmol/L的硝酸銨溶液定容至50 mL,用10%的硝酸調(diào)節(jié)pH值至7.0～7.2,過0.45 μm水系微孔濾膜,上機(jī)測定,同時做樣品空白。

表1 微波灰化程序升溫模式

1.4 儀器條件

用調(diào)諧液調(diào)諧儀器,使儀器靈敏度、氧化物、雙電荷、分辨率等各項(xiàng)指標(biāo)達(dá)到測定要求,主要儀器參數(shù)見表2。

表2 HPLC-ICP-MS主要參數(shù)

1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線配制

標(biāo)準(zhǔn)中間液的配制(10.0 mg/L):準(zhǔn)確移取1.00 mL六價(jià)鉻標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液(100 mg/L)于10.0 mL容量瓶中,用0.05 mmol/L的硝酸銨溶液定容至刻度,得六價(jià)鉻標(biāo)準(zhǔn)中間液為10.0 mg/L。

標(biāo)準(zhǔn)使用液的配制(1.00 mg/L):準(zhǔn)確移取10.0 mL六價(jià)鉻標(biāo)準(zhǔn)中間液于100 mL容量瓶中,用0.05 mmol/L的硝酸銨溶液定容至刻度,得六價(jià)鉻標(biāo)準(zhǔn)使用液為1.00 mg/L。

標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制:分別吸取0、0.50、1.00、2.00、5.00、10.0、20.0、50.0 mL標(biāo)準(zhǔn)中間液于100 mL容量瓶中,用0.05 mmol/L的硝酸銨溶液定容、混勻,過水系微孔濾膜(0.45 μm),待上機(jī)測定。該標(biāo)準(zhǔn)工作液六價(jià)鉻的濃度分別為0、5.00、10.0、20.0、50.0、100、200、500 μg/L。該標(biāo)準(zhǔn)工作液現(xiàn)用現(xiàn)配。

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理方法

目前國內(nèi)外報(bào)道的常用六價(jià)鉻提取方法有堿提取[3,23-27]、緩沖鹽溶液提取[28-30]、ASE提取[31]、超聲輔助提取[10,31]等。結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn),本文先用0.25 mol/L的NaOH和0.14 mol/L的Na2CO3混合堿性提取液直接提取添加了100 mg/kg Cr(Ⅵ)的茶葉30 min,提取完成后轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中并定容,上機(jī)測定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Cr(Ⅵ)沒有檢出,與王瑩等[3]研究結(jié)果一致;本文又參照超聲輔助提取法,用0.05 mol/L pH值為7.0～7.2的硝酸銨緩沖溶液超聲提取同一添加量的茶葉30 min,提取完畢后8 000 r/min離心,取上清液,重復(fù)提取2次,合并上清液,上機(jī)測定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Cr(Ⅵ)的回收率只有30%。其原因一方面是茶葉中含有多酚類的還原性有機(jī)化合物,在堿性提取和超聲輔助提取的過程中,同時也把茶葉中的茶多酚類化合物提取出來,在樣品處理的過程中將Cr(Ⅵ)還原成Cr3+[30,32];另一方面是茶葉具有吸附性,能夠吸附樣品中的Cr(Ⅵ),導(dǎo)致Cr(Ⅵ)的回收率不高[33-35]。根據(jù)倪張林等[16]的研究結(jié)果可知,Pb2CrO4在高溫條件下非常穩(wěn)定。因此,為了消除茶葉基質(zhì)的干擾,本文先對茶葉進(jìn)行灰化處理,然后再提取灰分中的Pb2CrO4。

2.2 灰化方式的選擇

據(jù)相關(guān)報(bào)道可知,電爐灼燒、微波灰化以及馬弗爐煅燒均能消除樣品本身的干擾,但是馬弗爐在高溫煅燒前需要對樣品進(jìn)行碳化,而微波灰化儀可以直接快速升溫灰化,且冷卻時間較快。因此,本文選擇電爐灼燒和微波灰化兩種方式進(jìn)行比較,進(jìn)一步研究更有利于消除茶葉基質(zhì)干擾的灰化方式。

2.2.1 電爐灼燒灰化法

本文選擇4種添加了100 mg/kg Cr(Ⅵ)的茶葉分別在800、1 000、2 000 W使用功率下灼燒灰化茶葉,用于研究電爐功率對測定茶葉中Pb2CrO4含量的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),由于樣品基質(zhì)的不同,同一功率下樣品的回收率測定結(jié)果差異很大,達(dá)到最高回收率時電爐的功率也不同。由表3可以發(fā)現(xiàn),茶葉3無論電爐使用功率是1 000 W還是2 000 W均不能灰化完全;茶葉2雖然在1 000 W下能灰化完全,但是回收率僅有55%,測定總鉻發(fā)現(xiàn)總鉻的回收率也只有65.92%;然而,茶葉1和茶葉4在1 000 W條件下就能灰化至灰白色,且樣品回收率均達(dá)到80%以上。4種茶葉同一功率下不同的灰化效果反應(yīng)了電爐灼燒法的灰化效果受樣品基體的影響很大,說明電爐灼燒法不能夠滿足所有茶葉的測定要求,不具有普遍適用性。

表3 不同灰化功率下茶葉回收率的測定結(jié)果

另外,由表3還可以發(fā)現(xiàn),茶葉1和茶葉4在使用功率達(dá)到2 000 W時,回收率反而只有50%左右,結(jié)合茶葉2總鉻的回收率只有65.92%的測定結(jié)果,分析其原因可能是高溫下鉻與炭發(fā)生反應(yīng),生成難溶的碳化鉻化合物,這一結(jié)果與李冰茹等[17]研究結(jié)果一致。為了進(jìn)一步驗(yàn)證在電爐灼燒的過程中存在Cr(Ⅵ)轉(zhuǎn)化,在同樣的條件下灰化茶葉2,灰化后向其中加入100 mg/kg的Cr(Ⅵ)標(biāo)液,在90～95 ℃下不間斷攪拌10 min,取出后冷卻至室溫,轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中,從中取1.0 mL用0.05 mol/L的硝酸銨溶液定容至50 mL,用10%的硝酸調(diào)節(jié)pH值至7.0～7.2,過0.45 μm水系微孔濾膜,上機(jī)測定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)六價(jià)鉻的回收率幾乎100%,證明了在電爐灼燒茶葉樣品時存在Cr(Ⅵ)轉(zhuǎn)化,同時也說明在堿提取10 min的過程中不存在Cr(Ⅵ)的轉(zhuǎn)化。

2.2.2 微波灰化法

與電爐相比,微波灰化法隔絕空氣,能夠降低Cr3+向Cr(Ⅵ)的轉(zhuǎn)化[16-17]。本文參照微波灰化法測定茶葉的總灰分程序升溫方法[20]將上述4種茶葉[添加了100 mg/kg Cr(Ⅵ)]在500 ℃條件下,灰化40 min。按照擬定的堿提取方式,提取灰分,然后上機(jī)測定Cr(Ⅵ)的回收率,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4。結(jié)果發(fā)現(xiàn)4種茶葉均灰化完全,測定Cr(Ⅵ)的回收率在85%～95%。與電爐灼燒法相比,微波灰化法灰化效果好、準(zhǔn)確度高,能夠滿足茶葉樣品的測定要求。因此選擇微波灰化作為茶葉的灰化方式。

表4 微波灰化法測定茶葉中Cr(Ⅵ)的回收率結(jié)果

2.3 微波灰化條件的優(yōu)化

微波灰化溫度和灰化時間是影響灰化效果的重要因素[16]。選擇茶葉3[添加了100 mg/kg的Cr(Ⅵ)],按照擬定前處理方式,分別考察了灰化溫度和灰化時間對茶葉中鉻酸根測定結(jié)果的影響,優(yōu)化了灰化溫度和灰化時間等條件。

2.3.1 灰化溫度的優(yōu)化

在灰化時間40 min條件下,分別研究灰化溫度400、450、500、550、600 ℃對茶葉3[添加了100 mg/kg的Cr(Ⅵ)]中鉻酸根測定結(jié)果的影響。由表5可知,在450 ℃以下,茶葉灰化不完全,灰分中有較多的黑色炭顆粒,加標(biāo)回收率不高;當(dāng)灰化溫度在550 ℃以上時,雖然茶葉灰化完全,但是由于高溫Cr(Ⅵ)可能與茶葉中的礦物質(zhì)發(fā)生反應(yīng),生成難溶的碳化鉻化合物,導(dǎo)致加標(biāo)回收率不高;因此選擇500 ℃作為茶葉灰化溫度,加標(biāo)回收率達(dá)90.2%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表5所示。

表5 不同灰化溫度下茶葉中Cr(Ⅵ)的加標(biāo)回收率結(jié)果

2.3.2 灰化時間的優(yōu)化

灰化時間是影響灰化效果另一個重要因素。在灰化溫度500 ℃的條件下,分別考察了灰化時間10、20、30、40、50 min對茶葉3[添加了100 mg/kg的Cr(Ⅵ)]中鉻酸根測定結(jié)果的影響,由表6可知灰化時間太短,茶葉樣品灰化不完全,回收率測定結(jié)果偏低,隨著灰化時間的增加,灰化效果越好,在灰化時間50 min的條件下,灰化效果最好,回收率達(dá)98%。結(jié)合灰化溫度和灰化時間的測定結(jié)果可知,灰化溫度500 ℃,灰化時間50 min是茶葉樣品的最佳灰化條件。

表6 不同灰化時間下茶葉中Cr(Ⅵ)的加標(biāo)回收率結(jié)果

2.4 提取液的選擇

據(jù)報(bào)道,目前常用的提取液有NaOH和Na2CO3混合堿提取液[3,15]、水及EDTA和硝酸銨混合提取液[28]等。據(jù)王瑩等[3]研究結(jié)果可知0.25 mol/L的NaOH和0.14 mol/L的Na2CO3混合堿性提取液是提取茶葉中鉻酸根的最佳濃度。同時,又考慮到提取液與流動相的基體不一致,影響基線的穩(wěn)定性。本研究在最佳的微波灰化條件下分別研究了0.25 mol/L的NaOH和0.14 mol/L的Na2CO3混合堿性提取液和0.05 mol/L,pH值為7.0～7.2的硝酸銨緩沖溶液對茶葉3[添加了100 mg/kg的Cr(Ⅵ)]灰分中鉻酸鉛提取效果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)0.25 mol/L的NaOH和0.14 mol/L的Na2CO3混合堿性提取液和0.05 mol/L的硝酸銨提取液均能很好地提取灰分中添加的Cr(Ⅵ)。由于茶葉3樣品中本底鉻酸根未檢出,添加的Cr(Ⅵ)回收率好,只能說明0.25 mol/L的NaOH和0.14 mol/L的Na2CO3混合堿性提取液和0.05 mol/L的硝酸銨提取液能夠很好地提取添加的六價(jià)鉻離子。為了證實(shí)這一結(jié)論,稱取0.027 9 g鉻酸鉛,分別用上述兩種提取液在相同條件下提取,轉(zhuǎn)移至1 000 mL容量瓶中,稀釋500倍,上機(jī)測定六價(jià)鉻的含量。結(jié)果0.05 mol/L的硝酸銨提取液中沒有Cr(Ⅵ)檢出,而0.25 mol/L的NaOH和0.14 mol/L的Na2CO3混合堿性提取液中Cr(Ⅵ)的檢測含量與理論值(20 μg/L)基本一致,說明Na2CO3和NaOH對茶葉中的Pb2CrO4具有更好的提取能力,因此選擇0.25 mol/L的NaOH和0.14 mol/L的Na2CO3混合堿性提取液作為茶葉中Pb2CrO4的提取液。

2.5 堿提取條件的優(yōu)化

2.5.1 提取液體積的優(yōu)化

考慮到堿的濃度能夠影響色譜柱的壽命、儀器的穩(wěn)定性以及Cr3+向Cr(Ⅵ)的轉(zhuǎn)化率[36]。在最佳的灰化條件下,分別研究了提取液體積對茶葉3[添加了100 mg/kg的Cr(Ⅵ)和100 mg/kg的Cr(Ⅲ)]中Cr(Ⅵ)提取及Cr3+轉(zhuǎn)化的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表7所示,由表7可以看出,當(dāng)提取液體積達(dá)到30 mL時,Cr(Ⅵ)的回收率為90.5%,Cr3+的轉(zhuǎn)化率也很低,隨后隨著提取液體積的增加,Cr(Ⅵ)的回收率基本保持不變。因此選擇30 mL作為堿提取液的提取體積。

表7 不同提取體積下Cr(Ⅵ)的提取結(jié)果及Cr3+的轉(zhuǎn)化結(jié)果

2.5.2 提取時間的優(yōu)化

提取時間是影響茶葉中鉻酸根提取率的關(guān)鍵因素之一,同時也影響Cr3+向Cr(Ⅵ)轉(zhuǎn)化。在茶葉最優(yōu)的灰化條件下,分別研究了提取時間對茶葉3[添加了100 mg/kg的Cr(Ⅵ)和100 mg/kg的Cr(Ⅲ)]中Cr(Ⅵ)提取及Cr3+轉(zhuǎn)化的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表8,由表8可知,隨著提取時間的增加,Cr(Ⅵ)的回收率和Cr3+轉(zhuǎn)化率基本變化不大,從節(jié)能環(huán)保提高效率考慮,選擇10 min作為茶葉灰分中鉻酸根的提取時間。

表8 不同提取時間下茶葉中Cr(Ⅵ)的提取結(jié)果和Cr3+的轉(zhuǎn)化結(jié)果

2.5.3 提取溫度的優(yōu)化

提取溫度是影響鉻酸根提取率和Cr3+向Cr(Ⅵ)轉(zhuǎn)化的另一因素。本研究在茶葉最優(yōu)的實(shí)驗(yàn)條件下,分別研究了提取溫度對茶葉3[添加了100 mg/kg的Cr(Ⅵ)和100 mg/kg的Cr(Ⅲ)]中Cr(Ⅵ)提取及Cr3+轉(zhuǎn)化的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表9,由表9可以發(fā)現(xiàn),隨著提取溫度的增加,Cr(Ⅵ)的回收率逐漸增加,Cr3+轉(zhuǎn)化率基本不變,提取溫度為95 ℃時,Cr(Ⅵ)的回收率最高,Cr3+轉(zhuǎn)化率低,因此選擇95 ℃作為茶葉灰分中鉻酸根的提取溫度。

表9 不同提取溫度下茶葉中Cr(Ⅵ)的提取結(jié)果和Cr3+的轉(zhuǎn)化結(jié)果

2.6 方法學(xué)驗(yàn)證

2.6.1 線性范圍

按照實(shí)驗(yàn)方法測定52Cr標(biāo)準(zhǔn)系列,以濃度為橫坐標(biāo),以色譜峰面積為縱坐標(biāo),建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果相關(guān)性良好,相關(guān)系數(shù)為0.999 8,滿足GB/T 27404—2008規(guī)定的要求。

2.6.2 檢出限和定量限

檢出限按3倍的信噪比所產(chǎn)生的信號響應(yīng)對應(yīng)的濃度表示。通過將樣品空白中添加0.5 μg/L的Cr(Ⅵ)標(biāo)準(zhǔn)溶液產(chǎn)生的相應(yīng)信號約為噪聲的3倍。因此,方法最低檢出濃度為0.5 μg/L。當(dāng)稱樣量為1.000 g,定容體積為100 mL,稀釋50倍時,Cr(Ⅵ)檢出限為2.5 mg/kg,定量限為7.5 mg/kg。

2.6.3 精密度和準(zhǔn)確度

為了進(jìn)一步驗(yàn)證該方法的準(zhǔn)確度和精密度,對茶葉3進(jìn)行三水平加標(biāo),6次平行測定,用于計(jì)算該方法的準(zhǔn)確度和精密度。準(zhǔn)確度結(jié)果用加標(biāo)回收率表示,精密度結(jié)果用RSD表示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表10。從表10可知,加標(biāo)回收率在91.3%～95.3%,精密度結(jié)果在1.1%～2.0%,均符合GB/T 27404—2008中的規(guī)定要求。表明該方法精密度高、準(zhǔn)確度良好,完全滿足茶葉中鉻酸根的測定。

表10 精密度和準(zhǔn)確度測定結(jié)果

3 結(jié)論

比對了電爐灼燒和微波灰化兩種灰化方式的測定結(jié)果,建立了微波灰化-HPLC-ICP-MS法測定茶葉中鉻酸鉛的方法,并對灰化溫度、灰化時間、堿提取液體積、提取時間以及提取溫度進(jìn)行了優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該方法檢出限低至2.5 mg/kg,三水平加標(biāo)回收率在91.3%～95.3%,精密度結(jié)果在1.1%～2.0%。研究表明,該方法檢出限低,靈敏度高,準(zhǔn)確度結(jié)果良好,能夠滿足茶葉中鉻酸鉛的測定。