寄生蟲抗藥性及其對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物寄生蟲病藥物防治的啟示

李文祥 王 浩 習(xí)丙文 李 明 聶 品, 4 王桂堂

(1.中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所淡水生態(tài)與生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430072; 2.上海海洋大學(xué), 上海 201306;3.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心, 無錫 214081; 4.青島農(nóng)業(yè)大學(xué), 青島 266109)

為減少細(xì)菌性疾病的發(fā)生, 抗生素被大量用于陸生動(dòng)物[1]和水生動(dòng)物[2,3] 的養(yǎng)殖生產(chǎn), 從而引起細(xì)菌對(duì)抗生素產(chǎn)生了抗性(Antimicrobial resistance),這不僅影響?zhàn)B殖動(dòng)物疾病的藥物防控效果, 而且還會(huì)使人類相關(guān)疾病的病原菌產(chǎn)生抗藥性[4]。細(xì)菌的抗藥性(Drug resistance)已成為全球關(guān)注的熱點(diǎn)問題[5]。

抗藥性原本是指微生物能經(jīng)受住藥物毒性的一種能力, 少數(shù)個(gè)體在藥物作用下發(fā)生遺傳變異,并在持續(xù)的藥物選擇壓力下存活, 從而形成對(duì)藥物具有耐受力的種群[6,7]; 且抗藥能力取決于抗性個(gè)體在種群中的比例和抗藥機(jī)制[8]。目前陸生動(dòng)物寄生蟲病的防治仍然依靠化學(xué)藥物, 由于驅(qū)殺蟲藥物(Anthelmintics)的長(zhǎng)期大量使用, 寄生蟲產(chǎn)生了嚴(yán)重的抗藥性[9]?？辜纳x藥物的種類本來就很有限, 隨著抗藥性的出現(xiàn), 可用的藥物越來越少, 且短期內(nèi)有效的疫苗難以研制出來, 加之新藥研制是個(gè)漫長(zhǎng)的過程, 造成了當(dāng)前寄生蟲病的藥物防治越來越困難[10], 寄生蟲抗藥性受到廣泛關(guān)注[11—15]。

與陸生動(dòng)物相比, 水生動(dòng)物寄生蟲的抗藥性研究較少[16], 雖然在20世紀(jì)90年代發(fā)現(xiàn)了歐洲鰻鱺(Anguilla anguilla)的擬指環(huán)蟲(Pseudodactylogyrusspp.)的抗藥性問題[17], 但針對(duì)抗藥性的系統(tǒng)研究目前僅限于鮭鱒類寄生的鮭瘡痂魚虱(Lepeophtheirus salmonis)[18—20]。高密度養(yǎng)殖中殺蟲藥物的反復(fù)使用是產(chǎn)生抗藥性的前提條件[16], 隨著我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖集約化程度逐漸提高和養(yǎng)殖規(guī)模逐漸擴(kuò)大, 寄生蟲病的發(fā)生越來越嚴(yán)重, 殺蟲藥物被大量使用, 有些寄生蟲病的防治效果已呈現(xiàn)明顯下降趨勢(shì), 表明寄生蟲可能已經(jīng)產(chǎn)生抗藥性, 然而缺乏相關(guān)研究。

本文將通過對(duì)寄生蟲病主要防治藥物、寄生蟲抗藥性機(jī)制、抗藥性測(cè)定方法、減緩抗藥性措施及水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物寄生蟲抗藥性的研究現(xiàn)狀進(jìn)行綜述, 為我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖中寄生蟲抗藥性研究提供思路, 同時(shí)為寄生蟲病的合理用藥提供策略, 避免或減緩抗藥性的產(chǎn)生。

1 寄生蟲病主要防治藥物及驅(qū)殺蟲的作用機(jī)制

世界上幾乎所有的殺蟲藥物都是為了防治農(nóng)作物害蟲(主要是昆蟲和螨)、家禽家畜的寄生蟲(球蟲、吸蟲、絳蟲和線蟲等)和人體寄生蟲而研發(fā)的。目前使用的抗寄生蟲藥物主要涵蓋以下幾類:有機(jī)磷類(Organophosphates)、擬除蟲菊酯類(Pyrethroids)、大環(huán)內(nèi)酯類(Macrocyclic lactone)、苯甲酰脲類(Benzoyl ureas)、新煙堿類(Neonicotinoid)、咪唑并噻唑類(Imidazothiazole)、苯并咪唑類(Benzimidazoles)和異喹啉類(Isoquinoline), 還有一些化學(xué)合成抗球蟲藥, 以及驅(qū)蟲殺蟲的無機(jī)化合物、消毒劑和中草藥等。

寄生蟲的抗藥性與藥物種類和作用方式(Mode of action)密切相關(guān), 以下是幾類主要?dú)⑾x藥物的作用方式或作用機(jī)制。

1.1 有機(jī)磷類

有機(jī)磷類是應(yīng)用最為廣泛的一類殺蟲劑, 以胃毒、觸殺、熏蒸或內(nèi)吸等多種方式作用于蟲害[21]。該類藥物的主要靶標(biāo)為乙酰膽堿酯酶, 可使傳導(dǎo)神經(jīng)沖動(dòng)的乙酰膽堿無法水解, 在突觸處大量積累,干擾神經(jīng)沖動(dòng)的正常傳導(dǎo), 使蟲體因過度興奮死亡[22]。常用的有敵百蟲(Trichlorfon)、甲基吡啶磷(Azamethiphos)、辛硫磷(Phoxim)和馬拉硫磷(Malathion)[23]等, 可用于寄生蠕蟲(吸蟲、絳蟲、線蟲、棘頭蟲和魚蛭)和甲殼類寄生蟲病的防治。

1.2 擬除蟲菊酯類

該類殺蟲劑包括從除蟲菊屬植物中提取的天然除蟲菊酯(Pyrethrin)及經(jīng)合成衍生而成, 對(duì)昆蟲有強(qiáng)烈的觸殺、胃毒和熏蒸作用, 而對(duì)哺乳動(dòng)物和禽類毒性低, 主要作用于軸突膜上的電壓門控鈉離子通道, 引起去極化過程, 擾亂蟲體神經(jīng)的正常生理活動(dòng)[24]。常用的有溴氰菊酯(Deltamethrin)、氰戊菊酯(Fenvalerate)、氯氰菊酯(Cypermethrin)、高效氯氰菊酯(Beta-cypermethrin)和高效氟氯氰菊酯(Lambada-cyhalothrin)[25]等, 主要用于甲殼類寄生蟲病的防治。

1.3 大環(huán)內(nèi)酯類

大環(huán)內(nèi)酯類抗寄生蟲藥是一類天然的或是半合成的具有十六元大環(huán)內(nèi)酯環(huán)化合物, 該類化合物由兩大類組成, 即阿維菌素類(Avermectins)和美貝霉素類(Milbemycins)。阿維菌素類有阿維菌素(Abamectin)、伊維菌素(Ivermectin)、?，斁?Emamectin benzoate, 也叫甲維鹽)[26]等。該類藥物是一種神經(jīng)毒劑, 主要激活存在于無脊椎動(dòng)物中的谷氨酸門控氯離子通道(GluCls), 同時(shí)可以激活其他具有半胱氨酸環(huán)的離子通道, 如γ-氨基丁酸(GABA)受體、甘氨酸受體和煙堿型乙酰膽堿受體等, 促進(jìn)相應(yīng)神經(jīng)遞質(zhì)與次級(jí)神經(jīng)元細(xì)胞膜或效應(yīng)器細(xì)胞膜的結(jié)合, 產(chǎn)生抑制效應(yīng), 使蟲體麻痹死亡, 具有觸殺和胃毒作用[27,28], 常用于甲殼類寄生蟲病和線蟲病的防治。

1.4 苯甲酰脲類

苯甲酰脲類化合物是一種昆蟲幾丁質(zhì)抑制劑,抑制幾丁質(zhì)合成酶的活性, 進(jìn)而抑制幾丁質(zhì)合成和沉積, 從而阻止脫皮過程, 使昆蟲變態(tài)受阻, 導(dǎo)致不育及直接殺卵等而殺死害蟲[29,30]。常用的有二氟脲(Diflubenzuron, 除蟲脲)、氟苯脲(Teflubenzuron)和八氟脲(Lufenuron, 虱螨脲)[18]等, 可用于甲殼類寄生蟲病的防治。

1.5 新煙堿類

該類殺蟲劑來源于煙葉中提取的活性成分煙堿經(jīng)修飾而成的化合物, 主要作用于煙堿型乙酰膽堿受體, 引起過度興奮而導(dǎo)致麻痹和死亡, 具有觸殺和胃毒作用, 高效低毒[31]。主要包括吡蟲啉(Imidacloprid)、啶蟲脒(Acetaniprid)、噻蟲啉(Thiacloprid)、噻蟲胺(Clothianidin)和呋蟲胺(Dinotefuran)等, 常用于甲殼類寄生蟲病的防治。

1.6 咪唑并噻唑類

該藥物是一類化學(xué)合成的廣譜驅(qū)線蟲藥, 能選擇性地打開線蟲神經(jīng)和肌肉中乙酰膽堿受體(AChR)離子通道產(chǎn)生去極化, 鈣大量進(jìn)入后導(dǎo)致肌漿鈣增加, 產(chǎn)生痙攣性肌肉收縮, 然后蟲體被機(jī)體清除[32]。主要有四咪唑(Tetramisole, 噻咪唑)和左旋咪唑(Levamisole)等, 常用于線蟲病的防治。

1.7 苯并咪唑類

目前認(rèn)為此類藥物的作用機(jī)理是抑制蠕蟲的延胡索酸還原酶復(fù)合體, 影響其糖酵解途徑使得蟲體代謝障礙; 也有觀點(diǎn)認(rèn)為該類藥物是細(xì)胞微管蛋白抑制劑以及能量代謝抑制劑, 阻礙蟲體在微管裝配過程中微管蛋白的聚合[33,34]。常用的有甲苯咪唑(Mebendazole)、芬苯達(dá)唑(Fenbendazole)、三氯苯達(dá)唑(Triclabendazole)和阿苯達(dá)唑(Albendazole)[35]等, 可用于扁形動(dòng)物寄生蟲、線蟲和棘頭蟲引起的寄生蟲病。

1.8 異喹啉類

該類藥物中常用于驅(qū)殺寄生蟲的是吡喹酮(Praziquantel), 是一種含有吡嗪(Pyrazino-)和異喹啉(Isoquinolin-)雜環(huán)的衍生物[36], 通過改變電壓門控的鈣離子通道活性, 提高蟲體膜通透性, 導(dǎo)致鈣離子流入, 引起肌肉收縮和外皮出現(xiàn)空泡[37], 但可能有多種作用方式[38,39], 是一種高效的驅(qū)殺吸蟲和絳蟲的藥物[40,41]。

2 寄生蟲的抗藥性機(jī)制

藥代動(dòng)力學(xué)描述的是藥物進(jìn)入蟲體后的過程,包括吸收、分布、代謝和排出。藥物發(fā)生作用就是藥物分子與分子靶點(diǎn)(作用位點(diǎn))發(fā)生相互作用的過程, 一方面是藥物分子對(duì)機(jī)體細(xì)胞產(chǎn)生毒性, 引起蟲體死亡; 另一方面蟲體會(huì)發(fā)生相應(yīng)的生理變化和遺傳變異, 改變藥物吸收、分布、代謝和排出過程, 降低蟲體內(nèi)的藥物濃度, 減少藥物的有害影響,從而保證機(jī)體存活[12]。使這個(gè)藥物動(dòng)力學(xué)發(fā)生改變的生化和生理過程就是抗藥性機(jī)制(Mechanisms of resistance)[8]。

2.1 抗藥性機(jī)制類型

抗藥性機(jī)制主要包括3類(圖1): 通過改變穿透性(Penetration)或藥物吸收系統(tǒng)減少藥物進(jìn)入和增加藥物外排(Efflux); 通過改變作用位點(diǎn)(Modified site of action)或靶標(biāo)改變(Target modification)減少與殺蟲藥物結(jié)合; 通過增加新陳代謝(Enhanced metabolism)提高蟲體對(duì)殺蟲藥物的降解能力, 使藥物失活[8,42]。

圖1 寄生蟲常見的抗藥性機(jī)制(修改自Garcia-Salcedo等[44])Fig.1 Common mechanisms for drug resistance of parasites(Modified from Garcia-Salcedo, et al.[44])

研究寄生蟲抗藥性產(chǎn)生機(jī)制不僅可開發(fā)檢測(cè)抗藥性的分子標(biāo)記, 進(jìn)行早期識(shí)別, 避免一些無效、有害的藥物治療, 而且有助于制定更合理的聯(lián)合用藥方案, 減少抗藥性產(chǎn)生, 延長(zhǎng)藥物的有效性[12];另外, 還有助于準(zhǔn)確錨定藥物靶標(biāo), 開發(fā)藥物類似物(Drug analogue)[43]。

穿透抗藥性機(jī)制通過蟲體的滲透屏障(表皮、消化道外膜和血腦屏障)結(jié)構(gòu)和滲透性的改變,減少殺蟲藥物在體內(nèi)的滲透量和殘留量, 主要包括減少表皮的藥物滲透 , 以及增加藥物的運(yùn)輸和排出[42],如通過上調(diào)表皮沉積蛋白基因和幾丁質(zhì)合成酶基因來增厚表皮[45,46], 以及通過P-糖蛋白(ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白中的一種)增加藥物外排[47]。

靶標(biāo)改變抗藥性機(jī)制指與殺蟲劑作用的靶標(biāo)分子發(fā)生突變或者表達(dá)水平的改變, 減少了與殺蟲藥物結(jié)合, 從而降低蟲體對(duì)藥物的敏感性[43]。離子通道由一類膜蛋白組成, 起神經(jīng)系統(tǒng)傳導(dǎo)信號(hào)和胞內(nèi)信息交流作用, 是殺蟲藥物的主要靶標(biāo), 包括電壓門控的(Voltage-gated)離子通道, 如電壓門控鈉離子通道、鈣離子通道和鉀離子通道等, 以及配體門控的(Ligand-gated)離子通道, 也稱離子型受體; 配體結(jié)合導(dǎo)致通道蛋白結(jié)構(gòu)的構(gòu)象變化而打開通道, 離子流通過質(zhì)膜, 如煙堿型乙酰膽堿受體(nAChRs) 、乙酰膽堿門控的氯離子通道(ACCs)或乙酰膽堿受體(AChRs)、谷氨酸鹽門控的氯離子通道(GluCls)、γ-氨基丁酸(GABA)門控的氯離子通道等[48]; 另外, 可水解神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿的乙酰膽堿酯酶(AChE)[49]和組成細(xì)胞骨架的β-微管蛋白也是重要的藥物靶標(biāo)[50], 它們的基因突變會(huì)增加蟲體對(duì)藥物的耐受性。

增加新陳代謝抗藥機(jī)制通過體內(nèi)解毒酶系表達(dá)量或活性的增加來提高蟲體對(duì)殺蟲劑的降解能力, 使藥物失活(Inactivation), 如將藥物由疏水型轉(zhuǎn)化為更易排出的親水型的細(xì)胞色素P450酶系(CYP450), 對(duì)藥物具有解毒作用的谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST) 和羧酸酯酶(CarE)[11,51]。

2.2 主要寄生蟲類群的抗藥性機(jī)制

在通常情況下, 同種寄生蟲對(duì)同一類藥物的抗藥性機(jī)制是相同的。當(dāng)寄生蟲對(duì)某種藥物產(chǎn)生抗藥性后, 對(duì)于結(jié)構(gòu)近似或作用方式相同的藥物也會(huì)產(chǎn)生抗藥性, 這種現(xiàn)象被稱為交叉抗藥性(Cross-resistance)[10]。而多藥抗性(Multidrug resistance)則是寄生蟲對(duì)某種藥物產(chǎn)生抗藥性后, 對(duì)具有不同化學(xué)結(jié)構(gòu)或不同作用方式的多種藥物產(chǎn)生抗藥性, 如ABC(ATP binding cassette)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白中的P-糖蛋白過量表達(dá)就是較常見的多藥抗性機(jī)制[47,52]。

不同類別的寄生蟲具有不同的身體結(jié)構(gòu)和生理機(jī)能, 對(duì)不同的殺蟲藥物產(chǎn)生的抗藥機(jī)制不盡相同, 以下是幾種主要寄生蟲類群的抗藥性機(jī)制。

寄生原蟲的抗藥性機(jī)制寄生原蟲的抗藥性機(jī)制研究主要集中在人類的瘧原蟲、非洲錐體蟲和利什曼原蟲[43,53]。氯喹(Chloroquine)曾是治療瘧疾的特效藥, 但現(xiàn)在世界各地的瘧原蟲對(duì)氯喹產(chǎn)生了普遍的抗藥性。氯喹的主要作用是抑制蟲體食物泡內(nèi)血紅蛋白酶活性和降低pH, 從而使瘧原蟲不能消化所攝取的血紅蛋白而致使核破裂。因此,瘧原蟲對(duì)氯喹的抗藥機(jī)制是位于食物泡膜的一種ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ATP-Binding-Cassettes, ABC)Pgh1基因發(fā)生點(diǎn)突變, 表達(dá)上調(diào), 增加了對(duì)氯喹的泵出[54]。另外, 編碼食物泡另一種膜蛋白PfCRT基因的突變, 通過調(diào)節(jié)食物泡內(nèi)的pH增加對(duì)氯喹的抗性[55]。后來隨著葉酸拮抗劑(Antifolates)大量使用, 瘧原蟲很快也產(chǎn)生了抗藥性, 主要通過二氫葉酸還原酶(DHFR)和二氫蝶酸合成酶(DHPS)的點(diǎn)突變, 改變?nèi)~酸拮抗劑藥物與作用靶點(diǎn)葉酸的結(jié)合[56]?，F(xiàn)在盡管青蒿素(Artemisinin)及其衍生物是治療瘧疾的常用藥物, 但是瘧原蟲也產(chǎn)生了抗藥性, 由于蟲體食物泡附近編碼Kelch13蛋白的基因發(fā)生點(diǎn)突變, 失活的蛋白減少了血紅蛋白的內(nèi)吞作用, 進(jìn)而減少了對(duì)青蒿素及其衍生物的激活, 導(dǎo)致瘧原蟲對(duì)青蒿素及其衍生物產(chǎn)生抗藥性[57]。

雞的球蟲病非常普遍和嚴(yán)重, 莫能菌素(Monensin)等聚醚類離子載體(Polyether ionophores)是常用藥物, 主要作用于孢子體(Sporozoites)和裂殖體(Merozoites)的細(xì)胞膜, 大量的陽離子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)使細(xì)胞內(nèi)外形成滲透壓差, 大量水分進(jìn)入蟲體, 最終導(dǎo)致蟲體膨脹破裂[15], 艾美球蟲(Eimeria tenella)對(duì)這類藥物產(chǎn)生了抗藥性, 但其復(fù)雜的抗藥性機(jī)制仍不清楚[58]。

寄生蠕蟲的抗藥性機(jī)制寄生線蟲的抗藥性機(jī)制是研究最多的。線蟲常用的殺蟲藥物有苯并咪唑類、大環(huán)內(nèi)酯類、左旋咪唑和噻嘧啶[13]。線蟲對(duì)苯并咪唑類藥物的抗藥性機(jī)制是蟲體β-微管蛋白基因點(diǎn)突變, 引起微管蛋白與藥物結(jié)合減少而導(dǎo)致抗藥性產(chǎn)生[59—61]。而線蟲對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類藥物的抗藥性則是由于Pgp基因點(diǎn)突變, 導(dǎo)致P糖蛋白上調(diào), 而引起藥物外排增加[62], 以及多種離子通道或受體改變, 如煙堿型乙酰膽堿受體、乙酰膽堿門控的氯離子通道、谷氨酸鹽門控的氯離子通道和γ-氨基丁酸門控的氯離子通道等, 從而減少藥物與作用靶點(diǎn)的結(jié)合[48]。

其次, 抗藥性研究較多的是人類的肝吸蟲(包括片吸蟲、華支睪吸蟲和后睪吸蟲等)和血吸蟲,吡喹酮和苯并咪唑類是扁形動(dòng)物寄生蟲的常用殺蟲藥物[63]。多種片吸蟲對(duì)三氯苯咪唑(Triclabendazole)都產(chǎn)生了抗藥性, 抗藥性機(jī)制包括P-糖蛋白增加藥物外排和谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶增加藥物代謝作用[11,64];在一些地區(qū), 血吸蟲對(duì)吡喹酮也產(chǎn)生了抗藥性, 主要通過點(diǎn)突變減少藥物與電壓門控的鈣離子通道β亞基(一種胞漿蛋白)的結(jié)合[65]。

絳蟲的抗藥性機(jī)制也有少量報(bào)道, 電壓門控的鈣離子通道同樣也是吡喹酮在豬肉絳蟲(Taenia solium)上的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)[66], 犬復(fù)孔絳蟲(Dipylidium caninum)在對(duì)吡喹酮出現(xiàn)明顯抗藥性后檢測(cè)到β亞基類似物的[67]。鈣離子通道β亞基的突變, 降低了吡喹酮與蟲體鈣離子通道的結(jié)合, 不會(huì)引起肌肉收縮和外皮出現(xiàn)空泡[38,39]。

甲殼類寄生蟲的抗藥性機(jī)制甲殼類和昆蟲都屬于節(jié)肢動(dòng)物, 昆蟲的殺蟲藥物也常用于甲殼類寄生蟲, 因此, 甲殼類寄生蟲的抗藥性機(jī)制與昆蟲的類似[18]。Heumann等[68]在鮭瘡痂魚虱克隆到一種新的P-糖蛋白基因SL-PGY1, 后被證實(shí)鮭瘡痂魚虱對(duì)甲維鹽的抗藥性是通過增加P糖蛋白表達(dá)量從而增加了藥物的外排[69]; 另外, 還在抗甲維鹽的魚虱檢測(cè)到乙酰膽堿受體和GABA-gated的氯離子通道的mRNA 轉(zhuǎn)錄水平顯著降低, 推測(cè)是因?yàn)辄c(diǎn)突變引起這兩類離子型受體表達(dá)量降低, 從而減少作用靶點(diǎn)與藥物結(jié)合[70]; 鮭瘡痂魚虱對(duì)甲基吡啶磷的抗藥性機(jī)制是乙酰膽堿酯酶基因(ace1a)上一個(gè)等位基因(362Tyr)突變而引起[71]; 它對(duì)擬除蟲菊酯類藥物的抗藥性機(jī)制則是單氧化酶介導(dǎo)的解毒作用增強(qiáng)[72]。

不管是陸生動(dòng)物的寄生蟲, 還是水生動(dòng)物的寄生蟲, 相同類群的寄生蟲產(chǎn)生的抗藥性機(jī)制應(yīng)該是相同或類似的。因此, 上述陸生動(dòng)物和人類的寄生蟲抗藥性研究可為水產(chǎn)養(yǎng)殖中原生動(dòng)物寄生蟲、寄生蠕蟲和甲殼類寄生蟲的抗藥性機(jī)制研究提供參考, 以及為新型殺蟲藥物開發(fā)提供靶標(biāo)。

3 抗藥性控制策略

抗藥性產(chǎn)生的遺傳機(jī)制是在藥物選擇壓力下蟲體發(fā)生基因突變, 因此, 若要減少抗藥性的產(chǎn)生,就必須從治療策略(Treatment strategies)和保護(hù)敏感蟲體種群兩方面來采取措施。合理的治療策略可以阻止和減少抗藥性產(chǎn)生, 保護(hù)敏感蟲體種群則可促進(jìn)抗藥性逆轉(zhuǎn)。

3.1 治療策略

在陸生系統(tǒng)中, 主要通過在時(shí)間和空間上改變化學(xué)藥物使用模式, 通過增加治療的異質(zhì)性來減少抗藥性產(chǎn)生, 這是因?yàn)槎喾N藥物聯(lián)用或交替使用可延緩某一種藥物帶來強(qiáng)大選擇壓力, 通常治療的異質(zhì)性越高, 抗藥性進(jìn)化越慢[10]。這些用藥策略主要包括以下四種: 響應(yīng)換藥(Responsive alternation),當(dāng)蟲體對(duì)一種藥物產(chǎn)生抗藥性后, 換用另一種藥物,這種策略一般在不易產(chǎn)生抗藥性的寄生蟲中使用;定期使用或輪換用藥(Periodic application, sequential use, rotation), 即兩種或多種藥物定期輪換使用,換藥時(shí)間可長(zhǎng)于蟲體世代, 也可短于世代; 錯(cuò)區(qū)用藥(Mosaic), 兩種或多種藥物同時(shí)在不同區(qū)域使用,即一個(gè)區(qū)域分別用一種不同的藥物; 聯(lián)用或混用(Combination, mixture), 兩種或多種藥物同時(shí)在一次治療中使用, 聯(lián)用藥物可以是全劑量, 也可是半劑量[10, 16]。

盡管聯(lián)合用藥比其他幾種用藥策略更優(yōu), 但在實(shí)際應(yīng)用中到底使用哪一種策略, 主要取決于治療對(duì)象, 在人類的瘧疾和農(nóng)作物害蟲防治中, 常采用聯(lián)合用藥策略, 但在細(xì)菌病的抗生素治療中, 特別是群體中, 聯(lián)用策略并不合適[10]。基于海虱病原模型, 模擬了7種用藥場(chǎng)景并同時(shí)檢測(cè)海虱種群產(chǎn)生抗藥性水平, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)聯(lián)合用藥是最有效的策略[16]。雞球蟲病的用藥策略是比較成熟的, 在某一生長(zhǎng)階段采用聯(lián)合用藥策略, 而在整個(gè)養(yǎng)殖過程中采用定期輪換用藥計(jì)劃[15]。

3.2 敏感蟲體種群保護(hù)

理論上講, 建立未用藥保護(hù)區(qū)或殘遺種保護(hù)區(qū)(Refugia), 保護(hù)部分敏感蟲體種群可增加敏感等位基因頻率, 延緩或逆轉(zhuǎn)抗藥性[73]。在家畜寄生線蟲的抗藥性管理中, 基于殘遺種保護(hù)區(qū)的控制策略就是進(jìn)行選擇性治療, 即只有一部分家畜種群用藥。但是很多因素會(huì)影響該策略的使用效果, 如保護(hù)區(qū)寄生蟲種群的抗藥性水平和遺傳多樣性、治療寄生蟲種群的比例和治療效果以及寄生蟲生長(zhǎng)、繁殖的生活史特征等[73]。

已經(jīng)產(chǎn)生的抗藥性一般難以逆轉(zhuǎn)。吸蟲和線蟲對(duì)苯并咪唑類藥物產(chǎn)生了抗藥性, 停止用藥后表型抗性仍能保持多年[74, 75]; 將具有甲維鹽抗性的海虱(Caligus rogercresseyi)在實(shí)驗(yàn)室連續(xù)養(yǎng)殖7代后,對(duì)甲維鹽的敏感性仍然沒有恢復(fù)[76]; 對(duì)有機(jī)磷和擬除蟲菊酯具有抗藥性的鮭瘡痂魚虱在第十代子代中也沒有發(fā)現(xiàn)抗藥性降低[18]。但是通過從保護(hù)區(qū)內(nèi)引入敏感種群來增加敏感等位基因頻率, 可恢復(fù)抗藥蟲體的敏感性或逆轉(zhuǎn)抗藥性[77,78]。

3.3 對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物寄生蟲抗藥性控制的啟示

從降低寄生蟲抗藥性產(chǎn)生的策略來分析, 抗藥性產(chǎn)生速度與養(yǎng)殖方式和寄生蟲種類密切相關(guān)。我國(guó)大部分是室外的池塘養(yǎng)殖, 而這種養(yǎng)殖方式通常只在生長(zhǎng)季節(jié)用藥, 藥物壓力是不持續(xù)的; 而且池塘一般呈現(xiàn)斑塊分布, 具有空間異質(zhì)性, 不同養(yǎng)殖區(qū)域的養(yǎng)殖品種不同, 用藥種類和時(shí)間也不同,可看作錯(cuò)區(qū)用藥策略; 另外, 大多數(shù)寄生蟲的宿主特異性不強(qiáng), 如原生動(dòng)物寄生蟲、甲殼類寄生蟲、復(fù)殖吸蟲和線蟲, 那么鄰近區(qū)域其他魚類上的相同寄生蟲可起到殘遺種保護(hù)區(qū)作用。因此, 我國(guó)池塘養(yǎng)殖模式中大多數(shù)魚類寄生蟲產(chǎn)生的抗藥性相對(duì)較慢。

從抗藥性產(chǎn)生的遺傳機(jī)制來看, 生活世代短、具有有性繁殖的寄生蟲更容易產(chǎn)生抗藥性[14]。單殖吸蟲不僅具有直接的生活史, 世代短, 有性生殖,且具有較強(qiáng)的宿主特異性[79], 因此, 單殖吸蟲可能是最容易產(chǎn)生抗藥性的寄生蟲類群之一。寄生于鰻鱺的擬指環(huán)蟲在低劑量甲苯咪唑的作用下, 經(jīng)過7個(gè)世代后開始出現(xiàn)明顯的抗藥性[80], 在短短的十年內(nèi), 甲苯咪唑?qū)W洲鰻鱺的指環(huán)蟲病幾乎沒有治療效果[17]; 在我國(guó)的鰻鱺養(yǎng)殖中, 也發(fā)現(xiàn)了擬指環(huán)蟲的抗藥性問題[81]。

不管是室外的池塘養(yǎng)殖和設(shè)施養(yǎng)殖, 還是室內(nèi)的循環(huán)水養(yǎng)殖, 高密度的集約化養(yǎng)殖是我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖的一種趨勢(shì), 針對(duì)頻頻發(fā)生的寄生蟲病使用藥物防治不可避免。根據(jù)陸生動(dòng)物寄生蟲抗藥性的控制策略, 首先要布局好養(yǎng)殖品種和養(yǎng)殖方式, 如多品種混養(yǎng), 不同品種的錯(cuò)區(qū)養(yǎng)殖; 其次是在用藥方式上, 不能長(zhǎng)期只用一種藥物, 要多種藥物聯(lián)用。

4 抗藥性的主要檢測(cè)方法

抗藥性蟲體表型特征變化是最直接的抗藥性識(shí)別方法。生物體在產(chǎn)生抗藥性過程中, 會(huì)消耗較高能量代價(jià), 或者產(chǎn)生一些不利因素來降低適合度,稱為適合度代價(jià)(Fitness costs), 如繁殖力降低、擴(kuò)散力削弱等種群生物學(xué)性狀的表型變化[82]。鑒定適合度代價(jià)在識(shí)別和限制抗藥蟲體種群的綜合管理中具有明顯優(yōu)勢(shì), 種群相對(duì)適合度的表征有兩種,即種群抗藥性基因突變頻率的變化, 以及抗藥性種群生物學(xué)性狀的變化[83]。這種抗藥性引起的適合度代價(jià)在昆蟲中比較常見[82], 在抗藥瘧原蟲中也存在[84,85], 但在抗甲維鹽魚虱的第四代子代中沒有發(fā)現(xiàn)適合度代價(jià)[86]。

4.1 生物測(cè)定法(Bioassays)

利用生物體對(duì)殺蟲藥物的反應(yīng)來定性或定量測(cè)定抗藥性強(qiáng)弱, 這些反應(yīng)包括死亡或停止運(yùn)動(dòng)等,衡量參數(shù)常用半致死濃度或90%致死濃度等, 這是傳統(tǒng)的抗藥性檢測(cè)方法。該方法的優(yōu)點(diǎn)是在抗藥性機(jī)制未知情況下仍然可以檢測(cè), 缺點(diǎn)是測(cè)試敏感性低, 在比較不同地區(qū)生物體的抗藥性水平時(shí)受到限制[18]。在鮭瘡痂魚虱的抗藥性測(cè)定中, 50%的有效濃度(EC50)的估計(jì)需要多個(gè)藥物濃度[87]; 因此, 后來又有人建立了一種基于劑量-殺蟲效果模型的單劑量快速測(cè)定方法[88]。

4.2 分子檢測(cè)法(Molecular assays)

在抗藥性機(jī)制已知情況下, 利用分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)殺蟲藥物作用靶標(biāo)的抗性點(diǎn)突變或解毒代謝酶基因的增強(qiáng)表達(dá), 其中基因突變檢測(cè)技術(shù)可應(yīng)用于檢測(cè)殺蟲藥物作用靶標(biāo)的基因突變, 而基因差異表達(dá)技術(shù)則應(yīng)用于檢測(cè)解毒代謝酶基因的增強(qiáng)表達(dá)[89]。有時(shí)候具體的抗藥性機(jī)制可通過抗性個(gè)體展示的表型特征進(jìn)行鑒別, 但通常情況下需要高通量測(cè)序, 并對(duì)大量的候選基因進(jìn)行功能鑒定[18]。

5 水產(chǎn)動(dòng)物寄生蟲抗藥性研究現(xiàn)狀

寄生原蟲、扁形動(dòng)物寄生蟲和甲殼類寄生蟲是水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物重要的寄生蟲類群。在寄生原蟲引起的寄生蟲病中, 小瓜蟲病危害最嚴(yán)重, 但由于缺少真正的有效藥物, 沒有一種藥物是長(zhǎng)期使用的,因此還沒有抗藥性的研究報(bào)道[90]。

在扁形動(dòng)物寄生蟲病中, 吡喹酮是常用藥物,盡管人類的血吸蟲、肝吸蟲和絳蟲都對(duì)該藥物產(chǎn)生了抗藥性, 但魚類寄生的絳蟲和復(fù)殖吸蟲仍然保持較高的敏感性, 可能是吡喹酮在水產(chǎn)中的使用時(shí)間較短, 而且也沒有反復(fù)使用[40]。在挪威的大西洋鮭養(yǎng)殖中, 吡喹酮常用于真溝絳蟲(Eubothriumspp.)的治療, 該絳蟲對(duì)吡喹酮已經(jīng)產(chǎn)生了抗藥性[91,92]。擬指環(huán)蟲是歐洲鰻鱺養(yǎng)殖中危害最嚴(yán)重的單殖吸蟲, 甲苯咪唑是最有效的藥物[93], 最開始1 mg/L的甲苯咪唑在24h內(nèi)可100%殺滅擬指環(huán)蟲[94,95], 由于循環(huán)水養(yǎng)殖模式和長(zhǎng)期只使用這一種殺蟲藥物, 甲苯咪唑的治療效果越來越差, 使用濃度每年要提高6—12倍, 而且已經(jīng)很難有效控制指環(huán)蟲病的發(fā)生[17]。

在甲殼類寄生蟲中, 海虱(L.salmonis,Caligusspp.)是影響大西洋鮭養(yǎng)殖最重要的寄生蟲, 盡管每個(gè)國(guó)家采取的防治方案不同, 但由于殺蟲藥物的長(zhǎng)期使用, 對(duì)海虱的治效果已明顯下降[18]。挪威從2014年開始對(duì)鮭瘡痂魚虱的抗藥性進(jìn)行監(jiān)測(cè), 發(fā)現(xiàn)對(duì)溴氰菊酯、甲基吡啶磷和甲維鹽一直保持較高的抗藥性, 對(duì)過氧化氫和淡水的耐受性也在增加[96]。2008年蘇格蘭報(bào)道鮭瘡痂魚虱對(duì)甲維鹽的敏感性降低了7倍[68]。加拿大在2010—2012年對(duì)22個(gè)大西洋鮭養(yǎng)殖場(chǎng)的調(diào)查中, 發(fā)現(xiàn)魚虱對(duì)甲維鹽敏感性降低[97]。在智利, 甲維鹽和溴氰菊酯對(duì)海虱(C.rogercresseyi)的治療效果也明顯降低[76,98]。

綜上所述, 單殖吸蟲和甲殼類寄生蟲的抗藥性都是在歐洲鰻鱺和大西洋鮭的集約化養(yǎng)殖中, 長(zhǎng)期反復(fù)使用殺蟲藥物而產(chǎn)生的。在我國(guó), 水產(chǎn)養(yǎng)殖歷史更悠久, 在一些常見、頻發(fā)的寄生蟲病防治中,藥物使用年限更長(zhǎng), 不規(guī)范用藥也更嚴(yán)重, 盡管抗藥性的研究報(bào)道較少, 但在一些水產(chǎn)養(yǎng)殖區(qū)域, 寄生蟲病的防治效果明顯變差, 殺蟲藥物的使用劑量越來越高, 這已經(jīng)成為擺在水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)面前的重要問題。而且隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖規(guī)模和集約化程度逐漸提高, 寄生蟲抗藥性問題將會(huì)更加嚴(yán)重和突出。

6 水產(chǎn)動(dòng)物寄生蟲抗藥性研究展望

陸生動(dòng)物寄生蟲和鮭鱒魚類寄生海虱的抗藥性研究提供了成功案例和經(jīng)驗(yàn), 但我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物寄生蟲的抗藥性研究幾乎還是空白。因此, 選擇合適的寄生蟲類群, 開展寄生蟲抗藥性研究, 是亟待開展的基礎(chǔ)研究工作。

我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物寄生蟲抗藥性可從以下幾個(gè)方面開展研究: (1)建立抗藥性生物檢測(cè)方法, 在重點(diǎn)養(yǎng)殖區(qū)域調(diào)查寄生蟲對(duì)藥物的敏感性, 看哪些寄生蟲類群產(chǎn)生了抗藥性。(2)針對(duì)抗藥寄生蟲, 通過對(duì)敏感和抗性蟲株進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序, 找出差異表達(dá)的候選基因, 再利用生物信息學(xué)分析、RNAi 技術(shù)或CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)鑒定出抗藥性基因, 闡明抗藥性分子機(jī)制[18]。(3)利用抗藥性基因,建立抗藥性的分子檢測(cè)方法, 對(duì)全國(guó)范圍內(nèi)主要水產(chǎn)養(yǎng)殖區(qū)進(jìn)行寄生蟲抗藥性普查。(4)研究寄生蟲抗藥性產(chǎn)生規(guī)律, 建立合理的藥物輪用和組合策略,以及殘遺種保護(hù)區(qū)等措施, 避免或減緩抗藥性產(chǎn)生。(5)將抗藥性基因作為抗藥性治療靶點(diǎn), 利用RNAi 技術(shù)抑制抗藥性基因的過量表達(dá)[48,99], 研發(fā)P-gp轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和解毒酶系的抑制劑[100]等, 以減少寄生蟲的抗藥性產(chǎn)生。

通過上述研究, 最終形成一個(gè)完整的寄生蟲抗藥性監(jiān)測(cè)和防治體系, 保證現(xiàn)有殺蟲藥物的有效性,保障水產(chǎn)養(yǎng)殖的綠色健康和可持續(xù)發(fā)展。