兩個奧利亞羅非魚品系對無乳鏈球菌的耐受性研究

李可心 祝璟琳, 李大宇 鄒芝英 肖 煒 喻 杰 陳炳霖 楊 弘*

(1.南京農業(yè)大學無錫漁業(yè)學院, 無錫 214128; 2.中國水產科學研究院淡水漁業(yè)研究中心,農業(yè)農村部淡水漁業(yè)和種質資源利用重點實驗室, 無錫 214081)

羅非魚(Oreochromisspp.)是熱帶和亞熱帶地區(qū)的世界性養(yǎng)殖魚類, 具有無肌間刺、生長快、繁殖能力強和適應性強等優(yōu)點[1]。中國羅非魚產量全球第一, 2020年達到165.54萬噸。隨著養(yǎng)殖密度的增加和養(yǎng)殖環(huán)境的惡化, 羅非魚病害逐漸增多, 其中由無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)引起的鏈球菌病已成為限制羅非魚產業(yè)可持續(xù)發(fā)展的最重要因素之一[2]。無乳鏈球菌, 也稱為B組鏈球菌(GBS), 引起魚類敗血癥、腦膜腦炎、突眼癥、厭食癥和腹水等癥狀[3]。目前在尖吻鱸(Lates calcarifer)[4], 亞馬遜鯰(Pseudoplatystomasp.)[5]、龍膽石斑(Epinephelus lanceolatus)[6,7]和金鯧(Trachinotus ovatus)[8]等病魚體內也分離出無乳鏈球菌。據報道, 鏈球菌病暴發(fā)引起了世界各地的羅非魚大規(guī)模死亡, 造成了重大經濟損失[9,10]。

抗病育種是通過定向選擇或改變某些基因型來培育對特定疾病產生較強抵抗力的動物新品種的方法。近幾年我國羅非魚養(yǎng)殖品種不斷更新換代, 培育出了“壯羅1號”羅非魚等新品種, 在同等養(yǎng)殖條件下, “壯羅1號” 羅非魚抗無乳鏈球菌感染能力比吉富羅非魚(Oreochromis niloticusGIFT strain)強, 養(yǎng)殖成活率比吉富羅非魚高15.2%—21.4%[11]。羅非魚養(yǎng)殖品系較多, 不同品系間抗病力差異較大,不同學者探討了不同遺傳背景的羅非魚與其抵抗無乳鏈球菌能力的相關性。Huang等[12]研究發(fā)現奧尼羅非魚 (O.niloticus♀×O.aureus♂)比“新吉富”羅非魚(NEW GIFT tilapia,O.niloticus♀×O.niloticus♂)和吉奧羅非魚(NEW GIFT tilapia ♀×O.aureus♂)對無乳鏈球菌的抵抗力更強, 抗病力與某些天然免疫參數有關, 如溶菌酶活性、NBT活性和特異性抗體水平。強俊等[13]研究發(fā)現吉富羅非魚與奧利亞羅非魚雜交后代對海豚鏈球菌(Streptococcus iniae)的抗病力明顯高于吉富羅非魚自繁組F1代, 相同攻毒條件下奧利亞羅非魚自繁組F1代死亡率最低, 奧利亞羅非魚較強的抗病性能可能有助于提高雜交子代的抗病力。有文獻認為不同品系羅非魚抗病力和耐受性差異是先天免疫和后天免疫協同作用的結果[12]。我們前期研究發(fā)現雜交育種能提高魚體抗病力, 奧利亞羅非魚抗鏈球菌病能力介于奧尼羅非魚和尼羅羅非魚之間[14]。與其他羅非魚品系相比, 奧利亞羅非魚在耐寒、耐鹽等抗逆性方面也有顯著優(yōu)勢[15,16], 已被廣泛用作奧尼雜交羅非魚的親本。研究發(fā)現尼羅羅非魚對無乳鏈球菌和海豚鏈球菌的抗性存在加性遺傳變異, 表明通過人工選擇提高對鏈球菌病暴發(fā)的存活率是可能的[17,18]。因此, 通過選育親本來提高雜交子代的抗病性能是可行的, 本研究以奧利亞羅非魚“夏奧1號”和埃及品系為研究材料, 檢測它們感染無乳鏈球菌后存活率, 血清中生化指標和脾臟促炎性細胞因子表達變化差異, 初步篩選出抗病力和耐受性強的品系, 為培育抗鏈球菌病的奧尼羅非魚提供抗性的親本種質資源。

1 材料與方法

1.1 實驗用魚

本實驗所用魚均來自國家特色淡水魚產業(yè)技術體系羅非魚種質資源和品種改良崗位的保種基地, 其中奧利亞羅非魚“夏奧1號”(簡寫為AX品系)為1983年從美國引進的奧利亞羅非魚群體基礎上十代連續(xù)群體選育獲得的新品種(品種登記號GS-01-002-2006), 奧利亞羅非魚埃及品系(簡寫為AE品系)為1999年從埃及農業(yè)部農業(yè)和農墾部水產研究中心實驗室引進的奧利亞羅非魚, 其卵子在鱖精子異源刺激后, 經雌核發(fā)育和群體選育培育而成的新品系。每種羅非魚隨機取150尾進行強化培育,每天投喂1次羅非魚專用膨化飼料, 投喂量為魚體重的3%—8%。在培育結束后將羅非魚拉回實驗室在循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)32℃暫養(yǎng)14d, 此時AX奧利亞羅非魚體重(145±40) g, AE奧利亞羅非魚體重(130±35) g。病原菌用無乳鏈球菌GX1101在中國典型微生物保藏中心編號為 CCTCC NO: M 2020547, 保存在本實驗室-80℃冰箱, 經復壯后使用。在整個實驗期間保持水溫(33±1)℃, 感染實驗在加熱棒控溫的獨立養(yǎng)殖桶中進行。

1.2 實驗方法

實驗設計感染實驗①: 對強化培育結束后的兩種奧利亞羅非魚分別注射1.3×107cfu/mL無乳鏈球菌, 評估兩種奧利亞羅非魚對無乳鏈球菌的抗病力。菌濃度經預實驗確定, 高于半致死濃度。每種羅非魚設置3個平行組, 每個平行組10尾魚, 每尾魚腹腔注射無乳鏈球菌0.2 mL。人工感染后進行為期7d的觀察, 統(tǒng)計7d內存活率, 繪制Kaplan-Meier生存曲線。感染無乳鏈球菌期間羅非魚禁食。

感染實驗②: 兩種奧利亞羅非魚各取120尾, 分4組暫養(yǎng)在160 L水族箱中7d, 后進行人工感染實驗。其中3組羅非魚每尾魚腹腔注射0.2 mL的無乳鏈球菌, 為保證在感染后有足夠存活數量的羅非魚進行血液和組織樣品的采集, 菌液注射濃度低于預實驗確定的半致死濃度, 最終菌液濃度確定為2.2×106cfu/mL; 剩余1組腹腔注射等量的無菌生理鹽水, 用于分析血清生化指標和脾臟促炎性細胞因子的表達變化, 評估兩種奧利亞羅非魚對無乳鏈球菌的耐受性。

樣品采集感染實驗②中生理鹽水腹腔注射后, 在無乳鏈球菌腹腔注射后7h、24h、48h、72h、120h和168h每種奧利亞羅非魚隨機取6尾魚進行血液和脾臟的采集。采用尾靜脈取血法, 將抽取的血液收集到1.5 mL離心管, 室溫靜置2—4h后,以4000 r/min, 4℃的條件離心10min, 抽取上層血清于新的1.5 mL離心管中, -20℃保存待用。另外取羅非魚新鮮抗凝血液100 μL用于測定呼吸暴發(fā)強度。無菌操作采集脾臟, 放入加有1 mL TRIzol的凍存管中, 液氮速凍后保存在-80℃冰箱, 直至分析。

羅非魚血清生化指標測定通過日立7600全自動生化分析儀測定血液的血清生化指標, 谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、總蛋白(TP)、球蛋白(GLO)、葡萄糖(GLU)、乳酸脫氫酶(LDH)、甘油三酯 (TG)和膽固醇(TC), 試劑盒從日本和光純藥工業(yè)株式會社采購; 堿性磷酸酶(AKP)試劑盒從四川邁克生物科技股份有限公司采購; 超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒從寧波美康生物科技有限公司采購。溶菌酶(LZM)活力按照南京建成生物工程研究所的溶菌酶試劑盒說明書方法測定。血液呼吸暴發(fā)采用NBT(硝基四氮唑藍)還原法[12]測定。

總RNA的提取和cDNA合成將保存在-80℃冰箱中的脾臟樣品取出, 放入Sceintz-48型高通量組織研磨機(寧波新芝生物科技股份有限公司)中研磨勻漿。用TRIzol法提取總RNA。用Nanodrop超微量紫外分光光度計(Thermo公司)測定提取的總RNA的濃度及純度, 并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。通過 PrimeScriptTMRT反轉錄試劑盒(TaKaRa公司)合成cDNA, -20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

實時熒光定量PCR分析促炎性細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6和內參基因β-actin的基因序列見表1, 在7900HT Fast Real Time PCR儀(ABI公司)上進行qRT-PCR測定基因的表達量。20 μL反應體系為: SYBR Green Realtime PCR Master Mix (Toyobo公司) 10 μL, cDNA模板 1 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL, 無RNA水7.4 μL; PCR擴增程序: 95℃5min; 95℃ 15s, 60℃ 1min, 40個循環(huán)。用2-ΔΔCt法計算不同時間點TNF-α、IL-1β和IL-6的相對表達量。

表1 本研究所用引物序列Tab.1 Primer sequence used in the study

1.3 統(tǒng)計分析

利用GraphPad Prism 9.0軟件進行圖表制作, 使用SPSS 25.0 和Microsoft Excel 2016 軟件進行數據的統(tǒng)計分析。使用Log-rank檢驗兩種奧利亞羅非魚人工感染后生存曲線的差異, 并用P值顯示兩種奧利亞羅非魚生存曲線的差異顯著性。方差齊性通過Levene’s 檢驗后, 采用One-way ANOVA進行單因素方差分析, Duncan’s多重比較差異顯著性, 顯著性水平為0.05。血清生化指標以平均值±標準差(±SD)表示, 定量數據以平均值±標準誤(±SE)表示。

2 結果

2.1 兩種奧利亞羅非魚感染無乳鏈球菌后生存曲線

由圖1可知, 在人工感染無乳鏈球菌后, 奧利亞羅非魚AE品系羅非魚在感染后7d內的存活率為30%, AX品系在感染后7d內的存活率為10%。AE品系在感染后各時間點生存曲線一直高于AX品系,Log-rank檢驗后顯示P=0.0477, 有顯著性差異。

圖1 兩種奧利亞羅非魚感染無乳鏈球菌后的生存曲線Fig.1 Kaplan-Meier survival curve for two blue tilapia species in the S.agalactiae challenge test

2.2 兩種奧利亞羅非魚感染無乳鏈球菌后血液生化指標變化

兩種奧利亞羅非魚在感染后ALT活性都呈現升高趨勢, 在感染后168h達到最大值。AE奧利亞羅非魚在感染后7h顯著升高(P＜0.05), AX奧利亞羅非魚在感染后24h顯著升高(P＜0.05)。感染前兩種奧利亞羅非魚ALT活性沒有顯著性差異(P＞0.05),在感染后7—168h, AE奧利亞羅非魚的血清ALT活性顯著高于AX奧利亞羅非魚(P＜0.05; 圖2a)。兩種奧利亞羅非魚在感染后血清AST活性都顯著性升高(P＜0.05), 呈先上升后下降再上升的趨勢, 且都在感染后48h達到最大值。在感染前、感染后7h和72h, AE奧利亞羅非魚的血清AST活性顯著高于AX奧利亞羅非魚(P＜0.05; 圖2b)。

圖2 兩種奧利亞羅非魚感染無乳鏈球菌后血清谷丙轉氨酶(a)和谷草轉氨酶(b)含量變化Fig.2 Changes of serum alanine aminotransferase (a) and aspartate aminotransferase (b) in two blue tilapia species infected with S.agalactiae

兩種奧利亞羅非魚感染后血清白蛋白與球蛋白比值(A/G)均呈現下降趨勢, AE奧利亞羅非魚在感染后7h血清A/G比值顯著降低(P＜0.05), 而AX奧利亞羅非魚在感染后24h血清A/G比值顯著下降(P＜0.05)。AE奧利亞羅非魚血清在感染前和感染后7h 的A/G比值和AX奧利亞羅非魚沒有顯著性差異, 在感染后24h和48h顯著低于AX奧利亞羅非魚(P＜0.05)。AE奧利亞羅非魚的血清A/G比值始終低于AX奧利亞羅非魚(圖3a)。

圖3 兩種奧利亞羅非魚感染無乳鏈球菌后血清白蛋白/球蛋白(a)和球蛋白(b)含量變化Fig.3 Changes of serum albumin/globulin (a) and globulin (b) contents in two blue tilapia species infected with S.agalactiae

兩種奧利亞羅非魚在感染前血清GLO無顯著性差異(P＞0.0 5), 在感染后4 8 h 顯著性升高(P＜0.05)。在感染后7h和168h, AE奧利亞羅非魚的血清GLO含量顯著高于AX奧利亞羅非魚(圖3b)。

兩種奧利亞羅非魚感染無乳鏈球菌后血清AKP活性先升高后降低, 在感染后72h達峰。AE奧利亞羅非魚的血清AKP活性在感染前和感染后7h顯著高于AX奧利亞羅非魚(P＜0.05; 圖4a)。

圖4 兩種奧利亞羅非魚感染無乳鏈球菌后血清堿性磷酸酶(a)和超氧化物歧化酶(b)含量變化Fig.4 Changes of serum alkaline phosphatase (a) and superoxide dismutase (b) contents in two blue tilapia species infected with S.agalactiae

兩種奧利亞羅非魚感染無乳鏈球菌后血清SOD活性先升高后降低, 在感染后48h達峰, AX奧利亞羅非魚在感染后72h就恢復到感染前水平,AE奧利亞羅非魚在感染后168h恢復到感染前水平。兩種奧利亞羅非魚的血清SOD水平在感染前和感染后7h沒有顯著性差異(P＞0.05), AE奧利亞羅非魚的血清SOD水平在感染后24h、120h和168h顯著高于AX奧利亞羅非魚(P＜0.05; 圖4b)。

AE奧利亞羅非魚在感染后7h血清GLU含量顯著升高并達峰, 之后逐漸降低; AX奧利亞羅非魚在感染后GLU含量呈下降趨勢。感染前AE奧利亞羅非魚的GLU含量顯著低AX奧利亞羅非魚(P＜0.05),感染后兩種羅非魚的GLU含量沒有顯著性差異(P＞0.05; 圖5a)。

圖5 兩種奧利亞羅非魚感染無乳鏈球菌后血清葡萄糖(a)和乳酸脫氫酶(b)含量變化Fig.5 Changes of serum glucose (a) and lactate dehydrogenase (b) contents in two blue tilapia species infected with S.agalactiae

兩種奧利亞羅非魚感染后血清LDH活性先升高后降低, 在感染后7h顯著升高(P＜0.05), 并都在感染后48h達峰; AE奧利亞羅非魚在感染后120h恢復到感染前水平, AX奧利亞羅非魚在感染后168h恢復到感染前水平。AE奧利亞羅非魚在感染后7—72h LDH活性顯著高于AX奧利亞羅非魚(P＜0.05),在感染前、感染后120h和168h兩種奧利亞羅非魚的LDH活性沒有顯著差異(P＞0.05; 圖5b)。

AE奧利亞羅非魚感染后血清TC含量在感染后7h顯著降低(P＜0.05); AX奧利亞羅非魚則先升高后降低再升高, 在感染后48h恢復到感染前水平。AE奧利亞羅非魚在感染后24h TC含量顯著低于AX奧利亞羅非魚(P＜0.05; 圖6a)。

圖6 兩種奧利亞羅非魚感染無乳鏈球菌后血清膽固醇(a)和甘油三酯(b)含量變化Fig.6 Changes of serum cholesterol (a) and triglyceride (b) contents in two blue tilapia species infected with S.agalactiae

兩種奧利亞羅非魚感染后血清TG含量先降低后升高, AE奧利亞羅非魚在感染后24h最低, AX奧利亞羅非魚在感染后48h最低, 感染后168h時AX奧利亞羅非魚恢復到感染前水平。AE奧利亞羅非魚在感染后24h的TG含量顯著低于AX奧利亞羅非魚(P＜0.05; 圖6b)。

兩種奧利亞羅非魚感染后血清LZM都升高后降低, AE奧利亞羅非魚在感染后7h顯著升高(P＜0.05), 在感染后120h恢復至感染前水平; AX奧利亞羅非魚在感染后LZM始終顯著高于感染前水平(P＜0.05)。AE奧利亞羅非魚在感染前和感染后7h的LZM顯著高于AX奧利亞羅非魚(P＜0.05), 而在感染后72—120h顯著低于AX奧利亞羅非魚(P＜0.05; 圖7a)。

圖7 兩種奧利亞羅非魚感染無乳鏈球菌后血清溶菌酶活性(a)和呼吸暴發(fā)(b)變化Fig.7 Changes of serum lysozyme activity (a) and respiratory burst (b) contents in two blue tilapia species infected with S.agalactiae

兩種羅非魚的呼吸暴發(fā)程度在感染后7h顯著性下降(P＜0.05)。感染后兩種奧利亞羅非魚呼吸暴發(fā)都顯著降低(P＜0.05); AE奧利亞羅非魚在感染前和感染后24h呼吸暴發(fā)強度顯著高于AX奧利亞羅非魚(P＜0.05), 在其他時間點則沒有顯著性差異(P＞0.05; 圖7b)。

2.3 兩種奧利亞羅非魚感染無乳鏈球菌后脾臟促炎性細胞因子表達變化

兩種奧利亞羅非魚感染無乳鏈球菌后脾臟TNF-α表達顯著升高(P＜0.05), 在感染后7h達峰, 之后顯著性下降(P＜0.05), 但在感染后168h都顯著高于感染前水平; AE奧利亞羅非魚的脾臟TNF-α表達在感染前和感染后120h都顯著低于AX奧利亞羅非魚(P＜0.05), 在其他時間點沒有顯著性差異(P＞0.05;圖8a)。

圖8 兩種奧利亞羅非魚感染無乳鏈球菌后脾臟中TNF-α (a)、IL-1β (b)和IL-6 (c)相對表達量變化Fig.8 Changes of relative expression of TNF-α (a), IL-1β (b) and IL-6 (c) in two blue tilapia species infected with S.agalactiae

兩種奧利亞羅非魚在感染后脾臟IL-1β表達先升高后降低, AE奧利亞羅非魚IL-1β表達在感染后48h達峰, 之后顯著性下降(P＜0.05), 在感染后168h恢復到感染前水平; AX奧利亞羅非魚IL-1β表達在感染后72h達峰, 在感染后168h仍顯著高于感染前水平(P＜0.05)。AE奧利亞羅非魚在感染后7h、72—168h這些時間點IL-1β表達都顯著低于AX奧利亞羅非魚(P＜0.05; 圖8b)。

兩種奧利亞羅非魚在感染后IL-6表達先升高后降低, 在感染后7h達到峰值, AE奧利亞羅非魚在感染后48h恢復到感染前水平; AE奧利亞羅非魚在感染前和感染后48—168h的IL-6表達顯著低于AX奧利亞羅非魚(P＜0.05), 而在感染后24h顯著高于AX奧利亞羅非魚(P＜0.05; 圖8c)。

3 討論

3.1 兩種奧利亞羅非魚人工感染無乳鏈球菌后存活率分析

鏈球菌病是羅非魚產業(yè)影響最大的細菌性疾病, 病原菌主要是無乳鏈球菌, 發(fā)病時間集中在每年的6—10月, 病程短, 死亡率高。統(tǒng)計感染后的存活率能夠初步說明魚體的抗病能力的差異和免疫強弱[19]。目前對鏈球菌病的防治主要依賴抗生素,但抗生素的有效性只在病情暴發(fā)的早期應用時才能發(fā)揮作用[20]。除了抗生素外, 生態(tài)防治方法包括益生菌、魚蝦混養(yǎng)和魚菜(藥)共生等方式。此外,免疫防治是控制鏈球菌病的重要方法和未來趨勢,已經研發(fā)出不同類型的疫苗, 但距離批文和產業(yè)化應用還有一定的距離。因此, 提高羅非魚內在抗病能力, 篩選和培育抗病品種(系)是防控鏈球菌病的根本辦法。水溫32℃以上羅非魚鏈球菌病容易暴發(fā), 提高魚體的抗病力能顯著降低感染病原菌后的死亡率[18,21,22]。抗病力(Disease resistance)是宿主通過預防感染或抑制宿主內病原體復制來限制其宿主內病原體載量的能力[23], 簡單來說就是宿主及其免疫系統(tǒng)如何對外來病原體負荷做出反應。水產養(yǎng)殖中將抗病力定義為疾病暴發(fā)期間或人工感染期間個體的存活率(和/或死亡率)[24]。本研究顯示奧利亞羅非魚AE品系在無乳鏈球菌脅迫下生存曲線一直高于AX品系, 表明AE奧利亞羅非魚對無乳鏈球菌的抗病力強于AX奧利亞羅非魚。

雜交是防止品種退化及創(chuàng)制優(yōu)良品種的有效方法, 其中遠緣雜交是指種間或種間以上親緣關系較遠的兩個物種之間的雜交[25]。奧利亞羅非魚屬鱸形目、鱺魚科, 鱖屬鱸形目、鮨科。母本奧利亞羅非魚和父本鱖的遠緣雜交可獲得能正常發(fā)育的雜交子代, 人工授精到魚苗階段的成活率為0.3%—0.5%[26,27]。雜交子代與奧利亞羅非魚在形態(tài)學上沒有顯著差異[26], 與母本奧利亞羅非魚有85.8%的遺傳相似性, 但與父本鱖卻只有4.9%的遺傳相似性[27]。染色體核型分析表明, 子代與奧利亞羅非魚的核型相似, 染色體數目均為2n=44, 而鱖為2n=48[28]。只有鱖染色體整套丟失而奧利亞羅非魚染色體得到自然加倍的個體才可以得到存活[29]。一般認為, 由于種間生殖隔離的存在, 遠緣雜交難以形成可育品系[25]。而本研究中的AE奧利亞羅非魚為1999年從埃及農業(yè)部農業(yè)和農墾部水產研究中心實驗室引進的奧利亞羅非魚, 與鱖進行遠緣雜交, 獲得的雜交后代可育可自繁, 歷經6個世代的群體選育形成新品系。形態(tài)學、遺傳標記和染色體核型等方面表明, 它們可能為異精雌核發(fā)育的奧利亞羅非魚,鱖精子在受精卵的發(fā)育過程中主要起刺激作用[26—29]。本研究中的AX奧利亞羅非魚為1983年從美國奧本大學引進的奧利亞羅非魚經群體選育形成的新品種, 而AE奧利亞羅非魚可能因為融合了部分來自父本鱖的遺傳物質, 從而提高了抗病力。類似的,新品種異育銀鯽“中科 5號”利用銀鯽獨特的異精雌核生殖, 篩選獲得整入團頭魴父本遺傳信息, 從而比異育銀鯽“中科3號”抗病能力更強[30]。

在無乳鏈球菌入侵羅非魚后, 激活宿主免疫系統(tǒng), 觸發(fā)魚體對感染的抵抗力。抗病力的重點是通過殺死入侵的病原菌來保護宿主, 而疾病耐受性(Disease tolerance)是針對感染進化的保守防御策略,其不對宿主病原體負荷產生直接的負面影響[31], 它依賴于組織損傷控制, 降低宿主對病原體或針對病原體的免疫反應造成的組織損傷[32], 簡而言之就是宿主如何修復病原體或激活的免疫系統(tǒng)造成的損害。維持血液等各種生理系統(tǒng)平衡的機制有助于宿主對感染的耐受, 當組織損傷的程度或宿主生理學的改變超過了耐受機制的能力時, 就會出現感染的病理結果; 相反, 較強的耐受性有助于減少發(fā)病率和死亡率[32]。

3.2 兩種奧利亞羅非魚感染無乳鏈球菌后血液生化指標變化分析

血液學檢查是評估魚類生理狀態(tài)和健康的常用方法之一[33], 當羅非魚受無乳鏈球菌感染后, 組織或器官受到損害, 可以在血清酶學指標上反映出來。谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶是評價肝臟是否受損的重要指標[34]。肝臟急性損傷或壞死性病變導致血清 ALT 和 AST 水平顯著升高, 具有重要的魚病診斷意義[35—37]。在本研究中, 兩種奧利亞羅非魚的血清ALT和AST活性在感染后都出現了顯著性升高, 且在感染后7—168h, AE品系的血清ALT活性顯著高于AX品系; 感染后7h和72h, AE品系的AST活性顯著高于AX品系, 說明奧利亞羅非魚感染無乳鏈球菌后肝臟都受到了損傷, 且AE品系的肝臟受損可能更嚴重。

血清總蛋白包括白蛋白和球蛋白, 具有維持血管滲透壓和酸堿度, 參與代謝產物的運輸和機體免疫等生理功能[38]。白蛋白/球蛋白(A/G)比值一定程度上可以反映機體的免疫情況和肝臟的功能狀況[39]。在本研究中兩種奧利亞羅非魚感染后A/G均顯著下降, 大黃魚(Pseudosciaena crocea)感染哈維氏弧菌(Vibrio harveyi)后A/G比值也呈下降趨勢[40]。球蛋白與機體免疫力息息相關, 當機體受到細菌、病毒等抗原侵襲時, 血清球蛋白水平會增加, 通常被認為與魚類更強的先天免疫反應有關[41]。本研究中兩種奧利亞羅非魚球蛋白在感染后48h都顯著上升,說明兩種奧利亞羅非魚都及時產生了免疫球蛋白來對抗無乳鏈球菌的感染; 而AE品系的血清球蛋白在感染后7h和168h顯著高于AX品系, 表明AE品系在感染初期和后期對無乳鏈球菌有更大的耐受性。

堿性磷酸酶是一種參與代謝調控的非特異性磷酸水解酶, 與物質的跨膜轉運、蛋白質合成、機體的非特異性免疫等密切相關[42]。Du等[34]研究表明尼羅羅非魚在無乳鏈球菌感染后血清中AKP活性先升高后降低再升高。本研究中兩種羅非魚血清中AKP活性在感染后先升高, 但隨著感染時間的延長, AKP活性降低。有報道表明這可能與隨著病程發(fā)展魚體貧血有關[43]。超氧化物歧化酶(SOD)是魚類體內一種關鍵的抗氧化酶, 具有消除活性氧的毒性、參與由病毒或細菌引起的免疫反應、平衡氧化與抗氧化等方面的作用[44]。之前研究表明奧利亞、吉富和奧尼羅非魚感染無乳鏈球菌48h時SOD都顯著升高[19]。類似的, 本研究中兩種奧利亞羅非魚在感染無乳鏈球菌后48h都升高至峰值; 但AE品系的血清SOD水平在感染后期顯著高于AX品系, 說明AE品系在感染后期的抗氧化能力更強。

血糖濃度是魚類重要的應激指標[45]。作為增強寄主抗性的一種策略, 宿主生物代謝受到調節(jié),以剝奪病原菌生存所需的底物[46]。葡萄糖是許多病原菌的主要碳源, 研究表明, 調節(jié)宿主葡萄糖代謝的應激反應可以控制組織損傷, 并建立對細菌感染的疾病耐受性[47]。花鱸(Lateolabrax maculatus)感染哈維氏弧菌后12h 血糖急劇下降, 在感染后24—72h隨時間顯著升高[37]。Zeng等[48]研究表明葡萄糖增強羅非魚對遲緩愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)感染的抵抗力。本研究中AE品系感染后血清GLU先上升后下降; AX品系感染后GLU顯著下降。血糖水平降低, 最有可能旨在限制病原菌對葡萄糖的利用[46,49]; 而AE品系可能糖原動員能力更強, 升高的血糖增強了魚體對無乳鏈球菌的耐受性。血清LDH活性增高是病魚肌肉受損的表征[50]。感染無乳鏈球菌后埃及尼羅、吉富和奧尼羅非魚血清中LDH活性先升高后降低, 在感染后48h達峰[19]。本研究中兩種奧利亞羅非魚在感染后血清LDH活性變化趨勢與之相同, 與之不同的是本次實驗觀察時間更長, 在感染后168h都已恢復到感染前水平。LDH活性的變化趨勢提示, 在感染無乳鏈球菌魚體初期即有肌肉損傷, 但隨著時間的推移逐漸恢復正常。

膽固醇是細胞膜的主要結構成分, 此外, 魚類血漿膽固醇與抗病性高度相關, 是魚類健康的重要指標, 因為它與細菌感染后的死亡率顯著相關[51]。同時, 膽固醇是皮質醇等一些類固醇激素的前體,而甘油三酯是體細胞的主要能量來源, 也作為肝功能指標[14,52]。生物絮體和海水中褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)感染遲緩愛德華氏菌后TC顯著降低,表明是由于遲緩愛德華氏菌感染導致抗病性降低[45]。3種正交子一代奧尼羅非魚感染在感染無乳鏈球菌后3d TC和TG都顯著下降[53]。這與本研究結果類似, 說明兩種奧利亞羅非魚感染無乳鏈球菌后抗病力下降, 引起魚體營養(yǎng)不良、脂代謝和肝功能障礙。

溶菌酶是一種非特異性免疫抗菌酶, 具有抵抗魚類病原菌的活性。史氏鱘(Aclpenser Schrenckii)感染嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)后血清、肝臟和黏液中LZM活力出現不同程度升高[54]。有研究表明LZM可作為羅非魚抗病品系的選育指標, 與抗鏈球菌病能力正相關[19]。同樣, 具有較高溶菌酶活性的虹鱒(Oncorhynchus mykiss)對殺鮭氣單胞菌(Aeromonas salmonicida)[55]、鯉(Cyprinus Carpio)對嗜水氣單胞菌感染表現出更強的抵抗力[56]。本研究發(fā)現兩種品系在感染后7h的血清LZM活力都有顯著升高。AE品系的LZM在感染前和感染后7h顯著高于AX品系, 提示AE品系可能抗病力更強。呼吸暴發(fā)是一種重要的防御機制, 通過在生物體內產生有毒的超氧陰離子(O2-)來幫助對抗病原菌[57]。海鱸(Dicentrarchus labrax)感染鰻弧菌(Vibrio anguillarum)后導致呼吸暴發(fā)強烈抑制[58]。有研究表明, 抗無乳鏈球菌或嗜水氣單胞菌的魚類比易感魚類表現出更高的呼吸暴發(fā)活性[12,59]。本研究中兩種品系呼吸暴發(fā)感染后都受到抑制, AE品系的呼吸暴發(fā)強度在感染前和感染后24h顯著高于AX品系, 表明AE品系比AX品系更不容易感染無乳鏈球菌。

3.3 兩種奧利亞羅非魚脾臟促炎性細胞因子表達差異分析

疾病耐受性和對感染的抵抗力與疾病的發(fā)展有關, 脾臟是羅非魚抵抗無乳鏈球菌感染的主要靶器官, 對于細菌抗原呈遞和啟動適應性免疫應答非常重要[60]。宿主免疫反應, 如促炎細胞因子, 出現在受體和信號級聯之前, 在宿主防御中起著關鍵作用, 最先分泌的促炎細胞因子主要有TNF-α、IL-1β和IL-6[61]。He等[62]發(fā)現尼羅羅非魚在接種無乳鏈球菌后,TNF-α和IL-1β的表達顯著增加。本研究中兩種品系羅非魚的脾臟TNF-α、IL-1β和IL-6在感染后7h都顯著升高, 說明當病原菌入侵后兩種羅非魚都快速產生了免疫應答。IL-6是一種多效性細胞因子, 參與尼羅羅非魚對細菌感染的應答并促進抗體的產生[63]。Costa等[64]提出IL-6能夠被其他免疫因子誘導表達, 并誘導抗菌肽生成, 防止機體自我損傷。炎癥是通過促炎性細胞因子和抗炎因子之間的平衡來調節(jié)的[65], 炎癥過度可能造成機體損傷[66]。AE品系在感染后24hIL-6顯著高于AX品系,但感染后48—168h卻低于AX品系;TNF-α在感染后120h顯著低于AX品系;IL-1β在感染后72—168h顯著低于AX品系, 促炎因子表達低提示炎癥程度更輕, 表明AE品系在感染前期快速誘導炎癥殺死病原, 但在感染后期炎癥更輕, 從而保持對無乳鏈球菌更大的耐受性。

4 結論

長期以來, 普遍的觀點認為, 遏制、殺死或驅逐入侵病原菌的免疫驅動抵抗機制是對抗傳染病的主要防御策略。然而, 疾病耐受性是一種同樣重要的宿主防御感染策略, 它不會對病原菌產生直接的負面影響, 同時在功能上與免疫驅動的抵抗機制相互作用, 以限制傳染病的嚴重程度[47,67]。本研究比較了奧利亞羅非魚AE品系和AX品系對無乳鏈球菌的抗病力差異, 血清生化指標和脾臟中促炎性細胞因子表達變化。結果發(fā)現人工感染后7d內AE奧利亞羅非魚生存率顯著高于AX奧利亞羅非魚。感染后兩種奧利亞羅非魚血清中的ALT、AST、GLO、AKP、SOD和LZM顯著升高; A/G、TG顯著下降, 呼吸暴發(fā)抑制; 且AE品系的血清球蛋白和SOD水平在感染后期顯著高于AX品系。定量PCR結果顯示兩種奧利亞羅非魚脾臟TNF-α、IL-1β和IL-6表達在感染后7h都顯著升高, 但AE品系在感染后期3種促炎性細胞因子的表達都顯著低于AX品系。研究表明AE品系對無乳鏈球菌的抗病力強于AX品系, 在感染后期的抗氧化能力更強, 炎癥程度更輕, 從而保持對無乳鏈球菌更大的耐受性。本研究初步篩選出抗病力和耐受性強的奧利亞羅非魚品系, 為培育抗鏈球菌病的奧尼羅非魚提供抗性的親本種質資源。